Summary
Этот протокол диссоциации нервных клеток предназначен для образцов с небольшим количеством исходного материала и дает очень жизнеспособную одноклеточную суспензию для последующего анализа с дополнительными этапами фиксации и окрашивания.
Abstract
Этот протокол нейронной диссоциации (адаптация протокола, сопровождающего коммерческий набор для диссоциации мозга взрослого человека) оптимизирует обработку тканей при подготовке к подробному последующему анализу, такому как проточная цитометрия или секвенирование одиночных клеток. Нейронная диссоциация может проводиться с помощью механической диссоциации (например, с использованием фильтров, методов измельчения или тритурации пипетки), ферментативного пищеварения или их комбинации. Деликатная природа нейрональных клеток может усложнить усилия по получению очень жизнеспособной, истинной одноклеточной суспензии с минимальным клеточным мусором, которая требуется для анализа одной клетки. Данные показывают, что эта комбинация автоматизированной механической диссоциации и ферментативного пищеварения последовательно дает очень жизнеспособную (>90%) одноклеточную суспензию, преодолевая вышеупомянутые трудности. Хотя некоторые из шагов требуют ручной ловкости, эти шаги уменьшают обработку образцов и потенциальную потерю клеток. В этой рукописи подробно описывается каждый этап процесса, чтобы оснастить другие лаборатории для успешной диссоциации небольших количеств нервной ткани при подготовке к последующему анализу.
Introduction
Гиппокамп был впервые описан болонским анатомом Джулио Чезаре Аранцио в 1500-х годах1. Называя эту новообретенную структуру, Аранцио, вероятно, был вдохновлен ее странным сходством с морским коньком рода Hippocampus1. Гиппокамп участвует в стрессовых реакциях, но широко известен своей ролью в обучении и памяти. Более конкретно, гиппокамп отвечает за кодирование и извлечение декларативной и пространственной памяти1.
Гиппокамп, или собственно гиппокамп, делится на подполя CA1 (cornu ammonis), CA2 и CA31. По сравнению с остальной нервной системой, гиппокамп имеет несколько уникальных определяющих характеристик, включая его пластичность и потенциал для продолжающегося нейрогенеза2. Нейрогенез – это процесс пролиферации и дифференцировки нервных стволовых клеток с последующей их интеграцией в уже существующую нейронную сеть. Нейрогенез ограничен субгранулярной зоной зубчатой извилины и субвентрикулярной зоной боковых желудочков (и обонятельных луковиц)3. В то время как нейрогенез в изобилии присутствует в эмбриогенезе, это пожизненный процесс 3,4. Таким образом, эта дискуссия будет сосредоточена на взрослом нейрогенезе в гиппокампе.
Субвентрикулярная и субгранулярная зоны представляют собой нейрогенные ниши, содержащие эпендимальные и сосудистые клетки, а также незрелые и зрелые линии нервных стволовых клеток5. Микроглия вносит свой вклад в эти ниши в качестве иммунных клеток для регулирования нейрогенеза6. Нейронные клетки-предшественники являются нестемочными клетками-потомками нервных стволовых клеток7. В субвентрикулярной зоне присутствуют три типа нейронных предшественников: радиальные глиоподобные клетки типа В, транзитоусиливающие предшественники типа С и нейробласты типа А 3,8. Медленно делящиеся нейронные клетки-предшественники типа В в субвентрикулярной зоне могут дифференцироваться в быстро делящиеся клетки типа С8. Впоследствии клетки типа С дифференцируются в клетки типа А8. Эти нейробласты мигрируют через ростральный миграционный поток к обонятельной луковице, прежде чем дифференцироваться в интернейроны или олигодендроциты9. Эти интернейроны обонятельных луковиц являются ключом к обонятельной кратковременной памяти и ассоциативному обучению, тогда как олигодендроциты миелинизируют аксоны мозолистого тела9. Большая часть взрослого нейрогенеза происходит в подгранулевой зоне зубчатой извилины, где находятся радиальные нейронные предшественники типа 1 и нерадиальные нейронные предшественники типа2. Большинству нейронных клеток-предшественников суждено стать зубчатыми гранулярными нейронами и астроцитами10. Соединенные щелевыми соединениями, астроциты образуют сети для модуляции пластичности, синаптической активности и возбудимости нейронов5. В качестве первичного возбуждающего нейрона зубчатой извилины гранулярные клетки обеспечивают вход из энторинальной коры в область CA311.
Популяции нервных стволовых клеток могут быть выделены с использованием иммуномагнитных или иммунофлуоресцентных стратегий изоляции12,13. Нервную ткань особенно трудно диссоциировать; попытки сделать это часто приводят к тому, что образцы с плохой жизнеспособностью клеток и/или не получают необходимой одноклеточной суспензии для последующего анализа. Нейронная диссоциация может проводиться с помощью механической диссоциации (например, с использованием фильтров, методов измельчения или тритурации пипетки), ферментативного пищеварения или комбинации методов14,15. В исследовании, оценивающем методы нейронной диссоциации, жизнеспособность и качество ручной механической диссоциации путем тритурации пипетки по сравнению с комбинациями тритурации пипетки и пищеварения с различными ферментами сравнивались15. Качество оценивали на основе количества клеточных сгустков и ДНК или субклеточного мусора в подготовленной суспензии15. Суспензии глиальных опухолей, подвергшихся только ручной механической диссоциации, имели значительно более низкую жизнеспособность клеток, чем лечение диспазой или комбинацией ДНКазы, коллагеназы и гиалуронидазы15. Volovitz et al. признали различия в жизнеспособности и качестве между различными методами и подчеркнули, что неадекватная диссоциация может снизить точность последующего анализа15.
В отдельном исследовании авторы сравнили более 60 различных методов и комбинаций диссоциации культивируемых нейрональных клеток14. Эти методы включали восемь различных вариаций ручной механической диссоциации путем тритурации пипетки, сравнение инкубации с пятью отдельными ферментами через три различных интервала и различные комбинации механической диссоциации с ферментативным пищеварением или комбинацией двух ферментов14. Ни один из механических способов не дал одноэлементной суспензии14. Четыре из одного ферментного лечения, десять комбинированных ферментативных методов лечения и четыре комбинации механической диссоциации с ферментативным пищеварением дали одноклеточную суспензию14. Ферментативное сбраживание с TrypLE с последующим трипсином-ЭДТА наиболее эффективно диссоциировало образцы14. Кстати, образцы, обработанные TrypLE и/или Trypsin-EDTA, имели тенденцию образовывать желатиновые сгустки14. Хотя это исследование было проведено на культивируемых клетках, оно говорит о недостатках тритурации пипетки или ферментативного пищеварения.
Параллельные сравнения ручной и автоматизированной механической диссоциации отсутствуют. Тем не менее, одна группа провела проточную цитометрию для сравнения ручной и полуавтоматической механической диссоциации всего мозга мыши в сочетании с коммерческими наборами ферментативной диссоциации папаина или трипсина16. Обработка диссоциатором более последовательно давала жизнеспособные клетки16. После диссоциации авторы также выделили клетки Проминина-1, нейрональные клетки-предшественники и микроглию16. Для двух из трех изолированных клеточных популяций чистота изолированных клеток была немного выше, когда образцы обрабатывали диссоциатором, по сравнению с вручную16. Reiß et al. отметили, что вариабельность от человека к человеку в методе пипетирования препятствует воспроизводимости жизнеспособного выхода клеточной популяции при диссоциациитканей 16. Авторы пришли к выводу, что автоматизированная механическая диссоциация стандартизирует обработку образцов16.
Метод диссоциации, описанный в этой рукописи, представляет собой комбинацию полностью автоматизированной механической диссоциации и ферментативного пищеварения с использованием растворов, сопровождающих коммерческий набор для диссоциации мозга взрослого человека17. В отличие от стандартных протоколов, этот оптимизированный протокол уменьшает манипуляции с образцами, дает очень жизнеспособную одноклеточную суспензию и предназначен для обработки минимальных количеств исходной ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты проводились в соответствии с этическими нормами, утвержденными Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию при UAMS. 6-месячные самки мышей дикого типа C57Bl6/J были куплены и размещены в группе (4 мыши на клетку) в течение постоянного 12-часового светло-темного цикла.
1. Подготовка реагентов
- Приготовьте поправимый раствор для живых/мертвых пятен. Восстановите флуоресцентное пятно с 20 мкл диметилсульфоксида (ДМСО).
- Заверните флакон в фольгу, пометьте его как «Восстановленный» и храните при температуре -20 °C до шести месяцев.
- Готовят 0,9% физиологический раствор с гепарином. Развести содержимое одного флакона гепарина натрия (10 000 единиц USP на 10 мл) в 1 л двойной дистиллированной воды (ddH2O).
- Приготовьте достаточно примерно на 45 мл на животное и храните при температуре 4 °C в течение одной недели.
- Внесите 1% параформальдегида (PFA).
- В вытяжном шкафу нагрейте конфорку до 50 °C. В микроволновой печи нагрейте 100 мл ddH2O в стеклянном стакане примерно до 60 °C. Добавьте магнитный мешалку и переложите на конфорку.
- В вытяжной капюшон взвесить 1 г PFA и добавить в стакан ddH2O. Добавить 0,1125 г кристаллов NaOH и перемешать до растворения (5-10 мин).
- Добавьте 0,4 г NaPO4-моноосновного и перемешайте до растворения (2-5 мин). Вакуумная фильтрация раствора и регулировка рН до 7,4 с помощью HCl и NaOH.
- Остудить на льду или при 4°C в течение 30 мин перед хранением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Аликвоты 1,5 мл могут храниться при -20 °C в течение одного года. Избегайте циклов замораживания-оттаивания. Если после оттаивания раствор помутнеет или образовался осадок, раствор использовать не следует.
ВНИМАНИЕ: Токсичный, легковоспламеняющийся. Всегда работайте с ПФА под вентилируемым капотом в надлежащих средствах индивидуальной защиты.
- Повторное суспендирование лиофилизированного фермента А с 1 мл буфера А. Не вихряйте раствор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фермент А и буфер А, а также буферы A, Y и Z являются реагентами в коммерческом наборе для диссоциации мозга взрослого человека17. - Разделить фермент Р на аликвоты по 50 мкл и повторно суспендировать фермент А на 10 мкл аликвоты. В соответствии с инструкциями по набору хранить при температуре -20 °C до шести месяцев. Избегайте циклов замораживания-оттаивания.
2. День эксперимента
- Охладите настольную центрифугу до 4 °C.
- Поместите аликвоту (аликвоты) PFA в холодильник для постепенного размораживания.
- Поместите восстановленное живое/мертвое пятно в темноту (например, ящик), чтобы оттаять при комнатной температуре.
- Подготовьте буфер сывороточного альбумина крупного рогатого скота (BSA). Добавьте 0,5 г BSA к 100 мл 1x фосфатно-буферного раствора Dulbecco без кальция и магния (D-PBS), рН 7,2.
- Добавьте перемешивание и перемешайте на перемешиваемой пластине в течение 30 минут. Переложить в конические трубки объемом 50 мл и хранить при температуре 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте свежеприготовленный буфер BSA. - Приготовьте живое/мертвое пятно, рабочее разбавление. Добавьте 1 мкл восстановленного живого/мертвого раствора для пятен в 360 мкл D-PBS и храните его в темноте (например, в ящике или коробке) при комнатной температуре. Приготовьте 50 мкл рабочего разбавления на образец.
3. Перфузия
- Поместите солевой раствор с гепарином на лед.
- Включите кислород, установите индикаторный шарик расходомера на системе испарителя анестезии мелких животных на 1 л/мин. Убедитесь, что есть адекватное давление кислорода и изофлурана.
- Отрегулируйте циферблат испарителя до 3,5% (для индукции и технического обслуживания).
- Загрунтуйте перфузионные насосные линии раствором физиологического раствора/гепарина. Установите скорость 6 мл/мин.
- Поместите мышь в индукционную камеру, включите дыхательную машину и подождите несколько минут, пока мышь не перестанет реагировать. Подтвердить достаточную глубину анестезии за счет отсутствия снятия педали до вредного защемления.
- Поместите мышь на спину на лоток для рассечения носом в носовом конусе. Выполните вторичное подтверждение полной анестезии через отсутствие отвода педали до вредного щепотки. Прикрепите все четыре лапы к лотку.
- Опрыскивайте брюшко животного 20% этанолом.
- С помощью щипцов зажмите нижнюю часть живота и поднимите кожу. Используйте ножницы, чтобы разрезать мех и кожу до нижней части грудной клетки.
- Сделайте два диагональных разреза из-под грудной клетки к каждому плечу.
- Тщательно резецируйте диафрагму (избегая легких и сердца). Ресектируйте грудную клетку, чтобы обнажить сердце.
- Осторожно разрежьте любую соединительную ткань вокруг сердца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 3.10-3.11 имеют решающее значение; выступать с мастерством и ловкостью. - Используйте ножницы, чтобы обрезать правое предсердие (темная доля в левом верхнем углу сердца). Выключите поток изофлурана к дыхательному аппарату.
- Держите сердце устойчивым щипцами. Скосом иглы бабочки лицом вверх проткните левый желудочек, сохраняя иглу на одном уровне и параллельно животному.
- Удерживайте иглу на месте, включите насос и перфьмин не менее 30 мл раствора физиологического раствора / гепарина до тех пор, пока жидкость, выходящая из сердца, не станет непрозрачной, а печень и легкие не бледнеют по цвету.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 3.13-3.14 имеют решающее значение; выступать с мастерством и ловкостью. - Выключите насос, извлеките иглу и перенесите мышь в область рассечения.
4. Рассечение
- Используя большие хирургические ножницы, обезглавить голову.
- Вырежьте мех от затылка до глаз. Очистите кожу обратно, чтобы обнажить череп.
- Зажмите череп между глазами. Сделайте два разреза в задней части черепа, в положении «10» и «2 часа», затем сделайте один длинный разрез (держите кончики вверх, чтобы не повредить мозг) вдоль средней сагиттальной линии черепа до первоначального разреза между глазами.
- Используйте щипцы, чтобы отклеить две половины черепа в стороны. Используйте шпатель, чтобы удалить мозг и поместить его в 60-миллиметровую стеклянную чашку Петри на льду, наполненную холодным D-PBS (рисунок 1).
- Используйте скальпель или бритву, чтобы отделить каждое полушарие. Затем удаляют обонятельные луковицы и мозжечок.
- Используйте щипцы, чтобы удалить средний мозг до тех пор, пока гиппокамп не будет открыт.
- Закрепите мозг щипцами. Используя второй набор щипцов, осторожно дразните гиппокамп из каждого полушария и перенесите оба гиппокампа в меченую трубку объемом 1,5 мл, содержащую холодный D-PBS.
- Поместите пробоотборник, содержащий два гиппокампа от мыши, на лед.
5. Подготовьте ферментную смесь 1 и 2 для каждого образца
ПРИМЕЧАНИЕ: Для объемов более 2 мл используйте серологическую пипетку объемом 10 мл; для объемов 200 мкл-2 мл используйте пипетку 1000 мкл; для объемов, 21-199 мкл, используйте пипетку 200 мкл; для объемов, 2-20 мкл, используйте пипетку 20 мкл; для объемов менее 2 мкл используйте пипетку 0-2 мкл.
- Для каждого образца разморозьте по одной аликвоте фермента Р и фермента А при комнатной температуре.
- Для ферментной смеси 1 соедините 50 мкл фермента P и 1900 мкл буфера Z в меченой C-трубке (Таблица материалов).
- Для смеси ферментов 2 добавьте 20 мкл буфера Y к размороженной 10-мкл аликвоте фермента А.
6. Протокол диссоциации мозга взрослогочеловека 17
ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с образцами трубки должны быть помещены в трубную стойку при комнатной температуре, в то время как BSA и D-PBS остаются на льду, если не указано иное.
- Включите диссоциатор.
- Используйте щипцы для переноса кусочков ткани гиппокампа в трубку С.
- Переложите 30 мкл смеси ферментов 2 в трубку C. Поверните колпачок до тех пор, пока не почувствуется напряжение, затем затяните, пока он не щелкнет.
- Поместите трубку C вверх ногами в положение диссоциатора; образцу будет присвоен статус Selected (рисунок 2). Закрепите нагреватель над трубкой C.
- Нажмите значок папки, выберите Папка Избранное , прокрутите до и выберите 37C_ABDK_02 программу. Нажмите OK , чтобы применить программу ко всем выбранным трубкам C, затем нажмите «Пуск» (рисунок 2).
- Нанесите этикетку на одну коническую пробирку объемом 50 мл на образец.
- Поместите клеточный ситечко 70 мкм на каждую коническую трубку объемом 50 мл и смочите 2 мл буфера BSA.
- По завершении программы снимите нагреватель и трубку С из диссоциатора.
- Добавьте 4 мл буфера BSA к образцу и нанесите смесь на клеточный ситечко на конической пробирке объемом 50 мл.
- Добавьте 10 мл D-PBS в трубку C, закройте ее и осторожно закрутите раствор. Нанесите его на клеточный ситечко на конической трубке объемом 50 мл.
- Выбросьте клеточный ситечко и трубку C. Центрифугировать суспензию при 300 х г в течение 10 мин при 4 °C. Затем аспирируйте и выбросьте супернатант.
7. Удаление мусора
- Повторно суспендировать гранулу с 1550 мкл холодного D-PBS и перенести суспензию в меченую коническую трубку объемом 15 мл.
- Добавьте 450 мкл холодного раствора для удаления мусора и пипетку вверх и вниз (не вихрь).
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор для удаления мусора является реагентом в коммерческом наборе для диссоциации взрослого Брайана17. - Аккуратно наложите 1 мл холодного D-PBS поверх клеточной суспензии, удерживая наконечник у стенки конической трубки. Повторять до тех пор, пока общее наложение не составит 2 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение; выступать с мастерством и ловкостью. - Центрифуга при 3000 x g в течение 10 мин при 4 °C с полным ускорением и полным торможением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если фазы четко не разделены, повторите шаги 7.2-7.3. Центрифуга конечное время при 1000 х г в течение 10 мин при 4 °C. - Теперь суспензия должна состоять из трех отдельных слоев (рисунок 3). Аспирировать самый верхний слой. Проведите кончик пипетки вперед и назад, чтобы аспирировать белый средний слой. Удалите как можно больше среднего слоя, не нарушая самый нижний слой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение; выступать с мастерством и ловкостью. - Добавьте 2 мл холодного D-PBS и пипетку вверх и вниз, чтобы перемешать.
- Центрифуга при 1000 x g в течение 10 мин при 4 °C с полным ускорением и полным торможением. Аспирировать и выбросить супернатант. Повторно суспендировать гранулу в 1 мл буфера BSA.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть повторно суспендированы в соответствующем буфере, а затем магнитно маркированы и изолированы в рамках подготовки к секвенированию одиночных клеток на этом этапе.
8. Количество ячеек
- Выполнять подсчет ячеек в соответствии с протоколом производителя доступного счетчика ячеек (один из вариантов указан в Таблице материалов)
9. Живое/мертвое пятно
- Центрифуга оставшихся 900 мкл (от 7,7) при 1000 х g в течение 10 мин при 4 °C с полным ускорением и полным торможением.
- Пока образец вращается, маркируйте одну проточную трубку на образец и оберните ее в фольгу, чтобы ограничить воздействие света.
- Аспирировать и выбросить супернатант.
- Повторно суспендировать гранулу в 50 мкл разбавленного живого/мертвого пятна (предварительно приготовленного).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен выполняться при слабом освещении. Выключите верхний свет в комнате, чтобы достичь этого. - Переложите каждый образец в соответствующую маркированную проточную трубку и инкубируйте при комнатной температуре в течение 8-10 мин в темноте (например, ящик или коробку).
- Добавьте 500 мкл буфера BSA и центрифуги при 1000 x g в течение 10 мин при 4 °C с полным ускорением и полным торможением.
- Аспирировать и выбросить супернатант.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула может быть не видна; оставьте небольшое количество буфера, чтобы непреднамеренно не аспирировать гранулу. Клетки могут быть повторно суспендированы в соответствующем буфере, заблокированы и окрашены клеточно-специфическими антителами в этот момент. Пример протокола18 см. в дополнительном файле 1.
10. Фиксация (опционально)
- Повторно суспендировать гранулы в 200 мкл 1% PFA (предварительно приготовленные). Инкубировать в течение 15 мин при 4 °C.
- Промыть, добавив 500 мкл D-PBS и центрифугу при 300 х г в течение 10 мин при 4 °C.
- Аспирировать супернатанта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула может быть не видна; оставьте небольшое количество буфера, чтобы непреднамеренно не аспирировать гранулу. - Повторно суспендировать гранулу в 200 мкл D-PBS и хранить при 4 °C до 3 дней.
11. Проточная цитометрия
- Наклейте крышки фильтров на новые трубки.
- Используя пипетку объемом 1 мл, пипетка каждого образца помещается на крышку фильтра.
- Центрифуга ненадолго при 200 x g при 4 °C, что позволяет центрифуге достигать 200 x g до остановки пробега.
- Приступайте к проточной цитометрии керна для последующего анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Образцы обрабатывали проточным цитометром на стержневом объекте, а полученные данные оценивали с помощью программного пакета для анализа потока. Ранее анализировались компенсационные элементы управления — живое/мертвое пятно и отрицательный контроль. Если используется несколько флуорохромов, для каждого антитела следует подготовить флуоресценцию минус один (FMO) контроль и контроль с одним пятном. Компенсация спектрального перекрытия для экспериментальных образцов была рассчитана на основе проанализированных контрольных показателей. Для идентификации клеточной популяции использовалась иерархическая стратегия гатинга. Первичный затвор исключил мусор на прямом рассеянии (размер ячейки) против бокового рассеяния (гранулярность) графика19,20. Впоследствии мертвые клетки были исключены (Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Дополнительный Рисунок 1, Дополнительный Рисунок 2, Дополнительный Рисунок 3 и Дополнительный Рисунок 4). Следующие ворота исключают клетки, положительные на основной белок миелина (дополнительный рисунок 4). Из оставшихся клеток были созданы графики плотности клеток, положительных для каждого фторхрома (дополнительный рисунок 4). Частота каждой популяции нейрональных клеток была рассчитана из третьего затвора (дополнительный рисунок 4). Образцы, которые были обработаны с ручной механической диссоциацией21 и ферментативным пищеварением, дали значительно меньшую популяцию интересующих клеток (Дополнительный файл 221, рисунок 4 и дополнительный рисунок 1). И наоборот, как фиксированные, так и свежие образцы, приготовленные с помощью автоматизированной механической диссоциации и ферментативного пищеварения, возвращали популяцию интересующих клеток в несколько раз больше (Рисунок 5, Рисунок 6, Дополнительный Рисунок 2 и Дополнительный Рисунок 3).
Рисунок 1: Мозг мыши. (А) Правильно перфузирован. (B) Неперфузированные. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Выбранный статус на шаге 6.4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Трехслойная суспензия на шаге 7.5: Буфер (верхний слой), клеточный мусор, раствор для удаления мусора и ячейки (нижний слой). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативный анализ фиксированных образцов, обработанных с использованием комбинации ручной диссоциации пипеткой Пастера и ферментативного пищеварения. Первый из двух образцов обрабатывается одновременно. (A) Процент клеток, которые являются интересующей клеточной популяцией. (B) Процентная доля интересующей популяции, которая является живыми клетками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Репрезентативный анализ свежих образцов, обработанных с использованием комбинации автоматизированной механической диссоциации и ферментативного сбраживания. Первый из двух образцов обрабатывается одновременно. (A) Процент клеток, которые являются интересующей клеточной популяцией. (B) Процентная доля интересующей популяции, которая является живыми клетками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Репрезентативный анализ неподвижных образцов, обработанных с использованием комбинации автоматизированной механической диссоциации и ферментативного сбраживания. Первый из двух образцов обрабатывается одновременно. (A) Процент клеток, которые являются интересующей клеточной популяцией. (B) Процентная доля интересующей популяции, которая является живыми клетками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Репрезентативный анализ фиксированных образцов, обработанных с использованием комбинации ручной диссоциации пипетки Пастера и ферментативного пищеварения. Второй из двух образцов обрабатывается одновременно. (A) Процент клеток, которые являются интересующей клеточной популяцией. (B) Процентная доля интересующей популяции, которая является живыми клетками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Репрезентативный анализ свежих образцов, обработанных с использованием комбинации автоматизированной механической диссоциации и ферментативного сбраживания. Второй из двух образцов обрабатывается одновременно. (A) Процент клеток, которые являются интересующей клеточной популяцией. (B) Процентная доля интересующей популяции, которая является живыми клетками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 3: Репрезентативный анализ неподвижных образцов, обработанных с использованием комбинации автоматизированной механической диссоциации и ферментативного сбраживания. Второй из двух образцов обрабатывается одновременно. (A) Процент клеток, которые являются интересующей клеточной популяцией. (B) Процентная доля интересующей популяции, которая является живыми клетками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 4: Репрезентативный анализ окрашенных и неподвижных образцов, обработанных с использованием комбинации автоматизированной механической диссоциации и ферментативного сбраживания. (A) Процент клеток, которые являются интересующей клеточной популяцией. (B) Процентная доля интересующей популяции, которая является живыми клетками. (C). ПМБ- Ячейки. (D). Клетки PSA-NCAM+ (нейрональные клетки-предшественники). (E). Клетки ACSA2+ (астроциты). (F). CD31+ клетки (эндотелиальные). (G). CD11b+ клетки (микроглия). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 1: Протокол окрашивания. Протокол окрашивания образца для иммуноокрашения маркеров клеточной поверхности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 2: Адаптированный ручной протокол механической и ферментативной диссоциации. Этот способ адаптирован из ранее опубликованного протокола21. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Несколько шагов в этом протоколе нейронной диссоциации требуют профессиональной техники и ловкости — перфузии, аспирации супернатанта и удаления миелина. На протяжении всего процесса перфузии внутренние органы должны оставаться нетронутыми (кроме удаления диафрагмы и купирования сердца); это включает в себя избегание верхних камер сердца с помощью иглы бабочки. В то время как количество физиологического раствора с необходимым гепарином варьируется, прозрачная жидкость, вытекающая из сердца, указывает на то, что процесс завершен. Мозг должен быть полностью и правильно перфузирован, и в этот момент он будет казаться небелым (рисунок 1). При перфузии этап удаления эритроцитов становится посторонним, устраняя избыточные манипуляции с образцами, которые могут привести к потере клеток. Впоследствии, этап удаления мусора требует твердой руки. Чтобы центрифугирование привело к получению четко определенных слоев после наложения D-PBS (рисунок 3), слои не должны нарушаться при транспортировке или во время пипетки. Кроме того, при аспирации двух верхних слоев необходимо удалить достаточное количество суспензии, чтобы устранить чрезмерный мусор клеток, оставляя при этом достаточно большой образец. Это ключевой шаг, поскольку мертвые клетки с большей вероятностью связываются неспецифически и становятся аутофлуоресцентными 22,23, что еще больше подчеркивает важность выбора метода, который последовательно приводит к высокой жизнеспособности клеток. Наконец, при аспирации супернатанта гранула не всегда может быть видна. Необходимо оставить небольшое количество остаточного супернатанта, чтобы образец случайно не был выброшен.
Есть свои преимущества и недостатки в фиксации образцов. Не все маркеры антител совместимы с фиксацией, что ограничивает последующий анализ в зависимости от интересующих популяций клеток. Кроме того, использование чрезмерно концентрированной PFA или оставление клеток в фиксаторе в течение длительного периода времени может привести к автофлуоресценции и ложноположительным показаниям, тем самым смешивая результаты24,25. При использовании 1% раствора PFA и минимизации воздействия клеток вероятность ложноположительных показаний значительно снижается. Поскольку эта процедура детализирована и имеет много временных переменных, использование свежих клеток ставит лаборатории под строгие временные ограничения, чтобы гарантировать, что клетки остаются жизнеспособными. Фиксация сохраняет клеточную структуру для анализа на следующий день.
Одноклеточный анализ может дать ключевую информацию об эффективности лечения, функции клеток и заболевании или механизмах лечения. Примеры методов включают секвенирование одноклеточной ДНК и РНК 26,27, цитометрию по времени пролета22,28, проточную цитометрию и иммуногистохимию. При секвенировании одноклеточной мРНК экспрессия генов во время сбора образца может обеспечить понимание типа клетки26. Например, исследовательская группа выполнила секвенирование одноклеточной РНК на дофаминовых рецепторах D1 и D2, экспрессирующих средние подтипы колючих нейронов из дорсомедиального полосатого тела27. Группа переопределила транскриптом средних колючих нейронов, обнаружив новые гены-маркеры, специфичные для подтипов, и идентифицировав гены, которые ранее и неправильно экспрессировались из-за отсутствия одноклеточного разрешения27. Ho et al. подчеркнули потенциал секвенирования одноклеточной РНК при обнаружении специфических для клеток лекарственных мишеней27. При секвенировании одноклеточной ДНК изменения в экспрессии генов могут быть описаны путем измерения модификаций ДНК и гистонов, доступности хроматина и конформации хроматина26. При измерении метилирования ДНК одного ядра Лю и др. построили одноклеточный атлас метилома ДНК из 45 областей мозга мыши и идентифицировали 161 тип нейрональных клеток29. Пробоподготовка для одноклеточного секвенирования является более сложной задачей, особенно выделение одиночных клеток и удаление мусора. Mattei et al. исследовали влияние ферментативной и механической диссоциации на транскриптомное и протеотипное профилирование, отметив, что методы нейронной диссоциации по своей сути вводят уровень смещения30. Несколько групп отметили важность эффективной работы, рассечения на льду и использования ингибиторов транскрипции 26,30,31. Mattei et al. также идентифицировали пораженные гены и белки для информирования анализа30. Тем не менее, эти методы по-прежнему дают подробное представление о клеточных строительных блоках, которые не имеют себе равных в объемной тканевой транскриптомике26,27.
Проточная цитометрия является мощным аналитическим инструментом, который может одновременно идентифицировать и измерять параметры одноклеточных популяций с помощью флуоресцентных зондов. Некоторые области применения проточных цитометров включают анализ клеточного цикла, сортировку клеток, жизнеспособность, фенотипирование, пролиферацию клеток и функциональный анализ32,33. Большинство из этих применений используют поверхностное окрашивание из-за доступности белков клеточной поверхности. Эти белки могут быть окрашены для идентификации конкретных клеточных популяций на основе линии, стадии развития и функции 19,32,33. Например, образцы могут быть окрашены поверхностно для идентификации популяций астроцитов, эндотелиальных клеток, нейрональных клеток-предшественников и микроглии34. Основным преимуществом при окрашивании поверхностных белков живых клеток является возможность сортировки клеток при сохранении возможности проведения дальнейшего последующего анализа34. В то время как методы окрашивания поверхности довольно стандартны, внутриклеточное окрашивание является более деликатной процедурой. При внутриклеточной проточной цитометрии клетки должны быть зафиксированы и проницаемы перед окрашиванием, чтобы позволить антителу пересечь клеточную мембрану 20,32,33,34. В идеале морфология клеток останется нетронутой; однако пермеабилизация рискует денатурацией белка, что негативно скажется на обнаружении антител22,34. Некоторые методы дальнейшего последующего анализа больше не являются вариантом, как только ячейкизафиксированы 20. В то время как недостатки внутриклеточного окрашивания более выражены, чем поверхностное окрашивание, первое позволяет обнаруживать и анализировать внутриклеточные молекулы, которые в противном случае не были бы правдоподобными. Кроме того, процедуры окрашивания клеточной поверхности и внутриклеточного окрашивания могут быть объединены для окончательной идентификации определенных типов клеток или оценки дополнительных параметров одновременно 20,28,34.
Существует несколько методов диссоциации нейронов, которые могут быть использованы для приготовления одноклеточной суспензии, необходимой для клеточного анализа, хотя они не одинаково эффективны. По сравнению со стандартизированными наборами и вышеупомянутыми методами, этот конкретный метод диссоциации нейронов предназначен для обработки небольших количеств ткани, дает очень жизнеспособную одноклеточную суспензию (>90%) и упрощает эксперимент. С помощью этого протокола другие лаборатории оснащены для выполнения нейронной диссоциации надежным и воспроизводимым способом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Эйми Роджерс за практическое обучение и постоянную поддержку продукта. Мы благодарим д-ра Аманду Берк за продолжающееся устранение неполадок и прояснение обсуждений. Мы благодарим Мередит Йохейм и UAMS Science Communication Group за грамматическое редактирование и форматирование этой рукописи. Это исследование было поддержано NIH R25GM083247 и NIH 1R01CA258673 (A.R.A).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02-682-003 | Basix, assorted color |
| 15 mL Falcon Tubes | Becton Dickinson Labware Europe | 352009 | Polystyrene |
| 25 mL Serological Pipets | Fisher Scientific | 14-955-235 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Falcon | 352052 | |
| 500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle System | Corning | 431097 | |
| 70 μm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-105 | |
| Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti-Myelin Basic Protein | Sigma-Aldrich | M3821-100UG | |
| Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2B | Miltenyi Biotec | 130-117-394 | |
| BD LSRFortessa | BD | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906-50G | |
| CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592 | Miltenyi Biotec | 130-113-810 | |
| CD31 Antibody | Miltenyi Biotec | 130-111-541 | |
| Ceramic Hot Plate Stirrer | Fisher Scientific | 11-100-100SH | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Ethanol | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | Perfusion |
| FlowJo | BD | (v10.7.0) | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Gibco DPBS (1X) | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Glass Beaker | Fisher Scientific | 02-555-25A | |
| Heparin sodium | Fresenius Kabi | 504011 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34965 | |
| Magnetic Stir Bar | Fisher Scientific | 14-513-51 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | Dissection |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244-3KG | Prilled, 95% |
| Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10 | Rainin | 30389270 | |
| Pipette Tips GP LTS 250 µL 960A/10 | Rainin | 30389277 | |
| Pipette tips RT LTS 1000 µL FL 768A/8 | Rainin | 30389213 | |
| Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL) | Rainin | 30386597 | |
| RBXMO FITC XADS | Fisher Scientific | A16167 | |
| Round Ice Bucket with Lid | Fisher Scientific | 07-210-129 | |
| Round-Bottom Tubes with Cell Strainer Cap | Falcon | 100-0087 | |
| S1 Pipet Fillers | ThermoFisher Scientific | 9541 | |
| Spatula & Probe | Fine Science Tools | 10090-13 | Dissection & Perfusion |
| Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4" | Termuno | SV-23BLK | Butterfly needle |
| Test Tube Rack | Fisher Scientific | 14-809-37 | |
| Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher | discontinued | Or other standard table top centrifuge |
| Variable-Flow Peristaltic Pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | Low-flow model |
| VetFlo Starter Kit for Mice | Kent Scientific | VetFlo-MSEKIT | Anesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters |
| VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | 0.2–4 LPM |
| Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter Life Sciences | 731196 | Cell Counting |
| Vi-CELL XR 4 Bags of Sample Vials | Beckman Coulter Life Sciences | 383721 | Cell Counting |
References
- Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'Keefe, J. The Hippocampus Book. , Oxford University Press, Inc. (2007).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. Genetic influence on neurogenesis in the dentate gyrus of adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 10409-10414 (1997).
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132, 645-660 (2008).
- Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the adult hippocampus. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, 018812 (2015).
- Bond, A. M., Ming, G. L., Song, H. Adult mammalian neural stem cells and neurogenesis: Five decades later. Cell Stem Cell. 17, 385-395 (2015).
- Sato, K. Effects of microglia on neurogenesis. Glia. 63, 1394-1405 (2015).
- Lee, V. M., Scientist, S., Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neural stem cells. , Available from: http://www.stemcell.com/media/files/minireview/MR29019-Neural_Stem_Cells.pdf (2015).
- Mu, Y., Lee, S. W., Gage, F. H. Signaling in adult neurogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 20, 416-423 (2010).
- Fares, J., Diab, Z. B., Nabha, S., Fares, Y. Neurogenesis in the adult hippocampus: history, regulation, and prospective roles. International Journal of Neuroscience. 129, 598-611 (2018).
- Tosun, M., Semerci, F., Maletic-Savatic, M. Heterogeneity of stem cells in the hippocampus. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1169, 31-53 (2019).
- Abbott, L. C., Nigussie, F. Adult neurogenesis in the mammalian dentate gyrus. Journal of Veterinary Medicine Series C: Anatomia Histologia Embryologia. 49, 3-16 (2020).
- Rodrigues, G. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A., Cabral, J. M., Diogo, M. M. Purification of human induced pluripotent stem cell-derived neural precursors using magnetic activated cell sorting. Methods in Molecular Biology. 1283, Clifton, N.J. 137-145 (2015).
- Ko, I. K., Kato, K., Iwata, H. Parallel analysis of multiple surface markers expressed on rat neural stem cells using antibody microarrays. Biomaterials. 26, 4882-4891 (2005).
- Jager, L. D., et al. Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells. Advances in Medical Sciences. 61 (1), 78-84 (2017).
- Volovitz, I., et al. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells. BMC Neuroscience. 17, 1-10 (2016).
- Reiß, S., Herzig, I., Schmitz, J., Bosio, A., Pennartz, S. Semi-automated tissue dissociation and preserved epitope integrity optimize immunomagnetic sorting of neural cells. , Available from: www.miltenyibiotec.com (2021).
- Adult brain dissociation kit: mouse and rat. Miltenyi Biotec. , Available from: https://www.miltenyibiotec.com/upload/assets/IM0011920.pdf (2020).
- Cell surface flow cytometry staining protocol. Miltenyi Biotec. , Available from: https://www.miltenyibiotec.com/US-en/applications/all-protocols/cell-surface-flow-cytometry-straining-protocol-pbs-bsa-1-50.html (2021).
- Finak, G., Jiang, W., Gottardo, R. CytoML for cross-platform cytometry data sharing. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 93, 1189-1196 (2018).
- Turaç, G., et al. Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis. PLoS One. 8, 1-14 (2013).
- Schwarz, J. M. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).
- Brummelman, J. application and computational analysis of high-dimensional fluorescent antibody panels for single-cell flow cytometry. Nature Protocols. 14, 1946-1969 (2019).
- Recommended controls for flow cytometry. Abcam. , Available from: https://www.abam.com/protocols/recommended-conntrols-for-flow-cytometry (2021).
- Fixing cells with paraformaldehyde (PFA) for flow cytometry. , Available from: https://flowcytometry.utoronto.ca/wp-content/uploads/2016/02/FixingCells_PFA.pdf (2021).
- Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 71, 379-385 (2007).
- Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes. Neuron. 109, 11-26 (2021).
- Ho, H., et al. A guide to single-cell transcriptomics in adult rodent brain: The medium spiny neuron transcriptome revisited. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 1-16 (2018).
- Li, L., et al. Novel technologies in studying brain immune response. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 6694566 (2021).
- Liu, H., et al. DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution. bioRxiv. , (2020).
- Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. International Journal of Molecular Sciences. 21, 1-20 (2020).
- Liu, L., et al. Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 2 (2), 100590 (2021).
- Delmonte, O. M., Fleisher, T. A. Flow cytometry: Surface markers and beyond. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143, 528-537 (2019).
- O'Connor, J. E., et al. The relevance of flow cytometry for biochemical analysis. IUBMB Life. 51, 231-239 (2001).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. Journal of Visualized. Experiments. (94), e52241 (2014).
