Detta neurala celldissociationsprotokoll är avsett för prover med en låg mängd utgångsmaterial och ger en mycket livskraftig encellssuspension för nedströms analys, med valfria fixerings- och färgningssteg.
Detta neurala dissociationsprotokoll (en anpassning av protokollet som åtföljer ett kommersiellt dissociationspaket för vuxna hjärnor) optimerar vävnadsbehandling som förberedelse för detaljerad nedströmsanalys såsom flödescytometri eller encellssekvensering. Neural dissociation kan utföras via mekanisk dissociation (såsom användning av filter, huggningstekniker eller pipetttriturering), enzymatisk matsmältning eller en kombination av dessa. Den känsliga naturen hos neuronala celler kan komplicera ansträngningarna för att erhålla den mycket livskraftiga, sanna encellssuspensionen med minimalt cellulärt skräp som krävs för encellsanalys. Data visar att denna kombination av automatiserad mekanisk dissociation och enzymatisk matsmältning konsekvent ger en mycket livskraftig (>90%) encellssuspension, vilket övervinner de ovan nämnda svårigheterna. Medan några av stegen kräver manuell fingerfärdighet, minskar dessa steg provhantering och potentiell cellförlust. Detta manuskript beskriver varje steg i processen för att utrusta andra laboratorier för att framgångsrikt dissociera små mängder neural vävnad som förberedelse för nedströms analys.
Hippocampus beskrevs först av en bolognesisk anatom, Giulio Cesare Aranzio, på 1500-talet1. Vid namngivningen av denna nyfunna struktur inspirerades Aranzio troligen av dess kusliga likhet med sjöhästen i släktet Hippocampus1. Hippocampus är involverad i stressreaktioner men är allmänt känd för sin roll i lärande och minne. Mer specifikt är hippocampus ansvarig för kodning och hämtning av deklarativt och rumsligt minne1.
Hippocampus, eller hippocampus korrekt, är uppdelad i CA1 (cornu ammonis), CA2 och CA3 delfält1. Jämfört med resten av nervsystemet har hippocampus flera unika definierande egenskaper, inklusive dess plasticitet och potential för pågående neurogenes2. Neurogenes är processen för spridning och differentiering av neurala stamceller, följt av deras integration i det befintliga neuronala nätverket. Neurogenes är begränsad till den subgranulära zonen i dentate gyrus och subventrikulär zon i laterala ventriklar (och luktlökarna)3. Medan neurogenes är riklig i embryogenes, är det en livslång process 3,4. Som sådan kommer denna diskussion att fokusera på vuxen neurogenes i hippocampus.
De subventrikulära och subgranulära zonerna är neurogena nischer som innehåller ependymala och vaskulära celler, liksom omogna och mogna linjer av neurala stamceller5. Microglia bidrar till dessa nischer som immunceller för att reglera neurogenes6. Neurala stamceller är icke-stamcellsavkomma från neurala stamceller7. Tre typer av neurala förfäder finns i den subventrikulära zonen: radiella glialiknande typ B-celler, typ C transitförstärkande förfäder och typ A-neuroblaster 3,8. De långsamt delande typ B-neurala stamcellerna i den subventrikulära zonen kan differentieras till snabbt delande typ C-celler8. Därefter differentieras typ C-celler till typ A-celler8. Dessa neuroblaster migrerar genom rostral migrationsströmmen till luktlampan innan de differentieras till interneuroner eller oligodendrocyter9. Dessa olfaktoriska bulbinterneuroner är nyckeln till olfaktoriskt korttidsminne och associativt lärande, medan oligodendrocyterna myeliminerar axoner i corpus callosum9. Majoriteten av vuxen neurogenes förekommer i den subgranulära zonen i dentate gyrus, där radiella typ 1 och icke-radiella typ 2 neurala förfäder finns3. De flesta neurala stamceller är avsedda att bli dentatgranulneuroner och astrocyter10. Anslutna med gapkorsningar bildar astrocyter nätverk för att modulera plasticitet, synaptisk aktivitet och neuronal excitabilitet5. Som den primära excitatoriska neuronen i dentate gyrus ger granulatceller inmatning från entorhinal cortex till CA3-regionen11.
Neurala stamcellspopulationer kan isoleras med hjälp av immunomagnetiska eller immunofluorescerande isoleringsstrategier12,13. Neural vävnad är särskilt svår att dissociera; Ansträngningar att göra det resulterar ofta i prover med dålig cellviabilitet och / eller misslyckas med att producera den nödvändiga encellssuspensionen för nedströms analys. Neural dissociation kan utföras via mekanisk dissociation (såsom användning av filter, huggningstekniker eller pipetttriturering), enzymatisk matsmältning eller en kombination av tekniker 14,15. I en studie som utvärderade neurala dissociationsmetoder jämfördes livskraften och kvaliteten på manuell mekanisk dissociation genom pipetttriturering jämfört med kombinationer av pipetttriturering och matsmältning med olika enzymer15. Kvaliteten graderades baserat på mängden cellklumpar och DNA eller subcellulärt skräp i den beredda suspensionen15. Suspensioner av glialtumörer som utsattes för manuell mekanisk dissociation ensam hade signifikant lägre cellviabilitet än behandlingar med dispas eller en kombination av DNas, kollagenas och hyaluronidas15. Volovitz et al. erkände variationen i lönsamhet och kvalitet mellan de olika metoderna och betonade att otillräcklig dissociation kan minska noggrannheten i nedströmsanalys15.
I en separat studie jämförde författarna över 60 olika metoder och kombinationer av dissociation av odlade neuronala celler14. Dessa metoder inkluderade åtta olika variationer av manuell mekanisk dissociation genom pipetttriturering, en jämförelse av inkubation med fem individuella enzymer med tre olika intervall och olika kombinationer av mekanisk dissociation med enzymatisk matsmältning eller kombinationen av två enzymer14. Ingen av de mekaniska metoderna gav en encellig suspension14. Fyra av de enskilda enzymbehandlingarna, tio av de enzymatiska kombinationsbehandlingarna och fyra av kombinationerna av mekanisk dissociation med enzymatisk matsmältning gav en encellig suspension14. Enzymatisk matsmältning med TrypLE följt av Trypsin-EDTA mest effektivt dissocierade prover14. För övrigt tenderade prover behandlade med TrypLE och/eller Trypsin-EDTA att bilda gelatinösa klumpar14. Medan denna studie utfördes på odlade celler, talar den om bristerna i pipetttriturering eller enzymatisk matsmältning ensam.
Jämförelser sida vid sida av manuell kontra automatiserad mekanisk dissociation saknas. En grupp körde dock flödescytometri för att jämföra manuell och halvautomatiserad mekanisk dissociation av hela mushjärn i samband med kommersiella papain- eller trypsinenzymatiska dissociationssatser16. Bearbetning med dissociatorn gav mer konsekvent livskraftiga celler16. Efter dissociation isolerade författarna också Prominin-1-celler, neuronala prekursorceller och mikroglia16. För två av de tre isolerade cellpopulationerna var renheten hos de isolerade cellerna något högre när proverna bearbetades med dissociatorn, jämfört med manuellt16. Reiß et al. noterade att person-till-person-variation i pipetteringsteknik hindrar reproducerbarhet av livskraftigt cellpopulationsutbyte vid vävnadsdissociation16. Författarna drog slutsatsen att automatiserad mekanisk dissociation standardiserar provbearbetning16.
Metoden för dissociation som beskrivs i detta manuskript är en kombination av helautomatiserad mekanisk dissociation och enzymatisk matsmältning, med hjälp av lösningar som åtföljer ett kommersiellt dissociationspaket för vuxna hjärnor17. Till skillnad från standardprotokoll minskar detta optimerade protokoll provmanipulation, ger en mycket livskraftig encellssuspension och är avsedd för bearbetning av minimala mängder startvävnad.
Flera steg i detta neurala dissociationsprotokoll kräver skicklig teknik och fingerfärdighet-perfusion, supernatant aspiration och myelinavlägsnande. Under hela perfusionsprocessen måste de inre organen förbli intakta (bortsett från att ta bort membranet och klippa hjärtat); detta inkluderar att undvika hjärtans övre kamrar med fjärilsnålen. Medan mängden saltlösning med heparin som behövs varierar, indikerar transparent vätska som strömmar från hjärtat att processen är klar. Hjärnan måste vara helt …
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Aimee Rogers för att ha tillhandahållit praktisk utbildning och fortsatt produktsupport. Vi tackar Dr. Amanda Burke för pågående felsökning och klargörande diskussioner. Vi tackar Meredith Joheim och UAMS Science Communication Group för den grammatiska redigeringen och formateringen av detta manuskript. Denna studie stöddes av NIH R25GM083247 och NIH 1R01CA258673 (A.R.A).
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02-682-003 | Basix, assorted color |
15 mL Falcon Tubes | Becton Dickinson Labware Europe | 352009 | Polystyrene |
25 mL Serological Pipets | Fisher Scientific | 14-955-235 | |
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Falcon | 352052 | |
500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle System | Corning | 431097 | |
70 μm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution |
Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-105 | |
Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
Anti-Myelin Basic Protein | Sigma-Aldrich | M3821-100UG | |
Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2B | Miltenyi Biotec | 130-117-394 | |
BD LSRFortessa | BD | ||
BSA | Sigma-Aldrich | A7906-50G | |
CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592 | Miltenyi Biotec | 130-113-810 | |
CD31 Antibody | Miltenyi Biotec | 130-111-541 | |
Ceramic Hot Plate Stirrer | Fisher Scientific | 11-100-100SH | |
Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | |
Ethanol | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | Perfusion |
FlowJo | BD | (v10.7.0) | |
gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
Gibco DPBS (1X) | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
Glass Beaker | Fisher Scientific | 02-555-25A | |
Heparin sodium | Fresenius Kabi | 504011 | |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34965 | |
Magnetic Stir Bar | Fisher Scientific | 14-513-51 | |
Noyes Spring Scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | Dissection |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244-3KG | Prilled, 95% |
Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10 | Rainin | 30389270 | |
Pipette Tips GP LTS 250 µL 960A/10 | Rainin | 30389277 | |
Pipette tips RT LTS 1000 µL FL 768A/8 | Rainin | 30389213 | |
Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL) | Rainin | 30386597 | |
RBXMO FITC XADS | Fisher Scientific | A16167 | |
Round Ice Bucket with Lid | Fisher Scientific | 07-210-129 | |
Round-Bottom Tubes with Cell Strainer Cap | Falcon | 100-0087 | |
S1 Pipet Fillers | ThermoFisher Scientific | 9541 | |
Spatula & Probe | Fine Science Tools | 10090-13 | Dissection & Perfusion |
Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4" | Termuno | SV-23BLK | Butterfly needle |
Test Tube Rack | Fisher Scientific | 14-809-37 | |
Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher | discontinued | Or other standard table top centrifuge |
Variable-Flow Peristaltic Pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | Low-flow model |
VetFlo Starter Kit for Mice | Kent Scientific | VetFlo-MSEKIT | Anesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters |
VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | 0.2–4 LPM |
Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter Life Sciences | 731196 | Cell Counting |
Vi-CELL XR 4 Bags of Sample Vials | Beckman Coulter Life Sciences | 383721 | Cell Counting |