Bestemme Basal energiutgifter og kapasiteten til thermogenic Adipocytes å bruke energi i overvektige mus

Summary

Dette manuskriptet beskriver en protokoll for å måle basal metabolsk hastighet og oksidativ kapasitet av termogene adipocytter hos overvektige mus.

Abstract

Energiutgiftsmålinger er nødvendige for å forstå hvordan endringer i metabolisme kan føre til fedme. Basal energiforbruk kan bestemmes hos mus ved å måle oksygenforbruk i hele kroppen, _{CO2-produksjon} og fysisk aktivitet ved hjelp av metabolske merder. Thermogenic brun/beige adipocytter (BA) bidrar betydelig til gnagerenergiutgifter, spesielt ved lave omgivelsestemperaturer. Her er målinger av basale energiforbruk og total BA-kapasitet til å bruke energi i overvektige mus beskrevet i to detaljerte protokoller: den første som forklarer hvordan man setter opp analysen for å måle basale energiforbruk ved hjelp av analyse av kovarians (ANCOVA), en nødvendig analyse gitt at energiforbruket varierer med kroppsmasse. Den andre protokollen beskriver hvordan man måler BA energiutgiftskapasitet in vivo hos mus. Denne prosedyren innebærer anestesi, som trengs for å begrense utgifter forårsaket av fysisk aktivitet, etterfulgt av injeksjon av beta3-adrenerge agonist, CL-316,243, som aktiverer energiforbruket i BA. Disse to protokollene og deres begrensninger er beskrevet i tilstrekkelig detalj for å tillate et vellykket første eksperiment.

Introduction

Metabolisme kan defineres som integrering av de biokjemiske reaksjonene som er ansvarlige for næringsopptak, lagring, transformasjon og sammenbrudd som celler bruker til å vokse og utføre sine funksjoner. Metabolske reaksjoner forvandler energien i næringsstoffer til en form som kan brukes av celler for å syntetisere nye molekyler og utføre arbeid. Disse biokjemiske reaksjonene er iboende ineffektive i å transformere denne energien til en brukbar form for å opprettholde ^livet1. Slike ineffektivitet resulterer i energispredning i form av varme, med denne varmeproduksjonen som brukes til å kvantifisere standard metabolsk hastighet (SMR) av en ^organisme1. Standardtilstanden ble klassisk definert som varmeproduksjon som forekommer i en våken, men hvilende voksen, ikke inntar eller fordøyer mat, ved termoneutalitet og uten ^stress1. Basal Metabolic Rate (BMR) eller basal energiforbruk hos mus kalles SMR, men hos personer som inntar og fordøyer mat under mildt termisk stress (omgivelsestemperaturer 21-22 °C)¹. Utfordringene og vanskelighetene med direkte måling av varmeproduksjon gjorde indirekte kalorimetri, nemlig beregning av varmeproduksjon fra oksygenforbruksmålinger, for å bli den mest populære tilnærmingen for å bestemme BMR. Beregning av BMR fra oksygenforbruk er mulig fordi oksidasjon av næringsstoffer ved mitokondrier for å syntetisere ATP er ansvarlig for 72% av det totale oksygenet som forbrukes i en organisme, med 8% av det totale oksygenforbruket som også forekommer i mitokondrier, men uten å generere ATP (uncoupled respirasjon)¹. De fleste av de resterende 20% av oksygenforbruket kan tilskrives næringsoksidasjon på andre subcellulære steder (peroksisomal fettsyreoksidasjon), anabole prosesser og reaktiv ^{oksygenartdannelse1}. I 1907 etablerte Lusk derfor en ligning, basert på empiriske målinger, som ble mye brukt til å omdanne oksygenforbruk og _{CO2-produksjon} til energispredning som varme. Hos mennesker står hjernen for ~ 25% av BMR, muskel-skjelettsystemet for ~ 18,4%, leveren for ~ 20%, hjertet for ~ 10%, og fettvevet for ~ 3-7%². Hos mus er vevsbidraget til BMR litt annerledes, med hjernen som representerer ~ 6,5%, skjelettmuskelen ~ 13%, leveren ~ 52%, hjertet ~ 3,7%, og fettvev ~ 5%³.

Bemerkelsesverdig er de biokjemiske reaksjonene som definerer BMR ikke løst og endres som svar på ulike behov, for eksempel eksternt arbeid (fysisk aktivitet), utvikling (vevsvekst), interne påkjenninger (motvirke infeksjoner, skader, vevsomsetning) og endringer i omgivelsestemperatur (kaldt forsvar)¹. Noen organismer rekrutterer aktivt prosesser for å generere varme i kald eksponering, noe som antyder at varme produsert av metabolisme ikke bare er et tilfeldig biprodukt. I stedet valgte evolusjonen regulatoriske mekanismer som spesifikt kunne oppregulere varmeproduksjonen ved å endre frekvensen av metabolske ^reaksjoner1. Dermed kan de samme oksygenforbruksmålingene brukes til å bestemme kapasiteten til en organisme for å generere varme som respons på kulde.

To store prosesser bidrar til varmegenerering ved kald eksponering. Den første er skjelvende, noe som genererer varme ved å øke mitokondrie oksidativ fosforylering og glykolyse i muskel for å dekke det fysiske arbeidet som gjøres ved ufrivillig muskelkontraksjon. Derfor vil kald eksponering øke oksygenforbruket i ^musklene1. Den andre er Non-Shivering Thermogenesis, som oppstår gjennom en økning i oksygenforbruket i brune og beige adipocytter (BA). Dissipasjon av energi til varme i BA formidles av mitokondrie-uncoupling protein 1 (UCP1), som gjør det mulig for proton re-entry i mitokondriematrisen, og reduserer mitokondrieprotongradienten. Dissipasjonen av mitokondrieprotongradienten fra UCP1 øker varmeproduksjonen ved forhøyelse i elektronoverføring og oksygenforbruk og energien som frigjøres ved protonspredning i seg selv uten å generere ATP (uten oppkobling). Videre kan thermogenic BA rekruttere ytterligere mekanismer som løfter oksygenforbruket uten å forårsake en stor spredning i protongradienten, ved å aktivere nytteløse oksidative ATP-syntese- og forbrukssykluser. De metabolske merdene som er beskrevet her, nemlig CLAMS-Oxymax-systemet fra Columbus Instruments, tilbyr muligheten til å måle energiforbruk ved forskjellige omgivelsestemperaturer. Men for å bestemme BA termogen kapasitet ved hjelp av oksygenforbruksmålinger i hele kroppen, må man: (1) eliminere bidraget av skjelving, og andre ikke-BA metabolske prosesser til energiforbruk, og (2) spesifikt aktivere BA termogen aktivitet in vivo. Dermed beskriver en annen protokoll hvordan du selektivt aktiverer BA in vivo ved hjelp av farmakologi hos bedøvede mus ved termoneutralitet (30 °C), med anestesi og termoneutralitet som begrenser andre ikke-BA termogene prosesser (dvs. fysisk aktivitet). Den farmakologiske strategien for å aktivere BA behandler mus med β3-adrenerge reseptoragonist CL-316,246. Årsaken er at kald eksponering fremmer en sympatisk respons som frigjør noradrenalin for å aktivere β-adrenerge reseptorer i BA, som aktiverer UCP1 og fettoksidasjon. Videre er β3-adrenerge reseptoruttrykk svært beriket i fettvev hos mus.

Protocol

Alle eksperimenter ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of California, Los Angeles (UCLA). Mus ble administrert sin diett og vann ad libitum i metabolsk bur, plassert i et temperaturkontrollert miljø (~ 21-22 eller 30 °C) med en 12h lys / mørk syklus. 8 uker gamle kvinnelige mus matet et fettfattig kosthold eller chow diett i 8 uker ble brukt til denne studien.

1. Måling av Basal Metabolic Rate (BMR)

1. Mål musens totale kroppsvekt ved hjelp av en vektskala med nøyaktighet i området 0,1 g.
   MERK: Dette må gjøres før du huser musene i metabolske bur og etter 2-3 dager med akklimatiseringsperiode til metabolske bur.
2. Mål kroppssammensetningen, inkludert fett og mager masse hos ikke-bedøvede mus, ved hjelp av et passende analysesystem for kroppssammensetning (se Tabell over materialer).
   MERK: Disse målingene er nødvendige for å bestemme energiforbruket og utføres parallelt med totale kroppsvektmålinger (trinn 1.1).
3. Sett opp metabolske bur og start akklimatiseringsperioden.
   MERK: Det metabolske merdsystemet inneholder et kabinett som gjør det mulig for brukeren å kontrollere boligtemperaturen og lyset på 12 merder (figur 1A, B). Hvert bur har en vannflaske, en mater og et rutenett (figur 1C). Rutenettet skiller musen fra bunnen av buret, slik at avføring samling. Når buret er installert på hvert forhåndsbestemte rom, inkluderer et lokk som forsegler buret vannflaskesporet, rørprøveluften, luftstrømsystemet og den fysiske aktivitetssensoren (figur 1D).
   1. Slå på temperaturkabinettet, luftstrømsystemet og datamaskinen 2 timer før du starter analysen.
   2. Etter 2 timer åpner du programvaren som kontrollerer kabinettet (se Materialliste) og luftstrømmen og lar programvaren teste datamaskinens kommunikasjon med utstyret.
      MERK: Oxymax-programvaren ble brukt til det nåværende arbeidet.
   3. Når kommunikasjonen er opprettet, klikker du på Fil og deretter Åpne eksperimentkonfigurasjon (figur 2A) og velger eksperimentkonfigurasjonen som er forhåndsutformet av leverandøren (eller konfigurert fra en tidligere analyse).
   4. Klikk på Eksperiment, og klikk deretter på Egenskaper, som åpner vinduet Egenskaper for eksperiment (figur 2B).
   5. I Egenskaper-vinduet setter du opp parametrene til miljøkabinettet, inkludert omgivelsestemperaturen (21 °C) og lyssyklusene på 12 timer.
      MERK: Hvis du holder programvaren åpen og går, kan luften strømme inn i merdene og kabinettet for å opprettholde de valgte temperatur- og lyssyklusene. Dermed kan hele systemet operere med mus inne i burene i flere dager, selv uten å måle oksygen og _CO2.
   6. Klikk på Eksperiment, klikk deretter på Oppsett, og Eksperimentoppsett-vinduet åpnes, der parametrene til hvert metabolske bur er definert.
   7. Tilordne hver muse-ID til det enkelte buret der musen er plassert (figur 2C).
   8. Inkluder den magre massen eller den totale kroppsvekten for hver mus bare hvis det ikke observeres forskjeller i kroppsvekt mellom grupper.
      MERK: Å oppnå råverdier av oksygenforbruk og energiforbruk legger til rette for ANCOVA-analyser.
   9. Sett luftstrømmen til metabolsk bur på 0,5-0,6 l/min.
   10. Velg fillagringsbanen og -navnet i eksperimenteringsoppsettvinduet. Velg sikkerhetskopikatalogen (figur 2D).
   11. Tilsett en forhåndsvektet mengde mat til matere som dekker minst matinntak i 1 dag.
       MERK: Hvis merdene har integrerte vekter, kan maten legges til direkte, og programvaren vil registrere den.
   12. Tilsett vannflaskene. Kontroller at flasken er riktig forseglet og ikke lekker.
   13. 24 timer etter tilsetning av maten, vei maten som er igjen på buret.
       MERK: Gram mat tilsatt minus gram mat igjen vil måle matinntaket.
   14. Start oksygen-, _CO2- og aktivitetsmålingene (trinn 1.4.10) når matinntaksverdiene er de samme som for mus som ligger i vanlige merder.
       MERK: Her er akklimatiseringsperioden (vanligvis 2-3 dager) fullført, og energiforbruksmålinger kan starte.
4. Indirekte kalorimetri og aktivitetsmålinger for å vurdere energiforbruk
   1. Mål kroppsvekten, fettet og den magre massen til alle mus før du starter målingene.
      MERK: Dette er kroppsvekten og lean mass-verdiene som brukes til å utføre ANCOVA-analyser.
   2. Kalibrer CLAMS-systemets _O2 - og _CO2 Zirconia-baserte detektor (se materialtabellen) med anbefalt oksygenkonsentrasjon; Kalibrer alltid detektoren på nytt før du starter et nytt eksperiment.
   3. Bruk en kalibreringsgass med kjent sammensetning (20,50 % oksygen og 0,50 % _CO2).
      MERK: Gassleverandører omtaler ofte denne gassen som "Primær standard klasse".
   4. Slå på og sørg for at tankutgangstrykket er på 5-10 psi.
   5. Åpne kalibreringsverktøyets programvare for kalibrering og testing av gasssensorene (figur 2E). Klikk på Eksperiment, og kalibrer deretter.
   6. Trykk Start. Vent deretter til sensorene er testet og at programvaren ber brukeren om å dreie knottene på gasssensoren (figur 2F) til verdien av _{O2-identiteten} er 1 (figur 2G-H). Klikk Neste når trinnet er fullført.
      MERK: Hvis kalibreringsverktøyet utfører alle gjeldende trinn, går kalibreringen automatisk videre til neste trinn når fremdriftslinjen er fylt.
   7. Kontroller kalibreringsresultatene når alle trinnene er fullført, og resultatene presenteres.
   8. Slå av kalibreringsgassen.
   9. Bytt mat og tilsett tilstrekkelig mat i en periode på 48-72 timer.
      MERK: Selv om merder kan åpnes under energiforbruksmålingene for å overvåke kroppsvekten og endre maten daglig, kan mus understrekes av disse manipulasjonene, og målinger går tapt når merdene åpnes. Dermed anbefales det å unngå manipulering i løpet av måleperioden.
   10. I programvaren klikker du på Eksperiment og deretter Kjør for å starte oksygen_{-, CO2} - og aktivitetsmålingene (figur 3A).
       MERK: Utførelsen av målingene kan spores i sanntid i en boks nederst til venstre i programvaren (rødt rektangel, figur 3B). Det røde rektangelet i figur 3B viser at systemet måler merd #1 i intervall #3, nemlig den tredje målingen. En måling i ett bur kan ta ca 1 min. Således, med 12 merder tilkoblet, kan oksygenforbruket måles omtrent hver 12 min. Kontinuerlige målinger i minst 48 timer anbefales.
   11. Stopp eksperimentet ved å klikke Eksperimenter og deretter Stopp (figur 3C).
   12. Åpne burene, vei musene og maten. Samle avføring for å beregne antall kalorier og lipider utskilt over 48-72 h målinger perioden.
       MERK: Avføring kan oppbevares ved -20 °C for senere analyser. Disse burene kan ikke effektivt brukes til å samle urin.
   13. Klikk på Eksperimenter, eksporter og eksporter alle emner som en CSV-fil (figur 3D).
       MERK: For å lette ANCOVA-analyser er det viktig å eksportere rå oksygenforbruksverdier (_VO2) og _{CO2-produksjonsverdier} (_VCO2) uten å bli normalisert av kroppsvekten.
5. Dataanalyse og kvalitetskontroll
   1. I det eksporterte CSV-arket (figur 3D) (fra trinn 1.4.13) bruker du råverdiene for oksygenforbruket (_VO2) og _{CO2-produksjonen} (VCO2) målt hver 12.
      MERK: _VO2 - og _VCO2-verdier korrigeres automatisk hvis kroppsvekt eller lean-masseverdier legges til.
   2. I det eksporterte CSV-arket bruker du råverdiene til respirasjonsutvekslingsforholdet (RER: _VCO2/_VO2) som automatisk beregnes og føres opp av programvaren i henhold til tidsstempelet.
      MERK: Verdier nær 1 viser at musen primært oksiderer karbohydrater, mens verdier nærmere 0,7 representerer at musen hovedsakelig oksiderer fett. RER over 1 kan oppstå under anaerob trening, da kroppen utviser mer _CO2 for å kompensere for acidose forårsaket av laktat. RER høyere enn 1 kan indikere stress. Den eksporterte CSV-filen inneholder også råverdiene fra Energiutgifter (EE) eller Varmeproduksjon i kalorier per minutt per mus, målt hvert 12. Her inkluderer alle de oppførte verdiene et tidsstempel.
   3. Siden det kreves enkle EE-verdier per mus for en ANCOVA, registreres gjennomsnittlig EE-verdiene mellom 09:00-16:00 for lysfasen (dag) og 19:00-04:00 for den mørke fasen (natt) per mus og dag.
      MERK: Dette kan gjøres manuelt ved hjelp av Excel eller Graph Pad. Hvis du velger disse togangsvinduene, unngås gjennomsnittet av de mellomliggende, gradvise og ustabile EE-verdiene som er knyttet til den lyse, mørke faseovergangen.
   4. I en periode på 48 timer beregner du gjennomsnittet av de to dagslysverdiene og de to mørke faseverdiene per mus ved hjelp av Excel eller Graph Pad.
   5. Hvis du vil kvantifisere den totale fysiske aktiviteten, bruker du Excel eller Graph Pad til å summere antall x-, y- og z-stråleskift målt i metabolske bur og oppført i CSV-filen for hver mus.
      MERK: Den totale aktiviteten x,y,z beregnes ved først å gjøre gjennomsnittsverdien av hver X, Y, Z per mus og syklus. Deretter bestemmes summen av hver gjennomsnittlige X-, Y-, Z-verdi per mus og syklus for å tegne inn dataene som i figur 5E (som gjennomsnittet på 2 dager).
   6. Alternativt kan du representere dataene som viser hver målingsverdi over tid, noe som genererer kurver som illustrerer endringene i EE under overgangen fra lyse til mørke sykluser.
      MERK: Se diskusjonsseksjonen om hvordan og når ANCOVA-analyser skal utføres, og de ulike formlene som brukes til å beregne _VO2, _VCO2 og EE finnes i Tilleggsfil 1.

2. Måling av kapasiteten til termogene adipocytter for å bruke energi

1. Sett opp målinger og musebehandlinger. Se trinn 1 for detaljer om de eksperimentelle preparatene for å overvåke oksygenforbruket, da termogene kapasitet i adipocytter bestemmes indirekte av oksygenforbruket ved å følge trinn 2.1.1-2.2.2.
   MERK: Denne protokollen krever musebedøvelse og akutt behandling med beta-3-reseptoragonisten CL-316,243 (se materialfortegnende tabell), noe som gir en rask vurdering av BA-termogen kapasitet.
   1. Utfør kroppssammensetningsanalyse og vei musene. Slå på CLAMS, sett opp temperaturen ved 30 °C (termoneutralitet), og vent i 2 timer til hele systemet varmes opp.
   2. Sett opp resten av analyseforholdene, inkludert lys, tilordne muse-ID til hvert bur og legg til kroppsvektsverdi for hver mus i det tilsvarende buret hvis det ikke observeres noen forskjell i kroppsvekt mellom grupper.
   3. Kalibrer oksygen-/_{CO2-detektoren} som i trinn 1.4.2-1.4.7.
   4. Start eksperimentet i programvaren.
   5. Injiser hver mus med pentobarbital (60-120 mg/kg) og legg hver mus i deres tildelte metabolske bur (trinn 2.1.2).
      MERK: Dosen av pentobarbital som kreves for å opprettholde mus som sover ved termoneutalitet (30 °C), varierer med musestammen og genotypen. Det anbefales å teste forskjellige pentobarbital doser fra 50 til 120 mg / kg og valgte den som holder musen bedøvet i løpet av 2-3 timer ved 30 °C. Effektiv anestesi er avgjørende for å fjerne bidraget av fysisk aktivitet til energiforbruket.
   6. For å sikre anestesi, observere mus etter pentobarbital injeksjon til de sover helt og deres reduserte oksygenforbruk blir stabil.
   7. Vent med å oppnå minst 3 stabile påfølgende oksygenforbruk før du injiserer CL-316,243.
      MERK: Mens du venter på stabilisering av oksygenforbruket, klargjør du sprøytene med CL-316 243 for hver mus (1 mg/kg).
   8. Åpen bur #1 og injiser CL-316,243 subkutant umiddelbart etter at en _VO2 - og _VCO2-måling forekom i merd #1. Returner musen til bur #1 umiddelbart etter injeksjon.
      MERK: Målinger angis i sanntid i nederst til venstre i programvaren (figur 3B, rødt rektangel).
   9. Vent til bur #2 måles (figur 3B, rødt rektangel) og fortsett deretter som i trinn 2.1.8 for merd #2.
      MERK: Injisering av CL-316 243 umiddelbart etter en måling gjør det mulig å opprettholde tidskonstanten mellom injeksjoner. For eksempel, hvis det er 12 mus / bur som kjører, med målinger samlet i individuelle bur sekvensielt og samlingen som varer 55 s per bur, bør du injisere en mus hvert minutt. Med disse injeksjonshastighetene vil den første målingen skje etter 12 minutter etter injeksjon i alle 12 merder.
   10. Fortsett energiforbruksmålingene til energiforbruket verdsetter platå for 5-6 påfølgende målinger, vanligvis 90-180 min etter injeksjon.
       MERK: Mus kan våkne opp fra anestesi under forsøkene. Disse musene må fjernes fra analysen. Derfor vil testing av pentobarbital doser på forhånd øke effektiviteten i studiene.
   11. Stopp energiforbruksmålingene, men hold musene i burene ved 30 °C, til de våkner.
   12. Etter at musene er helt våken, inspiser musenes helse og returner dem til deres første bur.
   13. Eksporter dataene for hver mus som en CSV-fil ved hjelp av utstyrsprogramvaren, som beskrevet i avsnitt 1.4.13.
2. Dataanalyse
   MERK: Dataanalysen ble utført av Excel eller Graphpad
   1. Plott de 3-5 påfølgende verdiene til _VO2, _VCO2 og EE som er stabile og konstante over tid, da dette er verdiene som representerer metabolsk hastighet når mus er fullstendig bedøvet.
   2. Deretter plotter du inn den første og følgende påfølgende _VO2-, _VCO2- og EE-målingene som er oppnådd etter injeksjon.
      MERK: De absolutte verdiene til EE og foldøkningen i EE indusert ved injeksjon indikerer BA termogen ^funksjon7.

Representative Results

Figur 4 viser _VO2, VCO2, Varmeproduksjon/Energiutgifter (EE), Respirasjonsutvekslingsforhold (RER) og X, Y, Z fysiske aktivitetsverdier oppnådd ved hjelp av de metabolske merdene i CLAMS-systemet. VO2 og _VCO2 levert av CLAMS-systemet er volumet av gass (ml) per minutt og kan allerede deles av kroppsvekten eller de magre masseverdiene ved å angi disse vektverdiene i CLAMS-programvaren før du starter målingene. Kroppsvektsverdier må imidlertid ikke angis hvis forskjeller i kroppsvekt mellom grupper av mus observeres, da ANCOVA-analyse er nødvendig og Oxymax-programvaren ikke kan utføre disse beregningene. Energiforbruket (varme) beregnes i kcal/t ved hjelp av Lusk-ligningen. Mus er nattlige og bruker mer energi i løpet av natt/ mørk periode, noe som betyr at energiforbruksberegninger må skilles i henhold til lyssyklusen. Som forventet har mus i den mørke fasen høyere _O2-forbruk, _{CO2-produksjon} og dermed høyere EE, som vist i figur 4C. Mus på et vanlig kosthold og i matet tilstand, med matinntak som forekommer i den mørke syklusen, er preget av RER-verdier nær 1 (figur 4D), noe som betyr en preferanse for å bruke karbohydrater. Under lyssyklusen, når mus for det meste sover og dermed fort, er det et skifte til fettoksidasjon, med RER-verdier nærmere 0,7. Følgelig øker fysisk aktivitet, målt som x,y,z laserstrålebrudd, under den mørke fasen og avtar i lysfasen (figur 4E).

Vi sammenlignet 16 uker gamle kvinnelige mus matet et fettfattig kosthold (8 uker) med chow-matede mus, slik at sammenligningen av energiforbruk mellom grupper av mus med forskjeller i kroppsvekt. Som forventet øker fettfattig diettfôring fettmassen uten å endre magermassen (figur 5A-C). Fettfattige diettfôrede mus spiste mer Kcal/dag, hovedsakelig på grunn av høyere kaloritetthet per gram mat (figur 5D). I tillegg var fysisk aktivitet lik mellom chow og fettfattige diettfôret mus, selv i den mørke perioden (figur 5E). De lavere verdiene av RER viser preferansen til fettfattige diettfôrede mus for å bruke fett som det primære substratet for oksidasjon, som forventet med høyere fettinntak og muskelinsulinresistens (figur 5F). Oksygenforbruket øker hos fettfattige diettfôrede mus, men ikke _{CO2-produksjon} (figur 5G-H). Økningen i oksygenforbruket hos fettfattige diettfôrede mus ledsages av en betydelig økning i varmeproduksjon/energiforbruk per mus (figur 5I). Å dele energiforbruket med den magre massen til hver mus førte imidlertid til ingen forskjeller i energiforbruket (figur 5J), mens deling av total kroppsvekt viste en reduksjon i energiforbruket hos fettfattige diettfôrede mus (figur 5K). Akkumulert indikerer disse resultatene at deling av energiforbruksdata med mager masse eller total kroppsvekt kan føre til motsatte konklusjoner om effekten av fettfattig diettfôring på energiforbruket. Som antydet av flere studier, gjør analysen av kovarians (ANCOVA) det mulig å avgjøre om forskjeller i energiforbruk eksisterer uavhengig av endringene i kroppsvekt. For å illustrere dette punktet ble det utført en ANCOVA-analyse ved hjelp av de samme dataene som er vist i figur 5A-K, der energiforbruket er den avhengige variabelen og kroppsvekten eller mager masse som kovariatene. Mens du utfører ANCOVA ved hjelp av total kroppsvekt som kovariat viser bare en trend for fettfattige diettfôrede mus å ha høyere energiforbruk (figur 5L), viser de fettfattige diettfôrede musene en betydelig økning i energiforbruket når mager masse brukes (figur 5M). Disse dataene tyder på at bruk av total kroppsvekt for å utføre ANCOVA-analyser kan undervurdere ^{energiforbruket4}. Årsakene kan være at: (1) fettvev bare bidrar til ~ 5% av totale energiforbruk og (2) gevinsten av fettmasse indusert av fettfattig diettfôring skyldes hovedsakelig en utvidelse av triglyseridinnhold i adipocytter, i stedet for fra en økning i antall oksidative termogene adipocytter.

Brune og beige adipocytter (BA) bidrar til termogenese og dermed til energiforbruk hos gnagere. Bas bidrag til energiforbruket i vivo kan ikke bestemmes bare ved å måle oksygenforbruket i hele kroppen og beregne BMR, ettersom flere vev bruker oksygen. Tilnærmingen til å bestemme BA termogen kapasitet in vivo innebærer anestesi først, som er nødvendig for å begrense oksygenforbruket i alle vev. Deretter kombineres anestesi med en farmakologisk tilnærming for å aktivere termogenese, for det meste i termogen BA. Siden beta-3 adrenerge reseptorer primært uttrykkes i fettvev, kan beta-3 adrenerge agonist CL-316,243 brukes til å aktivere BA termogen funksjon. I tillegg kan de bedøvede musene plasseres i et temperaturkontrollert kabinett ved 30 °C, for å forhindre ukontrollert sympatisk BA-aktivering forårsaket av termisk stress i omgivelsene. Figur 6 viser at mus matet et fettfattig kosthold bedøvet med pentobarbital og plassert i metabolske merder ved 30 °C, for å registrere energiforbruk ved substandard metabolsk hastighet (figur 6A-C,D). Denne målingen ble etterfulgt av CL-316 243 injeksjon, som økte oksygenforbruket, _{CO2-produksjonen} og energiforbruket, som forventet fra BA-aktivering (figur 6A-C). En 2-3 ganger økning i energiforbruket etter beta-3 agonistbehandling kan ^påvises7.

Figur 1: De metabolske merdene med miljøinnhegning og montering av individuelle metabolske merder. (A) De metabolske merdene i miljøkabinettet. (B) Kabinettet kan huse 12 metabolske bur og tillater kontroll av temperatur og lys. (C) Komponenter i metabolske bur før montering. (D) Metabolske bur forseglet med lokket. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Eksperimentelt oppsett og kalibrering av oksygensensoren. (A) Et skjermbilde av Oxymax-programvaren som kontrollerer metabolske bur, viser valg og åpning av et "Eksperimentell konfigurasjon" -vindu for å angi (B) eksperimentelle egenskaper, nemlig omgivelseslys og temperatur. Deretter konfigureres eksperimentet ved hjelp av (C) "Experimental Setup" -vinduet for å tilordne en muse-ID, kroppsvekt eller mager masse til hvert bur, samt luftstrømmen for de 12 burene. (D) I samme "Experimental Setup" -vindu kan en filbesparende bane velges. (E) For å kalibrere gasssensoren må brukeren dreie knotten på (F) gassdetektoren for å justere (G-H) _{O2-identiteten} til 1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Start og stopp av målingene. (A) Eksperimentet startes ved å klikke på «Eksperiment», deretter «Kjør». (B) Brukerne kan se, i sanntid, hvilken av de 12 merdene som for tiden måles (rødt rektangel), samt en tabell med målingene som allerede er samlet inn. (C) Eksperimentet kan stoppes ved å klikke på "Eksperiment", deretter "Stopp". (D) Dataene kan eksporteres til Excel ved å klikke på "Fil", deretter "Eksporter", og deretter "Eksporter alle emner CSV." Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Oppnådde metabolske parametere. (A) Oksygenforbruk. (B) _{CO2-produksjon} . (C) Energiforbruk (EE) normalisert til mager masse. (D) Respirasjonsutvekslingsforhold (RER). (E) Fysiske aktivitetsnivåer beregnes som summen av X, Y, Z laserstrålebrudd teller. Data viser gjennomsnittlig ± SEM. Studentens t-test, **P < 0,01, ***P < 0,001. n = 7-8 kvinnelige mus per gruppe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: ANCOVA-analysen tillater passende tolkning av endringer i energiforbruket hos overvektige mus. (A-M) Målinger hos kvinnelige mus matet enten en chow eller fettfattig diett (HFD) i 8 uker. (A) Kroppsvekt. (B) Fettmasse. (C) Mager masse. (D) Matinntak. Studentens t-test, ***P < 0,001. (E) Fysisk aktivitet ble vurdert med metabolske merder som telling av laserstrålebrudd i X, Y, Z. (F) Respiratorisk koeffisientforhold (RER). (G) Oksygenforbruk (_VO2). (H) _{CO2-produksjon} (VCO2). (I) Energiutgifter (EE) ble målt ved indirekte kalorimetri. Energiforbruket ble normalisert til (J) Lean mass og (K) kroppsvekt. *P < 0,05 ved hjelp av Two-ANOVA. **P< 0,01, ***P< 0,001. (L) Kovariatanalyse (ANCOVA) av energiforbruk (EE) om natten kontra total kroppsvekt eller (M) mager masse. Stiplede linjer representerer de gjennomsnittlige kroppsvektsverdiene som er modellert for å bestemme _VO2 og EE i hver gruppe. *P < 0,05 ved bruk av ANCOVA. n = 7-8 kvinnelige mus per gruppe. Data viser bety ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6: Den selektive β3-agonisten CL-316 243 øker energiforbruket i bedøvede mus ved termoneutralitet. Kvinnelige mus ble bedøvet med pentobarbital (60 mg/kg) og plassert i metabolske bur satt til 30 °C. Energiutgifter under anestesi ble registrert inntil 3 påfølgende målinger viste de samme verdiene, noe som gjenspeiler fullstendig anestesi. Musen fra bur #1 ble injisert med CL-316,243 (1 mg/kg) umiddelbart etter en oksygenforbruksmåling. Den samme injeksjonsmetoden ble brukt i de andre merdene for å sikre at det samme tiden gikk mellom injeksjon og den første målingen hos alle mus. (A) Oksygenforbruk. (B) _{CO2-produksjon} . (C) Energiforbruk. n = 4 kvinnelige mus. Data viser bety ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfil 1: Formler som brukes av Oxymax programvare i CLAMS-systemet for å beregne oksygenforbruk, CO2-produksjon og energiforbruk.

Discussion

Indirekte kalorimetri har blitt brukt i årevis for å vurdere energiforbruket i hele ^kroppen4. Denne protokollen beskrevet heri gir en enkel metode for å måle basal metabolske rate og bestemme BA thermogenic kapasitet in vivo ved hjelp av metabolske bur.

Den indirekte kalorimetrimetoden som er beskrevet her, bekrefter at det kan være misvisende å dele energiutgiftsverdier etter kroppsvektsverdier. For eksempel kan det konkludere med at energiforbruket er systematisk lavere i alle musemodeller med fedme. Imidlertid kan de totale energiutgiftene være høyere i noen musemodeller av fedme, som i tilfelle en økning i matinntaket som fører til fedme. Derfor vil deling av energiforbruket med fettmasse alltid føre til en feiltolkning av prosessen som er ansvarlig for fedme hos overvektige mus uten primære feil i energiforbruket. I tillegg er det også upassende å dele med mager masse når endringer i mager masse oppstår, da mager masseko-varierer med energiforbruket, og energiforbruket kan vise en mer betydelig nedgang enn noen endring i mager masse. Dette betyr at oppdeling av energiforbruk etter kroppsvekt eller mager masse bare kan utføres hvis det ikke observeres endringer i kroppsvekt eller kroppssammensetning (dvs. mager masse og fettmasse) mellom de testede gruppene. Som en konsekvens er den sikreste tilnærmingen å utføre ANCOVA. Dette emnet har blitt mye diskutert i gode artikler, alle konkluderer med at en analyse av kovarians (ANCOVA) er avgjørende for å sammenligne energiforbruk mellom grupper av mus med forskjeller i total kroppsvekt eller mager ^masse4,5. Her ble SigmaPlot brukt til å utføre ANCOVA-analyser internt, men mange andre avanserte statistiske analyseprogrammer kan brukes. CalR-nettstedet gjør det mulig å laste opp data i en av malene deres, men det er kanskje ikke alltid mulig avhengig av eksperimentell ^design5. Å ha statistisk programvare for å utføre ANCOVA "internt" gir mer fleksibilitet på dataanalyse og presentasjon, men det er mer tidkrevende6.

Termoneutralitet for mus er rundt 30 °C, noe som undertrykker aktiviteten til termogene brune og beige adipocytter (BA)¹. Omgivelsestemperaturen (21 °C) er under termoneutralitet, noe som betyr at BA-termogenese vil bidra til energiutgifter hos mus ved 21 °C. Så forskjellen i energiforbruk mellom mus ved omgivelsestemperatur vs. mus ved termoneutralitet kan brukes til å bestemme BA's bidrag til energiforbruket på en mindre invasiv måte. Denne prosedyren krever imidlertid kontinuerlig bruk av kabinettet ved 30 °C i 4 uker, med termoneutralitet som også forårsaker forskjeller i fysisk aktivitet. I tillegg induserer termoneutralitet metabolske endringer i andre vev, ikke bare i BA. I en kontekst der hovedmålet er å studere endringer i BA termogen kapasitet, har den farmakologiske tilnærmingen beskrevet her en liste over fordeler i forhold til boligmus ved termoneutralitet over lang tid.

Resultatene oppnås om få timer, og anestesi undertrykker bidraget av fysisk aktivitet og andre atferdsendringer i energiforbruket. Ved vurdering av effekten av genetiske manipulasjoner hos mus, kan metabolismen endres i BA og andre vev. Dermed er CL-316,243 behandling hos bedøvede mus tilnærmingen som kan skjelne endringer i BA-aktivitet med høyere dynamisk område og spesifisitet, med færre konfundenter fra energiforbruk som stammer fra andre vev. Alternativt kan CL-316,243 injiseres hos bevisste mus, da systemet kan måle fysisk aktivitet. Derfor, hvis en endring i fysisk aktivitet oppstår, kan den estimeres og ^{kontrolleres5}. I sum, mens anestesi kan gi det høyeste dynamiske området, kan målinger gjøres uten anestesi om nødvendig, da fysisk aktivitet kan overvåkes.

Ved bruk av metabolske bur må det tas forsiktighet med hensyn til musstress, og riktig gjenoppretting er nødvendig. Den sosiale isolasjonen av individuelle boliger og det nye miljøet i det metabolske buret stresser musene, noe som resulterer i redusert matinntak og vekttap. Dermed må matinntak og kroppsvekt overvåkes hver 24. Mus gjenoppretter normalt matinntak 48-72 timer etter å ha plassert dem i metabolsk bur. Som et resultat starter kalibrerings- og oksygenforbruksmålinger når matinntaket gjenopprettes. Til tross for at det metabolske merdsystemet er på, utføres ikke kalibrering og tiltak i løpet av denne akklimatiseringsperioden, som per definisjon må BMR oppnås i en stressfri mus. Unngå målinger i denne perioden øker detektorens levetid og reduserer bruken og forbruket av Drierite (som fanger vann for å forhindre oksygendetektorskade). Nyere og dyrere systemer brukte hjemme-merdbaserte målinger, noe som reduserer stress.

ANCOVA-analyser
En ANCOVA (analyse av kovarians) er nødvendig ved sammenligning av energiforbruk mellom to grupper mus med forskjeller i ^kroppsvekt4. Årsaken er at en økning i mager masse vil øke energiforbruket. ANCOVA tester om energiforbruket er statistisk signifikant endret mellom grupper, uavhengig av forskjeller i kroppsvekt og mager masse. ANCOVA oppnår det ved å avgjøre om energiforbruket var forskjellig hvis begge gruppene hadde samme kroppsvekt eller mager masse. For å beregne energiforbruket med samme kroppsvekt/mager masse ved hjelp av ANCOVA, må imidlertid sammenhengen mellom kovariat (kroppsvekt/mager masse) og variabel (energiforbruk) være lik mellom gruppene. Likheten i denne korrelasjonen testes ved hjelp av Levenes test for likhet med ^varians5.

ANCOVA krever bruk av mer avansert statistisk analyseprogramvare, for eksempel SigmaPlot. Alternativt kan forskjellige gratis nettsteder ^brukes5. Hvis ANCOVA viser at effekten observert mellom grupper ikke avhenger av verdien av kovariat (kroppsvekt / mager masse), vil programvaren teste om gjennomsnittet av variabelen (energiforbruk, _VO2, _VCO2) er forskjellig mellom gruppene ved en lignende kovariat (kroppsvekt / mager masse). Programvaren vil tilby å gjøre flere sammenligninger med en foreslått statistisk test. Hvis statistisk signifikans nås, vil det bekrefte at energiforbruket er betydelig forskjellig mellom de to gruppene mus til en gitt kroppsvektsverdi. Regresjonsligningen for modellen for like bakker kan hentes fra analysen, som kan brukes i GraphPad eller annen grafisk programvare for å generere en graf for ^publisering6.

Endringer og feilsøking
CLAMS-systemet som brukes i denne protokollen, består av små bur som er svært forskjellige fra hjemmeburene som mus er vant til, som inkluderer sengetøy. I tillegg er mus sosiale dyr, og behovet for å huse dem individuelt, sammen med et nytt bur uten sengetøy, forårsaker innledende stress for musene. Dermed er det nødvendig med en akklimatisering på minst 2 dager for å tillate mus å tilpasse seg sine nye miljøer og redusere stress. Vanligvis kommer matinntaket tilbake til det som ble registrert i deres hjemmebur på den tredje dagen. Denne akklimatiseringsperioden er unødvendig å vurdere BA-kapasitet til å bruke energi, da den utføres hos bedøvede mus.

Pentobarbital er et kortvirkende barbiturat som kan brukes som beroligende eller bedøvelsesmiddel, men det brukes også til eutanasi ved høyere doser. Av en ukjent grunn ble det noen ganger lagt merke til at effekten av pentobarbital ved 30 °C er forskjellig fra ved omgivelsestemperatur. Derfor anbefales det å teste forskjellige pentobarbitale doser i musemodellen ved termoneutralitet. De viktigste bivirkningene av pentobarbital inkluderer respirasjonsdepresjon og kardiovaskulære effekter, for eksempel redusert blodtrykk, slagvolum og ^hypotensjon8.

Begrensninger
Beta3-adrenerge reseptorer uttrykkes i fettvev og kan påvises i myokardiet, netthinnen, galleblæren, hjernen, urinblæren og ^blodårene9. Som sådan kan CL-316,243 potensielt øke energiforbruket i disse andre vevene der reseptoren uttrykkes. Det ble imidlertid demonstrert at mesteparten av energiforbruket forårsaket av CL-316,243 i kontrollmus er UCP-1 avhengig, et BA-spesifikt ^protein10,11. Det må tas i betraktning at noen genetiske modifikasjoner kan forverre handlingene til CL-316,243 i andre vev. I tillegg kan brøkdelen av UCP1 uavhengig åndedrett fortsatt drives av ATP-konsumerende nytteløse sykluser beskrevet i aktivert fettvev.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CLAMS-Oxymax System	Columbus Instruments	CLAMS-center feeder-ENC	Including enviromental enclosure and Zirconia oxygen sensor
Desktop PC with Oxymax Software	HP/Columbus	N/A	PC needed to be purchased separately
Drierite jug (Calcium Sulfate with Cobalt Chloride Indicator)	Fisher Scientific	23-116681	Needed to dry the gas entering the oxygen sensor, humidity can damage the sensor
NMR for body composition	Echo-MRI	Echo-MRI 100	Measure lean and fat mass in alive mice. It is necessary for ANCOVA analyses.
CL-316-243	Sigma	C5976	Injected to the mice subcutaneously to activate thermogenesis
High fat diet	Research Diets	D12266B	Provided to the mice prior and during measurements
Pentobarbital/Nembutal	Pharmacy at DLAM	N/A	Anesthesia for the mice
Primary standard grade gas (tank and regulator)	Praxair	NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590	20.50% Oxygen, 0.50% CO2 balanced with nitrogen used for calibration