Kombinerad mekanisk och enzymatisk dissociation av mushjärnans hippocampala vävnad

Summary

Detta neurala celldissociationsprotokoll är avsett för prover med en låg mängd utgångsmaterial och ger en mycket livskraftig encellssuspension för nedströms analys, med valfria fixerings- och färgningssteg.

Abstract

Detta neurala dissociationsprotokoll (en anpassning av protokollet som åtföljer ett kommersiellt dissociationspaket för vuxna hjärnor) optimerar vävnadsbehandling som förberedelse för detaljerad nedströmsanalys såsom flödescytometri eller encellssekvensering. Neural dissociation kan utföras via mekanisk dissociation (såsom användning av filter, huggningstekniker eller pipetttriturering), enzymatisk matsmältning eller en kombination av dessa. Den känsliga naturen hos neuronala celler kan komplicera ansträngningarna för att erhålla den mycket livskraftiga, sanna encellssuspensionen med minimalt cellulärt skräp som krävs för encellsanalys. Data visar att denna kombination av automatiserad mekanisk dissociation och enzymatisk matsmältning konsekvent ger en mycket livskraftig (>90%) encellssuspension, vilket övervinner de ovan nämnda svårigheterna. Medan några av stegen kräver manuell fingerfärdighet, minskar dessa steg provhantering och potentiell cellförlust. Detta manuskript beskriver varje steg i processen för att utrusta andra laboratorier för att framgångsrikt dissociera små mängder neural vävnad som förberedelse för nedströms analys.

Introduction

Hippocampus beskrevs först av en bolognesisk anatom, Giulio Cesare Aranzio, på 1500-talet¹. Vid namngivningen av denna nyfunna struktur inspirerades Aranzio troligen av dess kusliga likhet med sjöhästen i släktet Hippocampus¹. Hippocampus är involverad i stressreaktioner men är allmänt känd för sin roll i lärande och minne. Mer specifikt är hippocampus ansvarig för kodning och hämtning av deklarativt och rumsligt minne¹.

Hippocampus, eller hippocampus korrekt, är uppdelad i CA1 (cornu ammonis), CA2 och CA3 delfält¹. Jämfört med resten av nervsystemet har hippocampus flera unika definierande egenskaper, inklusive dess plasticitet och potential för pågående neurogenes². Neurogenes är processen för spridning och differentiering av neurala stamceller, följt av deras integration i det befintliga neuronala nätverket. Neurogenes är begränsad till den subgranulära zonen i dentate gyrus och subventrikulär zon i laterala ventriklar (och luktlökarna)³. Medan neurogenes är riklig i embryogenes, är det en livslång process ^3,4. Som sådan kommer denna diskussion att fokusera på vuxen neurogenes i hippocampus.

De subventrikulära och subgranulära zonerna är neurogena nischer som innehåller ependymala och vaskulära celler, liksom omogna och mogna linjer av neurala stamceller⁵. Microglia bidrar till dessa nischer som immunceller för att reglera neurogenes⁶. Neurala stamceller är icke-stamcellsavkomma från neurala stamceller⁷. Tre typer av neurala förfäder finns i den subventrikulära zonen: radiella glialiknande typ B-celler, typ C transitförstärkande förfäder och typ A-neuroblaster ^3,8. De långsamt delande typ B-neurala stamcellerna i den subventrikulära zonen kan differentieras till snabbt delande typ C-celler⁸. Därefter differentieras typ C-celler till typ A-celler⁸. Dessa neuroblaster migrerar genom rostral migrationsströmmen till luktlampan innan de differentieras till interneuroner eller oligodendrocyter⁹. Dessa olfaktoriska bulbinterneuroner är nyckeln till olfaktoriskt korttidsminne och associativt lärande, medan oligodendrocyterna myeliminerar axoner i corpus callosum⁹. Majoriteten av vuxen neurogenes förekommer i den subgranulära zonen i dentate gyrus, där radiella typ 1 och icke-radiella typ 2 neurala förfäder finns³. De flesta neurala stamceller är avsedda att bli dentatgranulneuroner och astrocyter¹⁰. Anslutna med gapkorsningar bildar astrocyter nätverk för att modulera plasticitet, synaptisk aktivitet och neuronal excitabilitet⁵. Som den primära excitatoriska neuronen i dentate gyrus ger granulatceller inmatning från entorhinal cortex till CA3-regionen¹¹.

Neurala stamcellspopulationer kan isoleras med hjälp av immunomagnetiska eller immunofluorescerande isoleringsstrategier^12,13. Neural vävnad är särskilt svår att dissociera; Ansträngningar att göra det resulterar ofta i prover med dålig cellviabilitet och / eller misslyckas med att producera den nödvändiga encellssuspensionen för nedströms analys. Neural dissociation kan utföras via mekanisk dissociation (såsom användning av filter, huggningstekniker eller pipetttriturering), enzymatisk matsmältning eller en kombination av tekniker ^14,15. I en studie som utvärderade neurala dissociationsmetoder jämfördes livskraften och kvaliteten på manuell mekanisk dissociation genom pipetttriturering jämfört med kombinationer av pipetttriturering och matsmältning med olika enzymer¹⁵. Kvaliteten graderades baserat på mängden cellklumpar och DNA eller subcellulärt skräp i den beredda suspensionen¹⁵. Suspensioner av glialtumörer som utsattes för manuell mekanisk dissociation ensam hade signifikant lägre cellviabilitet än behandlingar med dispas eller en kombination av DNas, kollagenas och hyaluronidas¹⁵. Volovitz et al. erkände variationen i lönsamhet och kvalitet mellan de olika metoderna och betonade att otillräcklig dissociation kan minska noggrannheten i nedströmsanalys¹⁵.

I en separat studie jämförde författarna över 60 olika metoder och kombinationer av dissociation av odlade neuronala celler¹⁴. Dessa metoder inkluderade åtta olika variationer av manuell mekanisk dissociation genom pipetttriturering, en jämförelse av inkubation med fem individuella enzymer med tre olika intervall och olika kombinationer av mekanisk dissociation med enzymatisk matsmältning eller kombinationen av två enzymer¹⁴. Ingen av de mekaniska metoderna gav en encellig suspension¹⁴. Fyra av de enskilda enzymbehandlingarna, tio av de enzymatiska kombinationsbehandlingarna och fyra av kombinationerna av mekanisk dissociation med enzymatisk matsmältning gav en encellig suspension¹⁴. Enzymatisk matsmältning med TrypLE följt av Trypsin-EDTA mest effektivt dissocierade prover¹⁴. För övrigt tenderade prover behandlade med TrypLE och/eller Trypsin-EDTA att bilda gelatinösa klumpar¹⁴. Medan denna studie utfördes på odlade celler, talar den om bristerna i pipetttriturering eller enzymatisk matsmältning ensam.

Jämförelser sida vid sida av manuell kontra automatiserad mekanisk dissociation saknas. En grupp körde dock flödescytometri för att jämföra manuell och halvautomatiserad mekanisk dissociation av hela mushjärn i samband med kommersiella papain- eller trypsinenzymatiska dissociationssatser¹⁶. Bearbetning med dissociatorn gav mer konsekvent livskraftiga celler¹⁶. Efter dissociation isolerade författarna också Prominin-1-celler, neuronala prekursorceller och mikroglia¹⁶. För två av de tre isolerade cellpopulationerna var renheten hos de isolerade cellerna något högre när proverna bearbetades med dissociatorn, jämfört med manuellt¹⁶. Reiß et al. noterade att person-till-person-variation i pipetteringsteknik hindrar reproducerbarhet av livskraftigt cellpopulationsutbyte vid vävnadsdissociation¹⁶. Författarna drog slutsatsen att automatiserad mekanisk dissociation standardiserar provbearbetning¹⁶.

Metoden för dissociation som beskrivs i detta manuskript är en kombination av helautomatiserad mekanisk dissociation och enzymatisk matsmältning, med hjälp av lösningar som åtföljer ett kommersiellt dissociationspaket för vuxna hjärnor¹⁷. Till skillnad från standardprotokoll minskar detta optimerade protokoll provmanipulation, ger en mycket livskraftig encellssuspension och är avsedd för bearbetning av minimala mängder startvävnad.

Protocol

Experimenten utfördes i enlighet med de etiska normer som godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee vid UAMS. 6 månader gamla kvinnliga C57Bl6 / J vildmöss köptes och grupphuserades (4 möss per bur) under en konstant 12 h ljus / mörk cykel. 1. Beredning av reagenser Förbered fixbar levande / död fläcklösning. Rekonstituera den fluorescerande fläcken med 20 μL dimetylsulfoxid (DMSO). Förpacka flaskan i folie, märk den som “Rekonstituerad” och fö…

Representative Results

Prover bearbetades med en flödescytometer vid en kärnanläggning, och de resulterande uppgifterna utvärderades med ett mjukvarupaket för flödesanalys. Tidigare analyserades kompensationskontroller – den levande / döda fläcken och negativ kontroll. Om flera fluorokromer används bör fluorescens minus en (FMO) kontroller och enfläckskontroller förberedas för varje antikropp. Kompensation för spektral överlappning för de experimentella proverna beräknades baserat på de analyserade kontrollerna. För identifi…

Discussion

Flera steg i detta neurala dissociationsprotokoll kräver skicklig teknik och fingerfärdighet-perfusion, supernatant aspiration och myelinavlägsnande. Under hela perfusionsprocessen måste de inre organen förbli intakta (bortsett från att ta bort membranet och klippa hjärtat); detta inkluderar att undvika hjärtans övre kamrar med fjärilsnålen. Medan mängden saltlösning med heparin som behövs varierar, indikerar transparent vätska som strömmar från hjärtat att processen är klar. Hjärnan måste vara helt …

Materials

1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	02-682-003	Basix, assorted color
15 mL Falcon Tubes	Becton Dickinson Labware Europe	352009	Polystyrene
25 mL Serological Pipets	Fisher Scientific	14-955-235
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube	Falcon	352052
500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle System	Corning	431097
70 μm cell strainer	Fisher Scientific	08-771-2
Adult Brain Dissociation Kit	Miltenyi Biotec	130-107-677	Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-105
Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969	Miltenyi Biotec	130-116-246
Anti-Myelin Basic Protein	Sigma-Aldrich	M3821-100UG
Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2B	Miltenyi Biotec	130-117-394
BD LSRFortessa	BD
BSA	Sigma-Aldrich	A7906-50G
CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592	Miltenyi Biotec	130-113-810
CD31 Antibody	Miltenyi Biotec	130-111-541
Ceramic Hot Plate Stirrer	Fisher Scientific	11-100-100SH
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Scientific	BP231-100
Ethanol	Pharmco by Greenfield Global	111000200
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Fine Scissors – Sharp	Fine Science Tools	14060-09	Perfusion
FlowJo	BD		(v10.7.0)
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	Miltenyi Biotec	130-096-427
Gibco DPBS (1X)	ThermoFisher Scientific	14190144
Glass Beaker	Fisher Scientific	02-555-25A
Heparin sodium	Fresenius Kabi	504011
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34965
Magnetic Stir Bar	Fisher Scientific	14-513-51
Noyes Spring Scissors	Fine Science Tools	15012-12	Dissection
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	441244-3KG	Prilled, 95%
Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10	Rainin	30389270
Pipette Tips GP LTS 250 µL 960A/10	Rainin	30389277
Pipette tips RT LTS 1000 µL FL 768A/8	Rainin	30389213
Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL)	Rainin	30386597
RBXMO FITC XADS	Fisher Scientific	A16167
Round Ice Bucket with Lid	Fisher Scientific	07-210-129
Round-Bottom Tubes with Cell Strainer Cap	Falcon	100-0087
S1 Pipet Fillers	ThermoFisher Scientific	9541
Spatula & Probe	Fine Science Tools	10090-13	Dissection & Perfusion
Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4"	Termuno	SV-23BLK	Butterfly needle
Test Tube Rack	Fisher Scientific	14-809-37
Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge	ThermoFisher	discontinued	Or other standard table top centrifuge
Variable-Flow Peristaltic Pump	Fisher Scientific	13-876-2	Low-flow model
VetFlo Starter Kit for Mice	Kent Scientific	VetFlo-MSEKIT	Anesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters
VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia System	Kent Scientific	VetFlo-1210S	0.2–4 LPM
Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer	Beckman Coulter Life Sciences	731196	Cell Counting
Vi-CELL XR 4 Bags of Sample Vials	Beckman Coulter Life Sciences	383721	Cell Counting