Bestemmelse af basalenergiudgifter og de termogeniske adipocytters evne til at forbruge energi i overvægtige mus

Summary

Dette manuskript beskriver en protokol til måling af den basale stofskifte og den oxidative kapacitet af termogeniske adipocytter hos overvægtige mus.

Abstract

Målinger af energiforbrug er nødvendige for at forstå, hvordan ændringer i stofskiftet kan føre til fedme. Basal energiforbrug kan bestemmes i mus ved at måle hele kroppen iltforbrug, _{CO2-produktion} , og fysisk aktivitet ved hjælp af metaboliske bure. Termogeniske brune/beige adipocytter (BA) bidrager væsentligt til gnaverenergiudgifterne, navnlig ved lave omgivelsestemperaturer. Her er målinger af basale energiforbrug og den samlede BA-kapacitet til at bruge energi på overvægtige mus beskrevet i to detaljerede protokoller: den første, der forklarer, hvordan analysen skal opsættes til måling af basale energiforbrug ved hjælp af analyse af kovarians (ANCOVA), en nødvendig analyse, da energiforbruget varierer med kropsmasse. Den anden protokol beskriver, hvordan ba-energiforbrugskapacitet in vivo måles hos mus. Denne procedure indebærer anæstesi, der er nødvendig for at begrænse udgifter forårsaget af fysisk aktivitet, efterfulgt af injektion af beta3-adrenergic agonist, CL-316,243, som aktiverer energiforbruget i BA. Disse to protokoller og deres begrænsninger er beskrevet i tilstrækkelig detaljer til at muliggøre et vellykket første eksperiment.

Introduction

Metabolisme kan defineres som integration af de biokemiske reaktioner, der er ansvarlige for næringsstofoptagelse, opbevaring, transformation og nedbrydning, som celler bruger til at vokse og udføre deres funktioner. Metaboliske reaktioner omdanne energi indeholdt i næringsstoffer til en form, der kan bruges af celler til at syntetisere nye molekyler og udføre arbejde. Disse biokemiske reaktioner er i sagens natur ineffektive i at omdanne denne energi til en brugbar form til at opretholde ^livet1. En sådan ineffektivitet resulterer i energiafledning i form af varme, hvor denne varmeproduktion anvendes til at kvantificere standard metabolic rate (SMR) af en ^organisme1. Standardtilstanden blev klassisk defineret som varmeproduktion, der forekom hos en vågen, men hvilende voksen, ikke indtagelse eller fordøje mad, ved termoneutralitet og uden ^stress1. Basal metabolic rate (BMR) eller basal energiforbrug hos mus kaldes SMR, men hos personer, der indtager og fordøjer fødevarer under mild termisk stress (omgivelsestemperaturer 21-22 °C)¹. Udfordringerne og vanskelighederne ved direkte at måle varmeproduktionen gjorde indirekte kalorimetri, nemlig beregning af varmeproduktion fra målinger af iltforbrug, til at blive den mest populære tilgang til bestemmelse af BMR. Beregning af BMR fra iltforbrug er mulig, fordi oxidation af næringsstoffer af mitokondrier til at syntetisere ATP er ansvarlig for 72% af den samlede ilt forbruges i en organisme, med 8% af det samlede iltforbrug også forekommer i mitokondrier, men uden at generere ATP (ukoblet respiration)¹. Størstedelen af de resterende 20% af den ilt, der forbruges, kan tilskrives næringsoxidation på andre subcellulære steder (peroxisomal fedtsyreoxidation), anabolske processer og reaktiv ^{iltartdannelse1}. Således, i 1907, Lusk etableret en ligning, baseret på empiriske målinger, udbredt til at omdanne iltforbrug og _{CO2-produktion} til energiafledning som varme. Hos mennesker, hjernen tegner sig for ~ 25% af BMR, bevægeapparatet for ~ 18,4%, leveren for ~ 20%, hjertet for ~ 10%, og fedtvæv for ~ 3-7%². Hos mus er vævsbidraget til BMR lidt anderledes, med hjernen repræsenterer ~ 6,5%, skeletmusklen ~ 13%, leveren ~ 52%, hjertet ~ 3,7% og fedtvæv ~ 5%³.

Bemærkelsesværdigt er de biokemiske reaktioner, der definerer BMR, ikke faste og ændrer sig som reaktion på forskellige behov, såsom eksternt arbejde (fysisk aktivitet), udvikling (vævsvækst), indre belastninger (modvirkende infektioner, skader, vævsomsætning) og ændringer i omgivelsestemperaturen (koldt forsvar)¹. Nogle organismer rekrutterer aktivt processer til at generere varme i kold eksponering, hvilket indebærer, at varme produceret af metabolisme ikke bare er et utilsigtet biprodukt. I stedet, evolution udvalgte reguleringsmekanismer, der specifikt kunne upregulate varmeproduktion ved at ændre hastigheden af metaboliske ^reaktioner1. Således kan de samme iltforbrugsmålinger bruges til at bestemme en organismes evne til at generere varme som reaktion på kulde.

To store processer bidrager til varmeproduktion ved kold eksponering. Den første er kuldegysninger, som genererer varme ved at øge mitokondrie oxidativ fosforylering og glykolyse i musklen til at dække det fysiske arbejde udført af ufrivillig muskelsammentrækning. Derfor vil kold eksponering øge iltforbruget i ^musklerne1. Den anden er ikke-rystende termogenese, som opstår gennem en stigning i iltforbruget i brune og beige adipocytter (BA). Spredning af energi til varme i BA medieres af mitokondrieafkoblingsprotein 1 (UCP1), som gør det muligt for proton genindtræden i mitokondriematrixen, hvilket reducerer mitokondrie protongradienten. Spredningen af mitokondrie proton gradient af UCP1 øger varmeproduktionen ved højden i elektron overførsel og iltforbrug og den energi, der frigives af proton spredning i sig selv uden at generere ATP (frakoblet). Desuden kan termogen BA rekruttere yderligere mekanismer, der hæver iltforbruget uden at forårsage en stor spredning i protongradienten ved at aktivere forgæves oxidative ATP-syntese- og forbrugscyklusser. De metaboliske bure, der er beskrevet her, nemlig CLAMS-Oxymax-systemet fra Columbus Instruments, giver mulighed for at måle energiforbruget ved forskellige omgivelsestemperaturer. For at bestemme BA's termogeniske kapacitet ved hjælp af målinger af hele kroppens iltforbrug skal man imidlertid: (1) eliminere bidraget fra kulderystelser og andre ikke-BA-metaboliske processer til energiforbrug og (2) specifikt aktivere BA-termogen aktivitet in vivo. En anden protokol beskriver således, hvordan BA in vivo selektivt aktiveres ved hjælp af farmakologi i bedøvede mus ved termoneutralitet (30 °C), med anæstesi og termoneutralitet, der begrænser andre ikke-BA termogeniske processer (dvs. fysisk aktivitet). Den farmakologiske strategi for aktivering af BA behandler mus med den β3-adrenergic receptor agonist CL-316,246. Årsagen er, at kold eksponering fremmer en sympatisk reaktion frigive noradrenalin at aktivere β-adrenergic receptorer i BA, som aktiverer UCP1 og fedt oxidation. Desuden er β3-adrenergic receptor udtryk højt beriget i fedtvæv hos mus.

Protocol

Alle eksperimenter blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved University of California, Los Angeles (UCLA). Mus blev administreret deres kost og vand ad libitum i metaboliske bur, til huse i et temperaturstyret miljø (~ 21-22 eller 30 °C) med en 12h lys / mørk cyklus. 8 uger gamle hunmus fodret med en fedtrig kost eller chow kost i 8 uger blev brugt til denne undersøgelse.

1. Måling af basal stofskifte (BMR)

1. Mål musens samlede kropsvægt ved hjælp af en vægtskala med nøjagtighed i området 0,1 g.
   BEMÆRK: Dette skal gøres, før musene placeres i metaboliske bure og efter de 2-3 dage med akklimateringsperiode til metaboliske bure.
2. Mål kropssammensætningen, herunder fedt og mager masse i mus, der ikke er bedøvet, ved hjælp af et passende kropssammensætningsanalysesystem (se Materialetabel).
   BEMÆRK: Disse målinger er nødvendige for at bestemme energiforbruget og udføres parallelt med de samlede kropsvægtmålinger (trin 1.1).
3. Opret de metaboliske bure og start akklimatationsperioden.
   BEMÆRK: Det metaboliske buresystem indeholder et kabinet, der giver brugeren mulighed for at styre hustemperaturen og lyset fra 12 bure (figur 1A,B). Hvert bur har en vandflaske, en feeder og et gitter (Figur 1C). Gitteret adskiller musen fra bunden af buret, så afføring indsamling. Når buret er installeret på hvert forudbestemt rum, omfatter et låg, der forsegler buret, vandflaskeåbningen, slangeprøveudtagningsluften, luftstrømssystemet og den fysiske aktivitetssensor (figur 1D).
   1. Tænd for temperaturkabinettet, luftstrømssystemet og computeren 2 timer, før analysen startes.
   2. Efter 2 timer skal du åbne den software, der styrer kabinettet (se Materialetabel) og luftstrømmen, og lad softwaren teste computerens kommunikation med udstyret.
      BEMÆRK: Oxymax software blev brugt til det nuværende arbejde.
   3. Når kommunikationen er etableret, skal du klikke på Filer og derefter åbne eksperimentkonfiguration (Figur 2A) og vælge den eksperimentkonfiguration, der er foruddefineret af leverandøren (eller konfigureret fra en tidligere analyse).
   4. Klik på Eksperimentér, og klik derefter på Egenskaber, som åbner vinduet Eksperimentegenskaber (figur 2B).
   5. I vinduet Egenskaber skal du konfigurere parametrene for miljøkabinettet, herunder omgivelsestemperaturen (21 °C) og 12 timers lyscyklusser.
      BEMÆRK: At holde softwaren åben og køre gør det muligt for luft at strømme ind i burene og kabinettet for at opretholde de valgte temperatur- og lyscyklusser. Således kan hele systemet fungere med mus inde i burene i flere dage, selv uden at måle ilt og _CO2.
   6. Klik på Eksperimentér, og klik derefter på Opsætning, hvorefter vinduet Eksperimentopsætning åbnes, hvor parametrene for hvert metabolisk bur er defineret.
   7. Tildel hvert muse-id til det enkelte bur, hvor musen er anbragt (Figur 2C).
   8. Medtag kun den magre masse eller den samlede kropsvægt for hver mus, hvis der ikke observeres forskelle i kropsvægt mellem grupperne.
      BEMÆRK: Opnåelse af råværdier for iltforbrug og energiforbrug letter ANCOVA-analyser.
   9. Indstil luftstrømshastigheden til metabolisk buret til 0,5-0,6 L/min.
   10. Vælg stien til filbesparelsen og navnet i vinduet Eksperimentopsætning. Vælg sikkerhedskopimappen (Figur 2D).
   11. Tilsæt en forvægtet mængde mad til fødefoderne, der dækker mindst fødeindtagelse i 1 dag.
       BEMÆRK: Hvis burene har integrerede vægte, kan maden tilføjes direkte, og softwaren registrerer den.
   12. Tilsæt vandflaskerne. Kontroller, at flasken er forseglet korrekt og ikke lækker.
   13. 24 timer efter tilsætning af maden, veje den mad, der er tilbage på buret.
       BEMÆRK: De gram mad, der tilsættes minus de gram mad, der er tilbage, vil måle fødeindtagelse.
   14. Start ilt-, _CO2- og aktivitetsmålingerne (trin 1.4.10), når værdierne for fødeindtagelse er de samme som hos mus, der er anbragt i almindelige bure.
       BEMÆRK: Her er akklimatationsperioden (normalt 2-3 dage) afsluttet, og målinger af energiforbrug kan starte.
4. Indirekte kalorimetri- og aktivitetsmålinger til vurdering af energiforbruget
   1. Mål kropsvægten, fedtet og den magre masse af alle mus, før målingerne påbegyndes.
      BEMÆRK: Dette er de kropsvægt og lean masseværdier, der bruges til at udføre ANCOVA-analyser.
   2. Kalibrer CLAMS-systemets _O2 - og _CO2 Zirconia-baserede detektor (se Materialetabel) med den anbefalede iltkoncentration kalibrere detektoren igen, før du starter et nyt eksperiment.
   3. Brug en kalibreringsgas af kendt sammensætning (20,50% ilt og 0,50% _CO2).
      BEMÆRK: Gasleverandører refererer ofte til denne gas som "Primær standardkvalitet."
   4. Tænd og sørg for, at tankens udgangstryk er ved 5-10 psi.
   5. Åbn kalibreringsværktøjet til kalibrering og test af gassensorerne (Figur 2E). Klik på Eksperiment, og derefter kalibrere.
   6. Tryk på Start. Vent derefter på, at sensorerne testes, og på, at softwaren beder brugeren om at dreje på gassensorens knapper (Figur 2F), indtil værdien af _O2-identitet er 1 (Figur 2G-H). Klik på Næste, når trinnet er fuldført.
      BEMÆRK: Hvis kalibreringsværktøjet udfører alle aktuelle trin, fortsætter kalibreringen automatisk til næste trin, når statuslinjen er udfyldt.
   7. Kontroller kalibreringsresultaterne, når alle trin er fuldført, og resultaterne præsenteres.
   8. Sluk for kalibreringsgassen.
   9. Skift mad og tilsæt tilstrækkelig mad til en periode på 48-72 timer.
      BEMÆRK: Selv om bure kunne åbnes under energiforbrugsmålingerne for at overvåge kropsvægten og ændre maden dagligt, kan mus understreges af disse manipulationer, og målinger går tabt, når burene åbnes. Det anbefales således at undgå manipulation i måleperioden.
   10. Klik på Eksperimentér og kør derefter for at starte ilt_{-, CO2} - og aktivitetsmålingerne (Figur 3A).
       BEMÆRK: Udførelsen af målingerne kan spores i realtid i en boks placeret nederst til venstre i softwaren (rødt rektangel, Figur 3B). Det røde rektangel i figur 3B viser, at systemet måler bur #1 ved interval #3, nemlig den tredje måling. En måling i et bur kan tage ca. 1 minut. Således, med 12 bure tilsluttet, kan iltforbruget måles ca. hvert 12. minut. Kontinuerlige målinger i mindst 48 timer anbefales.
   11. Stop eksperimentet ved at klikke på Eksperimenter og derefter Stop (Figur 3C).
   12. Åbn burene, afvej musene og maden. Indsamle afføring til at beregne antallet af kalorier og lipider udskilles i løbet af 48-72 h målinger periode.
       BEMÆRK: Afføring kan opbevares ved -20 °C til senere analyser. Disse bure kan ikke effektivt bruges til at indsamle urin.
   13. Klik på Eksperimenter, og eksporter og eksporter alle emner som en CSV-fil (Figur 3D).
       BEMÆRK: For at lette ANCOVA-analyser er det vigtigt at eksportere rå oxygenforbrugsværdier (_VO2) og _{CO2-produktion} (VCO2) uden at blive normaliseret af kropsvægten.
5. Dataanalyse og kvalitetskontrol
   1. I det eksporterede CSV-ark (Figur 3D) (fra trin 1.4.13) skal du bruge de rå værdier for iltforbruget (_VO2) og _{CO2-produktionen} (VCO2) målt hvert 12. minut i den 2-3 dages periode, der automatisk er angivet af softwaren, og indeholde et tidsstempel, nemlig den time og dato, hvor de blev målt.
      BEMÆRK: _VO2 - og _{VCO2-værdier} korrigeres automatisk, hvis der tilsættes kropsvægt eller lean masseværdier.
   2. I det eksporterede CSV-ark skal du bruge de rå værdier for forholdet mellem åndedrætsværn (RER: _VCO2/_VO2), som automatisk beregnes og vises af softwaren i henhold til deres tidsstempel.
      BEMÆRK: Værdier tæt på 1 viser, at musen primært oxiderer kulhydrater, mens værdier tættere på 0,7 repræsenterer, at musen hovedsageligt oxiderer fedt. RER over 1 kan forekomme under anaerob træning, da kroppen udviser mere _CO2 for at kompensere for acidose forårsaget af laktat. RER højere end 1 kan indikere stress. Den eksporterede CSV-fil indeholder også de rå værdier fra energiforbrug (EE) eller Varmeproduktion i kalorier pr. minut pr. mus, målt hvert 12. minut i de 2-3 dage. Her indeholder alle de angivne værdier et tidsstempel.
   3. Da der er behov for enkelte EE-værdier pr. mus for en ANCOVA, beregnes de EE-værdier, der er registreret mellem 09:00-16:00 for lysfasen (dag) og 19:00-04:00 for den mørke (nat) fase pr. mus og dag.
      BEMÆRK: Dette kan gøres manuelt ved hjælp af Excel eller Graph Pad. Hvis du vælger disse to-tidsvinduer, undgås gennemsnit af de mellemliggende, gradvise og ustabile EE-værdier, der er knyttet til den lyse mørke faseovergang.
   4. I en periode på 48 timer skal du beregne gennemsnittet af de to dagslysværdier og de to mørke faseværdier pr. mus ved hjælp af Excel eller Graph Pad.
   5. Hvis du vil kvantificere den samlede fysiske aktivitet, skal du bruge Excel eller Graph Pad til at opsummere x-, y- og z-strålebrudstællingerne målt i de metaboliske bure og angivet i CSV-filen for hver mus.
      BEMÆRK: Den samlede aktivitet x,y,z beregnes ved først at gøre den gennemsnitlige værdi af hvert X, Y, Z pr. mus og cyklus. Derefter bestemmes summen af hver gennemsnitlig X, Y, Z-værdier pr. mus og cyklus for at afbilde dataene som i figur 5E (som er gennemsnittet på 2 dage).
   6. Alternativt kan du repræsentere de data, der viser hver måleværdi over tid, hvilket genererer kurver, der illustrerer ændringerne i EE under overgangen fra lyse til mørke cyklusser.
      BEMÆRK: Se diskussionsafsnittet om, hvordan og hvornår du skal udføre ANCOVA-analyser, og de forskellige formler, der bruges til at beregne _VO2, _VCO2 og EE, findes i supplerende fil 1.

2. Måling af termogeniske adipocytters evne til at bruge energi

1. Opsætning af målinger og musebehandlinger. Se trin 1 for nærmere oplysninger om forsøgspræparater til overvågning af iltforbruget, da termogenisk kapacitet i adipocytter bestemmes indirekte af iltforbrug efter trin 2.1.1-2.2.2.
   BEMÆRK: Denne protokol kræver musebedøvelse og akut behandling med beta-3 receptor agonist CL-316,243 (se Tabel over materialer), hvilket giver en hurtig vurdering af BA termogeniske kapacitet.
   1. Udfør kropssammensætningsanalyse og afvej musene. Tænd for MUSLINGERne, sæt temperaturen op ved 30 °C (termoneutralitet), og vent i 2 timer på, at hele systemet varmes op.
   2. Opsætning af resten af analysen betingelser, herunder lys, tildele mus ID til hvert bur og tilføje kropsvægt værdi af hver mus i det tilsvarende bur, hvis der ikke observeres nogen forskel i kropsvægt mellem grupper.
   3. Kalibrering af ilt/_{CO2-detektoren} som i trin 1.4.2-1.4.7.
   4. Start eksperimentet i softwaren.
   5. Indsprøjt hver mus med pentobarbital (60-120 mg/kg) og læg hver mus i deres tildelte metaboliske bur (trin 2.1.2).
      BEMÆRK: Den dosis pentobarbital, der kræves for at holde mus i søvn ved termoneutralitet (30 °C), varierer med musestammen og genotypen. Det anbefales at teste forskellige pentobarbitale doser fra 50 til 120 mg/kg og vælge den, der holder musen bedøvet i løbet af 2-3 timer ved 30 °C. Effektiv anæstesi er afgørende for at fjerne den fysiske aktivitets bidrag til energiforbruget.
   6. For at sikre anæstesi observere mus efter pentobarbital injektion, indtil de er helt i søvn, og deres nedsat iltforbrug bliver stabil.
   7. Vent med at opnå mindst 3 stabile på hinanden følgende iltforbrug, før du injicerer CL-316,243.
      BEMÆRK: Mens du venter på stabilisering af iltforbruget, skal sprøjterne forberedes med CL-316.243 for hver mus (1 mg/kg).
   8. Åbent bur #1 og indsprøjt CL-316.243 subkutant umiddelbart efter en _VO2 og _VCO2 måling fandt sted i bur #1. Sæt musen tilbage til bur #1 umiddelbart efter injektionen.
      BEMÆRK: Målinger angives i realtid i den nederste venstre del af softwaren (Figur 3B, rødt rektangel).
   9. Vent på, at bur #2 måles (Figur 3B, rødt rektangel), og fortsæt derefter som i trin 2.1.8 for bur #2.
      BEMÆRK: Injektion af CL-316.243 umiddelbart efter en måling gør det muligt at opretholde tidskonstanten mellem injektionerne. For eksempel, hvis der er 12 mus / bure kører, med målinger indsamlet i de enkelte bure sekventielt og indsamlingen varig 55 s pr bur, så skal du injicere en mus hvert minut. Ved disse injektionshastigheder vil den første måling forekomme efter 12 min efter injektion i alle 12 bure.
   10. Fortsætte energiudgiftsmålingerne, indtil energiudgifterne værdier plateau for 5-6 på hinanden følgende målinger, normalt 90-180 min efter injektion.
       BEMÆRK: Mus kan vågne op fra anæstesi under forsøgene. Disse mus skal fjernes fra analysen. Derfor vil test af pentobarbitale doser på forhånd øge effektiviteten af undersøgelserne.
   11. Stop målingerne af energiforbruget, men hold musene i deres bure ved 30 °C, indtil de vågner op.
   12. Når mus er helt vågne, inspicere musenes sundhed og returnere dem til deres oprindelige bure.
   13. Eksporter data for hver mus som en CSV-fil ved hjælp af udstyrssoftwaren som beskrevet i afsnit 1.4.13.
2. Dataanalyse
   BEMÆRK: Dataanalysen blev udført af Excel eller Graphpad
   1. Plot de 3-5 på hinanden følgende værdier af _VO2, _VCO2 og EE, der er stabile og konstante over tid, da disse er de værdier, der repræsenterer stofskiftet, når mus er fuldt bedøvet.
   2. Derefter plotte de første og følgende på hinanden følgende _VO2-, _VCO2- og EE-målinger, der er opnået efter injektion.
      BEMÆRK: De absolutte værdier af EE og den fold stigning i EE induceret af injektion indikerer BA termogeniske ^funktion7.

Representative Results

Figur 4 viser _VO2, VCO2, Varmeproduktion/energiforbrug (EE), Respiratory Exchange Ratio (RER) og X, Y, Z fysiske aktivitetsværdier opnået ved hjælp af de metaboliske bure i CLAMS-systemet. VO2 og _VCO2 fra CLAMS-systemet er mængden af gas (mL) pr. minut og kan allerede divideres med kropsvægten eller de magre masseværdier ved at indtaste disse vægtværdier i CLAMS-softwaren, før målingerne påbegyndes. Der må dog ikke angives kropsvægtværdier, hvis der observeres forskelle i kropsvægt mellem grupper af mus, da DER er behov for ANCOVA-analyse, og Oxymax-softwaren ikke kan udføre disse beregninger. Energiforbruget (varme) beregnes i kcal/h ved hjælp af Lusk-ligningen. Mus er natlige og bruger mere energi i løbet af natten / mørk periode, hvilket betyder, at energiforbruget beregninger skal adskilles i henhold til lyscyklussen. Som forventet har mus i den mørke fase højere _O2-forbrug, _{CO2-produktion} og dermed højere EE, som vist i figur 4C. Mus på en regelmæssig kost og i fed tilstand, med madindtagelse, der forekommer i den mørke cyklus, er karakteriseret ved RER-værdier tæt på 1 (Figur 4D), hvilket betyder en præference for at bruge kulhydrater. Under lyscyklussen, når mus for det meste sover og dermed hurtigt, er der et skift til fedtoxidation, hvor RER-værdier er tættere på 0,7. Derfor øges den fysiske aktivitet, målt som x,y,z laserstrålebrud, i den mørke fase og falder i lysfasen (Figur 4E).

Vi sammenlignede 16 uger gamle hunmus fodret med en fedtrig kost (8 uger) til chow-fodrede mus, hvilket gjorde det muligt at sammenligne energiforbrug mellem grupper af mus med forskelle i kropsvægt. Som forventet øger foder med højt fedtindhold fedtmassen uden at ændre den magre masse (figur 5A-C). Højt fedtindhold kost-fodret mus spiste mere Kcal / dag, primært på grund af højere kalorietæthed pr gram mad (Figur 5D). Derudover var fysisk aktivitet ens mellem chow og fedtholdige diætfodrede mus, selv i den mørke periode (Figur 5E). De lavere værdier i RER viser præferencen for højt fedtindhold kost-fodret mus til at bruge fedt som det primære substrat til oxidation, som forventet med højere fedtindtag og muskelinsulinresistens (Figur 5F). Iltforbruget stiger i fedtholdige slankekure mus, men ikke _{CO2-produktion} (figur 5G-H). Stigningen i iltforbruget i højt fedtholdige diætfodrede mus ledsages af en betydelig stigning i varmeproduktionen/energiforbruget pr. mus (figur 5I). En opdeling af energiforbruget med den magre masse af hver mus førte imidlertid ikke til forskelle i energiforbruget (figur 5J), mens en opdeling efter den samlede kropsvægt viste et fald i energiforbruget i fedtholdige diætfodrede mus (Figur 5K). Kumulativt viser disse resultater, at en opdeling af energiforbrugsdata med lean masse eller total kropsvægt kan føre til modsatte konklusioner om virkningerne af fedtrig kost, der lever af energiforbrug. Som foreslået af flere undersøgelser gør analysen af kovarians (ANCOVA) det muligt at afgøre, om der er forskelle i energiforbruget uafhængigt af ændringerne i kropsvægten. For at illustrere dette punkt blev der udført en ANCOVA-analyse ved hjælp af de samme data, der er vist i figur 5A-K, hvor energiforbruget var den afhængige variabel og kropsvægt eller lean masse som kovarians. Mens udførelse af ANCOVA ved hjælp af den samlede kropsvægt som et kovariat viser kun en tendens til højt fedtindhold kost-fodret mus til at have højere energiforbrug (Figur 5L), den fedtholdige kost-fodret mus viser en betydelig stigning i energiforbruget, når lean masse anvendes (Figur 5M). Disse data tyder på, at brugen af den samlede kropsvægt til at udføre ANCOVA-analyser kan undervurdere ^{energiforbruget4}. Årsagerne kan være, at: (1) fedtvæv kun bidrager til ~ 5% af de samlede energiforbrug og (2) gevinsten af fedtmasse forårsaget af fedtrig kost fodring skyldes hovedsagelig en udvidelse af triglycerid indhold i adipocytter, snarere end fra en stigning i antallet af oxidative termogeniske adipocytter.

Brune og beige adipocytter (BA) bidrager til termogenese og dermed til energiforbruget hos gnavere. BA's bidrag til energiforbruget in vivo kan ikke bestemmes blot ved at måle hele kroppens iltforbrug og beregne BMR, da flere væv forbruger ilt. Tilgangen til bestemmelse af BA termogen kapacitet in vivo indebærer anæstesi først, som er nødvendig for at begrænse iltforbruget i alle væv. Derefter kombineres anæstesi med en farmakologisk tilgang til aktivering af termogenese, for det meste i termogen BA. Da beta-3 adrenergic receptorer primært udtrykkes i fedtvæv, beta-3 adrenergic agonist CL-316,243 kan bruges til at aktivere BA termogenisk funktion. Derudover kan de bedøvede mus placeres i et temperaturstyret kabinet ved 30 °C for at forhindre ukontrolleret sympatisk BA-aktivering forårsaget af omgivende termisk stress. Figur 6 viser mus, der har fået en fedtrig kost bedøvet med pentobarbital og anbragt i metaboliske bure ved 30 °C, for at registrere energiforbruget ved stofskiftet under standard (figur 6A-C,D). Denne måling blev efterfulgt af CL-316.243-injektion, som øgede iltforbruget, _{CO2-produktionen} og energiforbruget som forventet fra BA-aktivering (figur 6A-C). En 2-3-dobling af energiforbruget efter beta-3 agonistisk behandling kan ^påvises7.

Figur 1: De metaboliske bure med miljøskab og samling af individuelle metaboliske bure. (A) De metaboliske bure i miljøkabinettet. (B) Kabinettet kan huse 12 metaboliske bure og gør det muligt at kontrollere temperatur og lys. (C) Komponenter i metaboliske bure før montering. (D) Metaboliske bure forseglet med låget. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Eksperimentel opsætning og kalibrering af iltsensoren. (A) Et skærmbillede af Oxymax software, der styrer metaboliske bure, der viser udvælgelse og åbning af en "Eksperimentel konfiguration" vindue til at indstille (B) eksperimentelle egenskaber, nemlig omgivende lys, og temperatur. Derefter konfigureres eksperimentet ved hjælp af vinduet (C) "Eksperimentel opsætning" til at tildele et muse-id, kropsvægt eller lean masse til hvert bur samt luftstrømshastigheden for de 12 bure. (D) I samme vindue "Eksperimentel installation" kan der vælges en sti til filbesparelse. (E) For at kalibrere gassensoren skal brugeren dreje knappen på (F) gasdetektoren for at justere (G-H) _{O2-identiteten} til 1. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Start og stop af målingerne. (A) Eksperimentet startes ved at klikke på "Eksperimenter" og derefter "Kør". (B) Brugerne kan i realtid se, hvilke af de 12 bure der i øjeblikket måles (rødt rektangel), samt en tabel med de målinger, der allerede er indsamlet. (C) Eksperimentet kan stoppes ved at klikke på "Eksperiment" og derefter "Stop". (D) Dataene kan eksporteres til Excel ved at klikke på "Filer", derefter "Eksporter" og derefter "Eksporter alle emner CSV". Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Metaboliske parametre opnået. (A) Iltforbrug. B) _{CO2-produktion}. C) Energiforbruget (EE) normaliseret til mager masse. d) Forholdet mellem åndedrætsværn (RER). (E) Fysiske aktivitetsniveauer beregnes som summen af X, Y, Z laserstrålebrud. Data viser ± SEM. Student's t-test, ** P < 0,01, *** P < 0,001. n = 7-8 hunmus pr. gruppe. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: ANCOVA-analysen giver mulighed for passende fortolkning af ændringer i energiforbruget hos overvægtige mus. (A-M) Målinger hos hunmus fodret med enten en chow eller fedtrig kost (HFD) i 8 uger. A) Kropsvægt. (B) Fed masse. (C) Lean masse. D) Fødeindtagelse. Studerendes t-test, *** P < 0,001. (E) Fysisk aktivitet blev vurderet med de metaboliske bure som optællinger af laserstrålebrud i X, Y, Z. (F) Forholdet mellem luftvejskoefficienter (RER). (G) Iltforbrug (_VO2). H) _{CO2-produktion} (_VCO2). I) Energiforbruget (EE) blev målt ved indirekte kalorimetri. Energiforbruget blev normaliseret til (J) Lean masse og (K) kropsvægt. * P < 0,05 ved hjælp af Two-ANOVA. ** P< 0,01, *** P< 0,001. (L) Kovariatanalyse (ANCOVA) af energiforbruget (EE) om natten i forhold til den samlede kropsvægt eller (M) lean masse. Stiplede linjer repræsenterer de gennemsnitlige kropsvægtværdier, der er modelleret for at bestemme _VO2 og EE i hver gruppe. *P < 0,05 ved hjælp af ANCOVA. n = 7-8 hunmus pr. gruppe. Data viser ± SEM . Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6: Den selektive β3-agonist, CL-316.243 øger energiforbruget i bedøvede mus med termoneutralitet akut. Hunmus blev bedøvet med pentobarbital (60 mg/kg) og anbragt i de metaboliske bure, der var sat til 30 °C. Energiforbruget under anæstesi blev registreret, indtil 3 på hinanden følgende målinger viste de samme værdier, hvilket afspejler fuldstændig anæstesi. Musen fra bur #1 blev injiceret med CL-316.243 (1 mg/kg) umiddelbart efter en iltforbrugsmåling. Den samme injektionsmetode blev anvendt i de andre bure for at sikre, at der gik samme tid mellem injektion og den første måling hos alle mus. (A) Iltforbrug. B) _{CO2-produktion} . C) Energiforbrug. n = 4 hunmus. Data viser ± SEM . Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende fil 1: Formler, der bruges af Oxymax-software i CLAMS-systemet til at beregne iltforbrug, CO2-produktion og energiforbrug.

Discussion

Indirekte kalorimetri har i årevis været anvendt til at vurdere hele kroppens ^{energiforbrug4}. Denne protokol beskrevet heri giver en enkel metode til måling af den basale stofskifte og bestemmelse BA termogen kapacitet in vivo ved hjælp af metaboliske bure.

Den indirekte kalorimetrimetode, der er beskrevet her, bekræfter, at det kan være vildledende at dividere energiomkostningsværdierne med kropsvægtværdier. For eksempel kan den konkludere, at energiforbruget systematisk er lavere i alle musemodeller med fedme. De samlede energiforbrug kan dog være højere i nogle musemodeller af fedme, som i tilfælde af en stigning i fødeindtagelsen, der fører til fedme. Derfor vil en opdeling af energiforbruget med fedtmasse altid forårsage en fejlfortolkning af den proces, der er ansvarlig for fedme hos overvægtige mus uden primære defekter i energiforbruget. Derudover er opdeling med lean masse også uhensigtsmæssigt, når der sker ændringer i lean masse, da lean masse er forskellige med energiforbrug, og energiforbruget kan vise et større fald end nogen ændring i lean masse. Det betyder, at opdeling af energiforbruget efter kropsvægt eller mager masse kun kan udføres, hvis der ikke observeres ændringer i kropsvægt eller kropssammensætning (dvs. lean masse og fedtmasse) mellem de testede grupper. Som følge heraf er den sikreste tilgang at udføre ANCOVA. Dette emne er blevet diskuteret vidt og bredt i fremragende artikler, som alle konkluderer, at en analyse af kovarians (ANCOVA) er afgørende for at sammenligne energiforbrug mellem grupper af mus med forskelle i den samlede kropsvægt eller lean ^masse4,5. Her blev SigmaPlot brugt til at udføre ANCOVA-analyser internt, men mange andre avancerede statistiske analysesoftware kan bruges. CalR-webstedet gør det muligt at uploade data i en af deres skabeloner, men det er måske ikke altid muligt afhængigt af det eksperimentelle ^design5. At have statistisk software til at udføre ANCOVA "in-house" giver mere fleksibilitet på dataanalyse og præsentation, men det er mere ^{tidskrævende6}.

Termoneutralitet for mus er omkring 30 °C, hvilket undertrykker aktiviteten af termogeniske brune og beige adipocytter (BA)¹. Omgivelsestemperaturen (21 °C) er under termoneutralitet, hvilket betyder, at BA-termogenese vil bidrage til energiforbruget hos mus, der er anbragt ved 21 °C. Så forskellen i energiforbrug mellem mus ved omgivelsestemperatur vs. mus med termoneutralitet kan anvendes til at bestemme BA's bidrag til energiforbruget på en mindre invasiv måde. Denne procedure kræver dog kontinuerlig brug af kabinettet ved 30 °C i 4 uger, og termoneutralitet forårsager også forskelle i fysisk aktivitet. Derudover fremkalder termoneutralitet metaboliske ændringer i andre væv, ikke kun i BA. I en situation, hvor hovedformålet er at undersøge ændringer i BA's termogeniske kapacitet, har den farmakologiske tilgang, der er beskrevet her, en liste over fordele i forhold til at huse mus med termoneutralitet over en lang periode.

Resultaterne opnås i få timer, og anæstesi undertrykker bidraget fra fysisk aktivitet og andre adfærdsmæssige ændringer i energiforbruget. Ved vurdering af virkningerne af genetiske manipulationer hos mus kan stofskiftet ændres i BA og andet væv. Cl-316.243 behandling hos bedøvede mus er således den tilgang, der kan skelne ændringer i BA-aktivitet med et højere dynamikområde og specificitet, med færre confounders fra energiforbrug, der stammer fra andre væv. Alternativt kan CL-316.243 injiceres i bevidste mus, da systemet kan måle fysisk aktivitet. Derfor, hvis der sker en ændring i fysisk aktivitet, kan den estimeres og ^{kontrolleres5}. Alt i alt, mens anæstesi kan give det højeste dynamiske område, målinger kan gøres uden anæstesi, hvis det er nødvendigt, som fysisk aktivitet kan overvåges.

Når du bruger de metaboliske bure, skal der udvises forsigtighed med hensyn til mus stress, og korrekt genopretning er nødvendig. Den sociale isolation af individuelle boliger og det nye miljø i det metaboliske bur stresser musene, hvilket resulterer i nedsat fødeindtagelse og vægttab. Således skal fødeindtagelse og kropsvægt overvåges hver 24 timer. Mus genvinder normal fødeindtagelse 48-72 timer efter at have placeret dem i metabolisk bur. Som følge heraf starter kalibrerings- og iltforbrugsmålinger, når fødeindtagelsen genvindes. På trods af at metaboliske buresystem er tændt, udføres kalibrering og foranstaltninger ikke i denne akklimateringsperiode, da BMR pr. definition skal opnås i en stressfri mus. Undgå målinger i denne periode øger detektorens levetid og reducerer brugen og forbruget af tørrere (som fælder vand for at forhindre iltdetektorskader). Nyere og dyrere systemer brugte hjemme-bur-baserede målinger, hvilket mindsker stress.

ANCOVA-analyser
Der er behov for en ANCOVA (analyse af kovarians) ved sammenligning af energiforbruget mellem to grupper af mus med forskelle i ^kropsvægt4. Årsagen er, at en stigning i lean masse vil øge energiforbruget. ANCOVA tester, om energiforbruget ændres statistisk mellem grupperne, uafhængigt af forskelle i kropsvægt og lean masse. ANCOVA opnår dette ved at afgøre, om energiforbruget var forskellige, hvis begge grupper havde samme kropsvægt eller lean masse. For at beregne energiforbruget ved samme kropsvægt/mager masse ved hjælp af ANCOVA skal sammenhængen mellem kovariansen (kropsvægt/mager masse) og variablen (energiforbrug) imidlertid være den samme mellem grupperne. Ligheden mellem denne korrelation testes ved hjælp af Levenes test for ligestilling af ^varians5.

ANCOVA kræver brug af mere avanceret statistisk analyse software, såsom SigmaPlot. Alternativt kan forskellige gratis hjemmesider ^bruges5. Hvis ANCOVA viser, at den observerede effekt mellem grupper ikke afhænger af værdien af kovariat (kropsvægt/lean masse), vil softwaren teste, om gennemsnittet af variablen (energiforbrug, _VO2, _VCO2) er forskelligt mellem grupperne ved en lignende kovariat (kropsvægt/lean masse). Softwaren vil tilbyde at foretage flere sammenligninger med en foreslået statistisk test. Hvis der opnås statistisk signifikans, vil det bekræfte, at energiforbruget er væsentligt forskelligt mellem de to grupper af mus til en given kropsvægtværdi. Regressionsligningen for den lige skråninger model kan fås fra analysen, som kan bruges i GraphPad eller anden grafisk software til at generere en graf til ^{offentliggørelse6}.

Ændringer og fejlfinding
CLAMS-systemet, der anvendes i denne protokol, består af små bure, der er meget forskellige fra de hjemmebure, som mus er vant til, som omfatter sengetøj. Derudover er mus sociale dyr, og behovet for at huse dem individuelt sammen med et nyt bur uden sengetøj forårsager indledende stress for musene. Således er en akklimatering på mindst 2 dage nødvendig for at give mus mulighed for at tilpasse sig deres nye miljøer og afbøde stress. Normalt kommer fødeindtagelse tilbage til det, der blev registreret i deres hjemmebure på den tredje dag. Denne akklimateringsperiode er unødvendig for at vurdere BA's evne til at bruge energi, da den udføres i bedøvede mus.

Pentobarbital er en kortvirkende barbiturat, der kan bruges som beroligende eller bedøvelsesmiddel, men det bruges også til aktiv dødshjælp ved højere doser. Af en ukendt grund blev det undertiden bemærket, at effekten af pentobarbital ved 30 °C er anderledes end ved omgivelsestemperatur. Derfor anbefales det at teste forskellige pentobarbitale doser i musemodellen ved termoneutralitet. De vigtigste bivirkninger af pentobarbital omfatter respirationsdepression og hjerte-kar-effekter, såsom nedsat blodtryk, slagtilfælde volumen, og hypotension8.

Begrænsninger
Beta3-adrenergic receptorer udtrykkes i fedtvæv og påvises i myokardiet, nethinden, galdeblære, hjerne, urinblære, og ^blodkar9. Som sådan, CL-316,243 kan potentielt øge energiforbruget i disse andre væv, hvor receptoren udtrykkes. Det blev imidlertid påvist, at de fleste af de energiforbrug, der er forårsaget af CL-316.243 i kontrolmus, er UCP-1-afhængige, et BA-specifikt ^protein10,11. Det skal tages i betragtning, at nogle genetiske modifikationer kan forværre handlinger CL-316,243 i andre væv. Derudover kan den del af UCP1 uafhængige respiration stadig være drevet af ATP-forbrugende forgæves cyklusser beskrevet i aktiveret fedtvæv.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CLAMS-Oxymax System	Columbus Instruments	CLAMS-center feeder-ENC	Including enviromental enclosure and Zirconia oxygen sensor
Desktop PC with Oxymax Software	HP/Columbus	N/A	PC needed to be purchased separately
Drierite jug (Calcium Sulfate with Cobalt Chloride Indicator)	Fisher Scientific	23-116681	Needed to dry the gas entering the oxygen sensor, humidity can damage the sensor
NMR for body composition	Echo-MRI	Echo-MRI 100	Measure lean and fat mass in alive mice. It is necessary for ANCOVA analyses.
CL-316-243	Sigma	C5976	Injected to the mice subcutaneously to activate thermogenesis
High fat diet	Research Diets	D12266B	Provided to the mice prior and during measurements
Pentobarbital/Nembutal	Pharmacy at DLAM	N/A	Anesthesia for the mice
Primary standard grade gas (tank and regulator)	Praxair	NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590	20.50% Oxygen, 0.50% CO2 balanced with nitrogen used for calibration