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Biology

बेसल ऊर्जा व्यय और मोटापे से ग्रस्त चूहों में ऊर्जा खर्च करने के लिए थर्मोजेनिक एडिपोसाइट्स की क्षमता का निर्धारण

Published: November 11, 2021 doi: 10.3791/63066
Automatic Translation
1, 2, 2,3,4
1Department of Molecular Medicine, Faculty of Medicine, Universite Laval, 2Department of Medicine, Division of Endocrinology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 3Department of Molecular and Medical Pharmacology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 4Molecular Biology Institute at UCLA

Summary

यह पांडुलिपि बेसल चयापचय दर और मोटापे से ग्रस्त चूहों में थर्मोजेनिक एडिपोसाइट्स की ऑक्सीडेटिव क्षमता को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करती है।

Abstract

यह समझने के लिए ऊर्जा व्यय माप आवश्यक हैं कि चयापचय में परिवर्तन मोटापे को कैसे जन्म दे सकता है। बेसल ऊर्जा व्यय को चूहों में पूरे शरीर की ऑक्सीजन की खपत, सीओ 2 उत्पादन और चयापचय पिंजरों का उपयोग करके शारीरिक गतिविधि को मापकर निर्धारित किया जा सकता है। थर्मोजेनिक ब्राउन / बेज एडिपोसाइट्स (बीए) कृंतक ऊर्जा व्यय में महत्वपूर्ण योगदान देते हैं, विशेष रूप से कम परिवेश के तापमान पर। यहां, बेसल ऊर्जा व्यय और मोटापे से ग्रस्त चूहों में ऊर्जा खर्च करने के लिए कुल बीए क्षमता के माप को दो विस्तृत प्रोटोकॉल में वर्णित किया गया है: पहले समझाते हुए कि सहप्रसरण (ANCOVA) के विश्लेषण का उपयोग करके बेसल ऊर्जा व्यय को मापने के लिए परख कैसे स्थापित किया जाए, एक आवश्यक विश्लेषण यह दिया गया है कि ऊर्जा व्यय शरीर के द्रव्यमान के साथ सह-भिन्न होता है। दूसरा प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि चूहों में विवो में बीए ऊर्जा व्यय क्षमता को कैसे मापा जाए। इस प्रक्रिया में संज्ञाहरण शामिल है, जो शारीरिक गतिविधि के कारण होने वाले खर्च को सीमित करने के लिए आवश्यक है, इसके बाद बीटा 3-एड्रीनर्जिक एगोनिस्ट, सीएल -316,243 का इंजेक्शन होता है, जो बीए में ऊर्जा व्यय को सक्रिय करता है। इन दो प्रोटोकॉल और उनकी सीमाओं को एक सफल पहले प्रयोग की अनुमति देने के लिए पर्याप्त विस्तार से वर्णित किया गया है।

Introduction

चयापचय को पोषक तत्वों के उत्थान, भंडारण, परिवर्तन और टूटने के लिए जिम्मेदार जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं के एकीकरण के रूप में परिभाषित किया जा सकता है जो कोशिकाएं अपने कार्यों को विकसित करने और निष्पादित करने के लिए उपयोग करती हैं। चयापचय प्रतिक्रियाएं पोषक तत्वों में निहित ऊर्जा को एक रूप में बदल देती हैं जिसका उपयोग कोशिकाओं द्वारा नए अणुओं को संश्लेषित करने और काम को निष्पादित करने के लिए किया जा सकता है। ये जैव रासायनिक प्रतिक्रियाएं जीवन को बनाए रखने के लिए इस ऊर्जा को एक उपयोगी रूप में बदलने में स्वाभाविक रूप से अक्षम हैं1। इस तरह की अक्षमता के परिणामस्वरूप गर्मी के रूप में ऊर्जा अपव्यय होता है, इस गर्मी के उत्पादन का उपयोग एक जीव के मानक चयापचय दर (एसएमआर) को मापने के लिए किया जाता है। मानक स्थिति को शास्त्रीय रूप से एक जागृत लेकिन आराम करने वाले वयस्क में होने वाले गर्मी उत्पादन के रूप में परिभाषित किया गया था, न कि भोजन को निगलने या पचाने के लिए, थर्मोन्यूट्रलिटी पर और बिना किसी तनाव के। बेसल मेटाबोलिक रेट (बीएमआर) या चूहों में बेसल ऊर्जा व्यय को एसएमआर के रूप में संदर्भित किया जाता है, लेकिन हल्के थर्मल तनाव (परिवेश का तापमान 21-22 डिग्री सेल्सियस) के तहत भोजन को निगलने और पचाने वाले व्यक्तियों में। गर्मी उत्पादन को सीधे मापने की चुनौतियों और कठिनाइयों ने अप्रत्यक्ष कैलोरीमेट्री को बनाया, अर्थात् ऑक्सीजन की खपत माप से गर्मी उत्पादन की गणना करने के लिए, बीएमआर को निर्धारित करने के लिए सबसे लोकप्रिय दृष्टिकोण बनने के लिए। ऑक्सीजन की खपत से बीएमआर की गणना करना संभव है क्योंकि एटीपी को संश्लेषित करने के लिए माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा पोषक तत्वों का ऑक्सीकरण एक जीव में खपत कुल ऑक्सीजन के 72% के लिए जिम्मेदार है, कुल ऑक्सीजन खपत का 8% माइटोकॉन्ड्रिया में भी होता है, लेकिन एटीपी (अनियंत्रित श्वसन) उत्पन्न किए बिना। खपत ऑक्सीजन के शेष 20% के बहुमत को अन्य उपकोशिकीय स्थानों (पेरोक्सिसोमल फैटी एसिड ऑक्सीकरण), एनाबॉलिक प्रक्रियाओं और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के गठन में पोषक तत्व ऑक्सीकरण के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। इस प्रकार, 1907 में, लुस्क ने अनुभवजन्य माप के आधार पर एक समीकरण स्थापित किया, जिसका उपयोग व्यापक रूप से ऑक्सीजन की खपत और सीओ 2 उत्पादन को गर्मी के रूप में ऊर्जा अपव्यय में बदलने के लिए किया जाता है। मनुष्यों में, मस्तिष्क बीएमआर के ~ 25%, ~ 18.4% के लिए मस्कुलोस्केलेटल सिस्टम, ~ 20% के लिए जिगर, ~ 10% के लिए दिल, और ~ 3-7% 2 के लिए वसा ऊतक के लिए जिम्मेदार है। चूहों में, बीएमआर में ऊतक योगदान थोड़ा अलग है, मस्तिष्क का प्रतिनिधित्व करने के साथ ~ 6.5%, कंकाल की मांसपेशी ~ 13%, जिगर ~ 52%, दिल ~ 3.7%, और वसा ऊतक ~ 5% 3।

उल्लेखनीय रूप से, बीएमआर को परिभाषित करने वाली जैव रासायनिक प्रतिक्रियाएं निश्चित नहीं हैं और विभिन्न जरूरतों के जवाब में बदलती हैं, जैसे कि बाहरी काम (शारीरिक गतिविधि), विकास (ऊतक विकास), आंतरिक तनाव (संक्रमण, चोटों, ऊतक टर्नओवर का मुकाबला करना), और परिवेश के तापमान (ठंड रक्षा) में परिवर्तन 1। कुछ जीव सक्रिय रूप से ठंड के संपर्क में गर्मी उत्पन्न करने के लिए प्रक्रियाओं को भर्ती करते हैं, जिसका अर्थ है कि चयापचय द्वारा उत्पादित गर्मी केवल एक आकस्मिक उपोत्पाद नहीं है। इसके बजाय, विकास ने नियामक तंत्र का चयन किया जो विशेष रूप से चयापचय प्रतिक्रियाओं की दर को बदलकर गर्मी उत्पादन को नियंत्रित कर सकता है1। इस प्रकार, इन समान ऑक्सीजन खपत मापों का उपयोग ठंड के जवाब में गर्मी उत्पन्न करने के लिए एक जीव की क्षमता निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है।

दो प्रमुख प्रक्रियाएं ठंड के संपर्क में आने पर गर्मी उत्पादन में योगदान करती हैं। पहला कांप रहा है, जो अनैच्छिक मांसपेशियों के संकुचन द्वारा किए गए शारीरिक कार्य को कवर करने के लिए मांसपेशियों में माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन और ग्लाइकोलाइसिस को बढ़ाकर गर्मी उत्पन्न करता है। इसलिए, ठंड जोखिम मांसपेशियों में ऑक्सीजन की खपत में वृद्धि होगी1. दूसरा गैर-कंपकंपी थर्मोजेनेसिस है, जो भूरे और बेज रंग के एडिपोसाइट्स (बीए) में ऑक्सीजन की खपत में वृद्धि के माध्यम से होता है। बीए में गर्मी में ऊर्जा का अपव्यय माइटोकॉन्ड्रियल अनकपलिंग प्रोटीन 1 (यूसीपी 1) द्वारा मध्यस्थता की जाती है, जो माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में प्रोटॉन को फिर से प्रवेश करने की अनुमति देता है, जिससे माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटॉन ग्रेडिएंट कम हो जाता है। यूसीपी 1 द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटॉन ग्रेडिएंट का अपव्यय इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण और ऑक्सीजन की खपत में ऊंचाई और एटीपी (uncoupled) उत्पन्न किए बिना प्रति से प्रोटॉन अपव्यय द्वारा जारी ऊर्जा द्वारा गर्मी उत्पादन को बढ़ाता है। इसके अलावा, थर्मोजेनिक बीए अतिरिक्त तंत्र की भर्ती कर सकता है जो प्रोटॉन ग्रेडिएंट में एक बड़े अपव्यय का कारण बने बिना ऑक्सीजन की खपत को बढ़ाता है, व्यर्थ ऑक्सीडेटिव एटीपी संश्लेषण और खपत चक्रों को सक्रिय करके। यहां वर्णित चयापचय पिंजरों, अर्थात् कोलंबस इंस्ट्रूमेंट्स से सीएलएएमएस-ऑक्सीमैक्स सिस्टम, विभिन्न परिवेशके तापमान पर ऊर्जा व्यय को मापने की संभावना प्रदान करता है। हालांकि, पूरे शरीर के ऑक्सीजन की खपत माप का उपयोग करके बीए थर्मोजेनिक क्षमता निर्धारित करने के लिए, एक को यह करने की आवश्यकता है: (1) ऊर्जा व्यय के लिए कंपकंपी के योगदान को समाप्त करना, और अन्य गैर-बीए चयापचय प्रक्रियाओं को समाप्त करना, और (2) विशेष रूप से विवो में बीए थर्मोजेनिक गतिविधि को सक्रिय करना। इस प्रकार, एक दूसरा प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि थर्मोन्यूट्रैलिटी (30 डिग्री सेल्सियस) पर एनेस्थेटिक चूहों में फार्माकोलॉजी का उपयोग करके विवो में बीए को चुनिंदा रूप से कैसे सक्रिय किया जाए, जिसमें संज्ञाहरण और थर्मोन्यूट्रलिटी अन्य गैर-बीए थर्मोजेनिक प्रक्रियाओं (यानी, शारीरिक गतिविधि) को सीमित करते हैं। बीए को सक्रिय करने के लिए औषधीय रणनीति चूहों का इलाज कर रही है 3-एड्रीनर्जिक रिसेप्टर एगोनिस्ट सीएल -316,246 के साथ। कारण यह है कि कोल्ड एक्सपोजर बीए में β-एड्रीनर्जिक रिसेप्टर्स को सक्रिय करने के लिए नॉरपेनेफ्रिन को जारी करने वाली एक सहानुभूतिपूर्ण प्रतिक्रिया को बढ़ावा देता है, जो यूसीपी 1 और वसा ऑक्सीकरण को सक्रिय करता है। इसके अलावा, π3-adrenergic रिसेप्टर अभिव्यक्ति अत्यधिक चूहों में वसा ऊतक में समृद्ध है।

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Protocol

सभी प्रयोगों को कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, लॉस एंजिल्स (यूसीएलए) में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। चूहों को चयापचय पिंजरे में उनके आहार और पानी के विज्ञापन लिबिटम को प्रशासित किया गया था, जो 12h प्रकाश / अंधेरे चक्र के साथ तापमान-नियंत्रित वातावरण (~ 21-22 या 30 डिग्री सेल्सियस) में रखा गया था। 8 सप्ताह की मादा चूहों ने इस अध्ययन के लिए 8 सप्ताह के लिए एक उच्च वसा वाले आहार या चाउ आहार का उपयोग किया था।

1. बेसल मेटाबोलिक रेट (BMR) का मापन

  1. 0.1 ग्राम की सीमा में सटीकता के साथ वजन पैमाने का उपयोग करके माउस के कुल शरीर के वजन को मापें।
    नोट: यह चयापचय पिंजरों में चूहों आवास से पहले और चयापचय पिंजरों के लिए acclimation अवधि के 2-3 दिनों के बाद किया जाना चाहिए।
  2. एक उपयुक्त शरीर संरचना विश्लेषण प्रणाली का उपयोग करके गैर-एनेस्थेटिक चूहों में वसा और दुबला द्रव्यमान सहित शरीर की संरचना को मापें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: इन मापों को ऊर्जा व्यय निर्धारित करने के लिए आवश्यक है और कुल शरीर के वजन माप (चरण 1.1) के समानांतर निष्पादित किया जाता है।
  3. चयापचय पिंजरों को स्थापित करें और acclimation अवधि शुरू करें।
    नोट: चयापचय पिंजरों प्रणाली में एक बाड़ा शामिल है जो उपयोगकर्ता को आवास तापमान और 12 पिंजरों के प्रकाश को नियंत्रित करने की अनुमति देता है (चित्रा 1 ए, बी)। प्रत्येक पिंजरे में एक पानी की बोतल, एक फीडर और एक ग्रिड (चित्रा 1 सी) होता है। ग्रिड माउस को पिंजरे के नीचे से अलग करता है, जिससे मल संग्रह की अनुमति मिलती है। एक बार पिंजरे को प्रत्येक पूर्व-निर्धारित स्थान पर स्थापित करने के बाद, पिंजरे को सील करने वाले ढक्कन में पानी की बोतल स्लॉट, टयूबिंग नमूना हवा, एयरफ्लो सिस्टम और शारीरिक गतिविधि सेंसर (चित्रा 1 डी) शामिल हैं।
    1. परख शुरू करने से पहले तापमान बाड़े, airflow प्रणाली, और कंप्यूटर 2 ज पर बारी.
    2. 2 घंटे के बाद, संलग्नक को नियंत्रित करने वाले सॉफ़्टवेयर को खोलें ( सामग्री की तालिका देखें) और एयरफ्लो और सॉफ़्टवेयर को उपकरण के साथ कंप्यूटर के संचार का परीक्षण करने दें।
      नोट: Oxymax सॉफ़्टवेयर वर्तमान काम के लिए इस्तेमाल किया गया था।
    3. एक बार संचार स्थापित हो जाने के बाद, फ़ाइल क्लिक करें, फिर प्रयोग कॉन्फ़िगरेशन खोलें (चित्रा 2A) और विक्रेता द्वारा पूर्वनिर्धारित प्रयोग कॉन्फ़िगरेशन का चयन करें (या पिछले परख से सेट अप)।
    4. प्रयोग पर क्लिक करें, फिर गुण पर क्लिक करें, जो प्रयोग गुण विंडो (चित्रा 2B) खोल देगा।
    5. गुण विंडो में, परिवेश तापमान (21 डिग्री सेल्सियस) और 12 घंटे प्रकाश चक्र सहित पर्यावरणीय बाड़े के पैरामीटर सेट करें।
      नोट: सॉफ़्टवेयर को खुला रखने और चलने से हवा को चयनित तापमान और प्रकाश चक्रों को बनाए रखने के लिए पिंजरों और बाड़े में प्रवाहित करने की अनुमति मिलती है। इस प्रकार, पूरी प्रणाली कई दिनों तक पिंजरों के अंदर चूहों के साथ काम कर सकती है, यहां तक कि ऑक्सीजन और सीओ 2 को मापने के बिना भी।
    6. प्रयोग पर क्लिक करें, फिर सेटअप पर क्लिक करें, और प्रयोग सेटअप विंडो खुल जाएगी, जहां प्रत्येक चयापचय पिंजरे के पैरामीटर परिभाषित किए गए हैं।
    7. प्रत्येक माउस आईडी को व्यक्तिगत पिंजरे में असाइन करें जहां माउस रखा गया है (चित्रा 2 सी)।
    8. प्रत्येक माउस के लिए दुबला द्रव्यमान या कुल शरीर का वजन केवल तभी शामिल करें जब समूहों के बीच शरीर के वजन में कोई अंतर नहीं देखा जाता है।
      नोट: ऑक्सीजन की खपत और ऊर्जा व्यय के कच्चे मूल्यों को प्राप्त करने से ANCOVA विश्लेषण की सुविधा मिलती है।
    9. 0.5-0.6 एल / मिनट पर चयापचय पिंजरे के लिए एयरफ्लो दर सेट करें।
    10. प्रयोग सेटअप विंडो पर, फ़ाइल सहेजने वाले पथ और नाम का चयन करें. बैकअप निर्देशिका (चित्र 2D) का चयन करें।
    11. फीडर में भोजन की एक पूर्व-भारित मात्रा जोड़ें जो 1 दिन के लिए कम से कम भोजन का सेवन कवर करता है।
      नोट: यदि पिंजरों में एकीकृत तराजू हैं, तो भोजन को सीधे जोड़ा जा सकता है, और सॉफ़्टवेयर इसे रिकॉर्ड करेगा।
    12. पानी की बोतलें डालें। जांचें कि बोतल सही ढंग से सील है और रिसाव नहीं करती है।
    13. भोजन जोड़ने के 24 घंटे बाद, पिंजरे पर छोड़े गए भोजन का वजन करें।
      नोट: बचे हुए भोजन के ग्राम को छोड़कर जोडऩे वाले भोजन के ग्राम भोजन के सेवन को मापेंगे।
    14. ऑक्सीजन, सीओ 2, और गतिविधि माप (चरण 1.4.10) शुरू करें एक बार जब भोजन का सेवन मूल्य नियमित पिंजरों में रखे गए चूहों के समान हो।
      नोट: यहाँ, acclimation अवधि (आमतौर पर 2-3 दिन) पूरा हो गया है, और ऊर्जा व्यय माप शुरू कर सकते हैं।
  4. अप्रत्यक्ष कैलोरीमेट्री और गतिविधि माप ऊर्जा व्यय का आकलन करने के लिए
    1. माप शुरू करने से पहले सभी चूहों के शरीर के वजन, वसा और दुबला द्रव्यमान को मापें।
      नोट: ये शरीर के वजन और दुबला द्रव्यमान मान ANCOVA विश्लेषण करने के लिए उपयोग किए जाते हैं।
    2. अनुशंसित ऑक्सीजन एकाग्रता के साथ CLAMS सिस्टम के O2 और CO2 Zirconia-आधारित डिटेक्टर ( सामग्री की तालिका देखें) को कैलिब्रेट करें; हमेशा एक नया प्रयोग शुरू करने से पहले डिटेक्टर को फिर से कैलिब्रेट करें।
    3. ज्ञात संरचना (20.50% ऑक्सीजन और 0.50% CO2) की एक अंशांकन गैस का उपयोग करें।
      नोट: गैस आपूर्तिकर्ता अक्सर इस गैस को "प्राथमिक मानक ग्रेड" के रूप में संदर्भित करते हैं।
    4. चालू करें और सुनिश्चित करें कि टैंक आउटपुट दबाव 5-10 साई पर है।
    5. कैलिब्रेट करने और गैस सेंसर (चित्रा 2E) का परीक्षण करने के लिए अंशांकन उपयोगिता सॉफ़्टवेयर खोलें। प्रयोग पर क्लिक करें, फिर कैलिब्रेट करें।
    6. प्रारंभ दबाएँ. फिर, सेंसर का परीक्षण करने के लिए और सॉफ़्टवेयर के लिए उपयोगकर्ता को गैस सेंसर (चित्रा 2 एफ) के knobs को चालू करने के लिए कहने के लिए प्रतीक्षा करें जब तक कि O2 पहचान का मूल्य 1 (चित्रा 2 G-H) न हो। चरण पूर्ण होने पर अगला क्लिक करें.
      नोट:: अंशांकन सुविधा सभी वर्तमान चरणों को निष्पादित करता है, तो अंशांकन स्वचालित रूप से अगले चरण के लिए आगे बढ़ेगा जब प्रगति पट्टी भर जाता है।
    7. सभी चरणों के पूर्ण हो जाने पर अंशांकन परिणाम सत्यापित करें, और परिणाम प्रस्तुत किए जाते हैं।
    8. अंशांकन गैस बंद करें।
    9. भोजन बदलें और 48-72 घंटे की अवधि के लिए पर्याप्त भोजन जोड़ें।
      नोट: यद्यपि शरीर के वजन की निगरानी करने और भोजन को दैनिक रूप से बदलने के लिए ऊर्जा व्यय माप के दौरान पिंजरों को खोला जा सकता है, चूहों को इन जोड़तोड़ द्वारा जोर दिया जा सकता है, और जब पिंजरों को खोला जाता है तो माप खो जाते हैं। इस प्रकार, माप अवधि के दौरान किसी भी हेरफेर से बचने की सिफारिश की जाती है।
    10. सॉफ़्टवेयर में, प्रयोग पर क्लिक करें और फिर ऑक्सीजन, CO2, और गतिविधि माप (चित्रा 3A) शुरू करने के लिए चलाएँ।
      नोट:: माप के निष्पादन को सॉफ़्टवेयर के निचले बाएँ अनुभाग (लाल आयत, चित्रा 3B) पर स्थित बॉक्स में वास्तविक समय में ट्रैक किया जा सकता है. चित्रा 3B में लाल आयत से पता चलता है कि सिस्टम अंतराल # 3 पर पिंजरे # 1 को मापता है, अर्थात् तीसरा माप। एक पिंजरे में एक माप में लगभग 1 मिनट लग सकते हैं। इस प्रकार, 12 पिंजरों के साथ जुड़े हुए, ऑक्सीजन की खपत को लगभग हर 12 मिनट में मापा जा सकता है। कम से कम 48 घंटे के लिए निरंतर माप की सिफारिश की जाती है।
    11. प्रयोग पर क्लिक करके प्रयोग रोकें और फिर रोकें (चित्र3C).
    12. पिंजरों को खोलें, चूहों और भोजन का वजन करें। 48-72 घंटे माप अवधि में उत्सर्जित कैलोरी और लिपिड की संख्या की गणना करने के लिए मल एकत्र करें।
      नोट: मल को बाद के विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। इन पिंजरों का उपयोग मूत्र एकत्र करने के लिए प्रभावी ढंग से नहीं किया जा सकता है।
    13. प्रयोगों पर क्लिक करें, फिर निर्यात करें, और एक CSV फ़ाइल (चित्रा 3 डी) के रूप में सभी विषयों को निर्यात करें।
      नोट: ANCOVA विश्लेषण की सुविधा के लिए, शरीर के वजन से सामान्यीकृत किए बिना कच्चे ऑक्सीजन की खपत (VO2) और CO2 उत्पादन (VCO2) मूल्यों को निर्यात करना आवश्यक है।
  5. डेटा विश्लेषण और गुणवत्ता नियंत्रण
    1. निर्यात किए गए CSV पत्रक (चित्रा 3D) (चरण 1.4.13 से) में, ऑक्सीजन की खपत (VO2) और CO2 उत्पादन (VCO2) के कच्चे मूल्यों का उपयोग करें, जो 2-3 दिन की अवधि में हर 12 मिनट में मापा जाता है जो स्वचालित रूप से सॉफ़्टवेयर द्वारा सूचीबद्ध होते हैं और एक टाइमस्टैम्प शामिल करते हैं, अर्थात् जब उन्हें मापा गया था तो घंटा और दिनांक।
      नोट: VO2 और VCO2 मान स्वचालित रूप से सही हो जाएगा यदि शरीर के वजन या दुबला द्रव्यमान मान जोड़े जाते हैं।
    2. निर्यात किए गए CSV पत्रक में, श्वसन विनिमय अनुपात (RER: VCO2/VO2) के कच्चे मानों का उपयोग करें जो स्वचालित रूप से परिकलित किए जाते हैं और सॉफ़्टवेयर द्वारा उनके टाइमस्टैम्प के अनुसार सूचीबद्ध होते हैं.
      नोट: 1 के करीब मान ों से पता चलता है कि माउस मुख्य रूप से कार्बोहाइड्रेट को ऑक्सीकरण करता है, जबकि 0.7 के करीब मान यह दर्शाते हैं कि माउस मुख्य रूप से वसा का ऑक्सीकरण कर रहा है। 1 से ऊपर आरईआर एनारोबिक व्यायाम के दौरान हो सकता है, क्योंकि शरीर लैक्टेट के कारण एसिडोसिस की भरपाई करने के लिए अधिक सीओ 2 को निष्कासित करता है। 1 से अधिक आरईआर तनाव का संकेत दे सकता है। निर्यात की गई CSV फ़ाइल में ऊर्जा व्यय (ईई) या माउस प्रति मिनट कैलोरी में गर्मी उत्पादन से कच्चे मूल्य भी शामिल हैं, जो 2-3 दिनों में हर 12 मिनट में मापा जाता है। यहाँ, सभी सूचीबद्ध मानों में एक टाइमस्टैम्प शामिल है.
    3. चूंकि ANCOVA के लिए प्रति माउस एकल EE मानों की आवश्यकता होती है, इसलिए प्रकाश (दिन) चरण के लिए 09:00-16:00 और माउस और दिन प्रति अंधेरे (रात) चरण के लिए 19:00-04:00 के बीच दर्ज किए गए EE मानों का औसतन करें।
      नोट:: यह मैन्युअल रूप से Excel या ग्राफ़ पैड का उपयोग कर किया जा सकता है। इन दो-बार खिड़कियों का चयन करने से मध्यवर्ती, क्रमिक और अस्थिर ईई मानों के औसत से बचा जाता है जो प्रकाश-अंधेरे चरण संक्रमण से जुड़े होते हैं।
    4. 48 h अवधि के लिए, दो डेलाइट मानों के औसत और Excel या ग्राफ़ पैड का उपयोग करके प्रति माउस दो अंधेरे चरण मानों की गणना करें.
    5. कुल शारीरिक गतिविधि को मापने के लिए, एक्सेल या ग्राफ पैड का उपयोग एक्स, वाई, और जेड बीम ब्रेक गिनती को चयापचय पिंजरों में मापा जाता है और प्रत्येक माउस के लिए सीएसवी फ़ाइल में सूचीबद्ध होता है।
      नोट:: x,y,z कुल गतिविधि की गणना पहले प्रत्येक X, Y, Z प्रति माउस और चक्र का औसत मान करके की जाती है। फिर, माउस और चक्र प्रति प्रत्येक औसत X, Y, Z मानों का योग डेटा को चित्र 5E (2 दिनों का औसत होने के नाते) के रूप में प्लॉट करने के लिए निर्धारित किया जाता है।
    6. वैकल्पिक रूप से, समय के साथ प्रत्येक माप मान दिखाने वाले डेटा का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो घटता उत्पन्न करता है जो प्रकाश से अंधेरे चक्रों में संक्रमण के दौरान ईई में परिवर्तन को दर्शाता है।
      नोट:: कृपया चर्चा अनुभाग को कैसे और कब ANCOVA विश्लेषण करने के लिए, और VO2, VCO2, और EE की गणना करने के लिए उपयोग किए जाने वाले विभिन्न सूत्र अनुपूरक फ़ाइल 1 में प्रदान किए गए हैं।

2. ऊर्जा खर्च करने के लिए thermogenic adipocytes की क्षमता का मापन

  1. माप और माउस उपचार सेट करें। ऑक्सीजन की खपत की निगरानी के लिए प्रयोगात्मक तैयारियों पर विवरण के लिए चरण 1 देखें, क्योंकि एडिपोसाइट्स में थर्मोजेनिक क्षमता अप्रत्यक्ष रूप से 2.1.1-2.2.2 चरणों के बाद ऑक्सीजन की खपत द्वारा निर्धारित की जाती है।
    नोट: इस प्रोटोकॉल को बीटा -3 रिसेप्टर एगोनिस्ट सीएल -316,243 के साथ माउस संज्ञाहरण और तीव्र उपचार की आवश्यकता होती है ( सामग्री की तालिका देखें), बीए थर्मोजेनिक क्षमता का तेजी से मूल्यांकन देता है।
    1. शरीर की संरचना विश्लेषण करें और चूहों का वजन करें। CLAMS को चालू करें, 30 डिग्री सेल्सियस (थर्मोन्यूट्रैलिटी) पर तापमान सेट करें, और पूरे सिस्टम को गर्म करने के लिए 2 घंटे तक प्रतीक्षा करें।
    2. परख शर्तों के बाकी सेट, प्रकाश सहित, प्रत्येक पिंजरे के लिए माउस आईडी असाइन करें और इसी पिंजरे में प्रत्येक माउस के शरीर के वजन मूल्य जोड़ें यदि समूहों के बीच शरीर के वजन में कोई अंतर नहीं देखा जाता है।
    3. 1.4.2-1.4.7 चरणों के रूप में ऑक्सीजन / सीओ 2 डिटेक्टर कैलिब्रेट करें।
    4. सॉफ़्टवेयर में प्रयोग प्रारंभ करें।
    5. पेंटोबार्बिटल (60-120 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ प्रत्येक माउस को इंजेक्ट करें और प्रत्येक माउस को उनके असाइन किए गए चयापचय पिंजरे (चरण 2.1.2) में रखें।
      नोट: thermoneutrality (30 डिग्री सेल्सियस) पर सोते हुए चूहों को बनाए रखने के लिए आवश्यक पेंटोबार्बिटल की खुराक माउस तनाव और जीनोटाइप के साथ भिन्न होती है। 50 से 120 मिलीग्राम / किलोग्राम तक विभिन्न पेंटोबार्बिटल खुराक का परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है और माउस को 30 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 घंटे के दौरान एनेस्थेटिक रखने वाले को चुना जाता है। ऊर्जा व्यय में शारीरिक गतिविधि के योगदान को दूर करने के लिए कुशल संज्ञाहरण आवश्यक है।
    6. संज्ञाहरण सुनिश्चित करने के लिए, पेंटोबार्बिटल इंजेक्शन के बाद चूहों का निरीक्षण करें जब तक कि वे पूरी तरह से सो नहीं जाते हैं और उनकी कम ऑक्सीजन की खपत दर स्थिर हो जाती है।
    7. CL-316,243 को इंजेक्ट करने से पहले कम से कम 3 स्थिर लगातार ऑक्सीजन खपत दर प्राप्त करने के लिए प्रतीक्षा करें।
      नोट: ऑक्सीजन की खपत के स्थिरीकरण की प्रतीक्षा करते समय, प्रत्येक माउस (1 मिलीग्राम / किग्रा) के लिए सीएल -316,243 के साथ सिरिंज तैयार करें।
    8. खुला पिंजरे # 1 और एक VO2 और VCO2 माप के तुरंत बाद CL-316,243 चमड़े के नीचे इंजेक्ट पिंजरे # 1 में हुआ। इंजेक्शन के तुरंत बाद माउस को पिंजरे # 1 पर वापस कर दें।
      नोट:: माप सॉफ़्टवेयर के नीचे-बाएँ अनुभाग (चित्रा 3B, लाल आयत) में वास्तविक समय में इंगित किया जा रहा है।
    9. पिंजरे # 2 को मापा जाने के लिए प्रतीक्षा करें (चित्रा 3 बी, लाल आयत) और फिर पिंजरे # 2 के लिए चरण 2.1.8 के रूप में आगे बढ़ें।
      नोट: एक माप के तुरंत बाद CL-316,243 इंजेक्ट करना इंजेक्शन के बीच समय स्थिरांक बनाए रखने की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, यदि 12 चूहे / पिंजरे चल रहे हैं, तो अलग-अलग पिंजरों में अनुक्रमिक रूप से एकत्र किए गए माप और संग्रह प्रति पिंजरे 55 सेकंड तक चलने के साथ, तो आपको हर मिनट एक माउस इंजेक्ट करना चाहिए। इन इंजेक्शन दरों के साथ, पहला माप सभी 12 पिंजरों में इंजेक्शन के बाद 12 मिनट के बाद होगा।
    10. ऊर्जा व्यय माप को तब तक जारी रखें जब तक कि ऊर्जा व्यय मूल्य 5-6 लगातार मापों के लिए पठार न हो, आमतौर पर इंजेक्शन के बाद 90-180 मिनट।
      नोट: प्रयोगों के दौरान चूहों संज्ञाहरण से जाग सकता है। इन चूहों को विश्लेषण से हटाने की आवश्यकता है। इसलिए, पहले से ही पेंटोबार्बिटल खुराक का परीक्षण अध्ययन की दक्षता में वृद्धि करेगा।
    11. ऊर्जा व्यय माप को रोकें, लेकिन चूहों को 30 डिग्री सेल्सियस पर अपने पिंजरों में रखें, जब तक कि वे जाग न जाएं।
    12. चूहों के पूरी तरह से जागने के बाद, चूहों के स्वास्थ्य का निरीक्षण करें और उन्हें अपने प्रारंभिक पिंजरों में वापस कर दें।
    13. उपकरण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके प्रत्येक माउस के डेटा को CSV फ़ाइल के रूप में निर्यात करें, जैसा कि अनुभाग 1.4.13 में वर्णित है।
  2. डेटा विश्लेषण
    नोट:: डेटा विश्लेषण Excel या Graphpad द्वारा किया गया था
    1. VO2, VCO2, और EE के 3-5 लगातार मूल्यों को प्लॉट करें जो समय के साथ स्थिर और स्थिर होते हैं, क्योंकि ये चयापचय दर का प्रतिनिधित्व करने वाले मूल्य हैं जब चूहों को पूरी तरह से एनेस्थेटिक किया जाता है।
    2. फिर, इंजेक्शन के बाद प्राप्त पहले और निम्नलिखित लगातार VO2, VCO2, और EE माप को प्लॉट करें।
      नोट: EE के निरपेक्ष मूल्यों और इंजेक्शन द्वारा प्रेरित ईई में गुना वृद्धि बीए thermogenic function7 का संकेत मिलता है।

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Representative Results

चित्रा 4 VO2, VCO2, गर्मी उत्पादन / ऊर्जा व्यय (ईई), श्वसन विनिमय अनुपात (आरईआर), और एक्स, वाई, जेड सीएलएएमएस प्रणाली के चयापचय पिंजरों का उपयोग करके प्राप्त शारीरिक गतिविधि मूल्यों को दर्शाता है। CLAMS प्रणाली द्वारा प्रदान की गई VO2 और VCO2 प्रति मिनट गैस (एमएल) की मात्रा है और माप शुरू करने से पहले CLAMS सॉफ़्टवेयर में इन वजन मूल्यों को दर्ज करके शरीर के वजन या दुबला द्रव्यमान मूल्यों से पहले से ही विभाजित किया जा सकता है। हालांकि, शरीर के वजन के मूल्यों को दर्ज नहीं किया जाना चाहिए यदि चूहों के समूहों के बीच शरीर के वजन में अंतर देखा जाता है, क्योंकि ANCOVA विश्लेषण की आवश्यकता होती है और ऑक्सीमैक्स सॉफ़्टवेयर इन गणनाओं को नहीं कर सकता है। ऊर्जा व्यय (ऊष्मा) की गणना लुस्क समीकरण का उपयोग करके kcal/h में की जाती है। चूहे निशाचर होते हैं और रात / अंधेरे अवधि के दौरान अधिक ऊर्जा खर्च करते हैं, जिसका अर्थ है कि ऊर्जा व्यय गणना को प्रकाश चक्र के अनुसार अलग करने की आवश्यकता होती है। जैसा कि अपेक्षित था, अंधेरे चरण के दौरान चूहों में उच्च O2 खपत, CO2 उत्पादन, और इस प्रकार उच्च EE होता है, जैसा कि चित्रा 4C में दिखाया गया है। एक नियमित आहार पर चूहों और खिलाया राज्य में, अंधेरे चक्र में होने वाले भोजन के अंतर्ग्रहण के साथ, आरईआर मूल्यों की विशेषता है 1 (चित्रा 4 डी) के करीब, जिसका अर्थ है कार्बोहाइड्रेट का उपयोग करने के लिए एक वरीयता। प्रकाश चक्र के दौरान, जब चूहे ज्यादातर सोते हैं और इस प्रकार तेजी से सोते हैं, तो वसा ऑक्सीकरण में बदलाव होता है, आरईआर मूल्यों के साथ 0.7 के करीब होता है। तदनुसार, शारीरिक गतिविधि, एक्स, वाई, जेड लेजर बीम ब्रेक गिनती के रूप में मापा जाता है, अंधेरे चरण के दौरान बढ़ता है और प्रकाश चरण (चित्रा 4 ई) के दौरान कम हो जाता है।

हमने 16 सप्ताह की मादा चूहों की तुलना में चाउ-फेड चूहों को एक उच्च वसा वाले आहार (8 सप्ताह) खिलाया, जिससे शरीर के वजन में अंतर के साथ चूहों के समूहों के बीच ऊर्जा व्यय की तुलना की जा सकती है। जैसा कि अपेक्षित था, उच्च वसा वाले आहार को खिलाने से दुबला द्रव्यमान (चित्रा 5 ए-सी) को बदलने के बिना वसा द्रव्यमान बढ़ जाता है। उच्च वसा वाले आहार-खिलाए गए चूहों ने अधिक किलो कैलोरी / दिन खाया, मुख्य रूप से भोजन के प्रति ग्राम उच्च कैलोरी घनत्व के कारण (चित्रा 5 डी)। इसके अलावा, शारीरिक गतिविधि चाउ, और उच्च वसा वाले आहार-खिलाए गए चूहों के बीच समान थी, यहां तक कि अंधेरे अवधि (चित्रा 5 ई) के दौरान भी। आरईआर के निचले मूल्य ऑक्सीकरण के लिए प्राथमिक सब्सट्रेट के रूप में वसा का उपयोग करने के लिए उच्च वसा वाले आहार-खिलाए गए चूहों की प्राथमिकता दिखाते हैं, जैसा कि उच्च वसा सेवन और मांसपेशियों के इंसुलिन प्रतिरोध (चित्रा 5 एफ) के साथ अपेक्षित है। उच्च वसा वाले आहार-खिलाए गए चूहों में ऑक्सीजन की खपत बढ़ जाती है, लेकिन सीओ 2 उत्पादन नहीं (चित्रा 5 जी-एच)। उच्च वसा वाले आहार-खिलाए गए चूहों में ऑक्सीजन की खपत में वृद्धि माउस प्रति गर्मी उत्पादन / ऊर्जा व्यय में महत्वपूर्ण वृद्धि के साथ है (चित्रा 5I)। हालांकि, प्रत्येक माउस के दुबला द्रव्यमान द्वारा ऊर्जा व्यय को विभाजित करने से ऊर्जा व्यय (चित्रा 5 जे) में कोई अंतर नहीं हुआ, जबकि कुल शरीर के वजन से विभाजित करने से उच्च वसा वाले आहार-खिलाए गए चूहों (चित्रा 5K) में ऊर्जा व्यय में कमी देखी गई। संचयी रूप से, इन परिणामों से संकेत मिलता है कि दुबला द्रव्यमान या कुल शरीर के वजन से ऊर्जा व्यय डेटा को विभाजित करने से ऊर्जा व्यय पर उच्च वसा वाले आहार के प्रभावों पर विपरीत निष्कर्ष निकल सकते हैं। जैसा कि कई अध्ययनों द्वारा सुझाया गया है, सहप्रसरण (ANCOVA) का विश्लेषण यह निर्धारित करने की अनुमति देता है कि क्या ऊर्जा व्यय में अंतर शरीर के वजन में परिवर्तन से स्वतंत्र रूप से मौजूद हैं। इस बिंदु को स्पष्ट करने के लिए, एक ANCOVA विश्लेषण चित्र5A-K में दिखाए गए एक ही डेटा का उपयोग करके किया गया था, जिसमें ऊर्जा व्यय निर्भर चर और शरीर के वजन या दुबला द्रव्यमान कोवरिएट्स के रूप में किया गया था। जबकि एक कोवरिएट के रूप में कुल शरीर के वजन का उपयोग करके ANCOVA प्रदर्शन उच्च वसा वाले आहार-खिलाए गए चूहों के लिए उच्च ऊर्जा व्यय (चित्रा 5L) के लिए केवल एक प्रवृत्ति दिखाता है, उच्च वसा वाले आहार-खिलाए गए चूहों ऊर्जा व्यय में महत्वपूर्ण वृद्धि दिखाते हैं जब दुबला द्रव्यमान का उपयोग किया जाता है (चित्रा 5 एम)। इन आंकड़ों से पता चलता है कि ANCOVA विश्लेषण करने के लिए कुल शरीर के वजन का उपयोग करना ऊर्जा व्यय को कम करके आंका जा सकता है। कारण यह हो सकते हैं कि: (1) वसा ऊतक केवल कुल ऊर्जा व्यय के ~ 5% में योगदान देता है और (2) उच्च वसा वाले आहार से प्रेरित वसा द्रव्यमान का लाभ मुख्य रूप से एडिपोसाइट्स में ट्राइग्लिसराइड सामग्री के विस्तार से होता है, बजाय ऑक्सीडेटिव थर्मोजेनिक एडिपोसाइट्स की संख्या में वृद्धि से।

ब्राउन और बेज एडिपोसाइट्स (बीए) थर्मोजेनेसिस में योगदान करते हैं और परिणामस्वरूप कृन्तकों में ऊर्जा व्यय में योगदान करते हैं। वीवो में ऊर्जा व्यय में बीए के योगदान को केवल पूरे शरीर की ऑक्सीजन की खपत को मापने और बीएमआर की गणना करके निर्धारित नहीं किया जा सकता है, क्योंकि कई ऊतक ऑक्सीजन की खपत करते हैं। विवो में बीए थर्मोजेनिक क्षमता निर्धारित करने के लिए दृष्टिकोण में पहले संज्ञाहरण शामिल है, जो सभी ऊतकों में ऑक्सीजन की खपत को सीमित करने के लिए आवश्यक है। फिर संज्ञाहरण को थर्मोजेनेसिस को सक्रिय करने के लिए एक औषधीय दृष्टिकोण के साथ जोड़ा जाता है, ज्यादातर थर्मोजेनिक बीए में। चूंकि बीटा -3 एड्रीनर्जिक रिसेप्टर्स मुख्य रूप से वसा ऊतक में व्यक्त किए जाते हैं, बीटा -3 एड्रीनर्जिक एगोनिस्ट सीएल -316,243 का उपयोग बीए थर्मोजेनिक फ़ंक्शन को सक्रिय करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, एनेस्थेटिक चूहों को 30 डिग्री सेल्सियस पर तापमान-नियंत्रित बाड़े में रखा जा सकता है, ताकि परिवेश थर्मल तनाव से प्रेरित किसी भी अनियंत्रित सहानुभूति बीए सक्रियण को रोका जा सके। चित्रा 6 से पता चलता है कि चूहों ने पेंटोबार्बिटल के साथ एक उच्च वसा वाले आहार को खिलाया और उप-मानक चयापचय दर (चित्रा 6 ए-सी, डी) पर ऊर्जा व्यय रिकॉर्ड करने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर चयापचय पिंजरों में रखा। इस माप के बाद CL-316,243 इंजेक्शन था, जिसने ऑक्सीजन की खपत, CO2 उत्पादन और ऊर्जा व्यय को बढ़ाया, जैसा कि बीए सक्रियण (चित्रा 6A-C) से अपेक्षित था। बीटा -3 एगोनिस्ट उपचार के बाद ऊर्जा व्यय में 2-3 गुना वृद्धि का पता लगाया जा सकता है7।

Figure 1
चित्र 1: पर्यावरणीय बाड़े और व्यक्तिगत चयापचय पिंजरों की असेंबली के साथ चयापचय पिंजरों। (ए) पर्यावरणीय बाड़े में चयापचय पिंजरे। (बी) बाड़े में 12 चयापचय पिंजरों को रखा जा सकता है और तापमान और प्रकाश को नियंत्रित करने की अनुमति देता है। (सी) असेंबली से पहले चयापचय पिंजरों के घटक। (डी) ढक्कन के साथ सील किए गए मेटाबोलिक पिंजरों। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: प्रयोगात्मक सेटअप और ऑक्सीजन सेंसर के अंशांकन. (ए) चयापचय पिंजरों को नियंत्रित करने वाले ऑक्सीमैक्स सॉफ़्टवेयर का एक स्क्रीनशॉट, (बी) प्रयोगात्मक गुणों, अर्थात् परिवेश प्रकाश और तापमान को सेट करने के लिए एक "प्रयोगात्मक कॉन्फ़िगरेशन" विंडो के चयन और उद्घाटन को दिखाता है। फिर, प्रयोग (सी) "प्रयोगात्मक सेटअप" विंडो का उपयोग करके एक माउस आईडी, शरीर का वजन, या प्रत्येक पिंजरे के लिए दुबला द्रव्यमान, साथ ही साथ 12 पिंजरों के लिए एयरफ्लो दर असाइन करने के लिए कॉन्फ़िगर किया गया है। (D) एक ही "प्रयोगात्मक सेटअप" विंडो में, एक फ़ाइल-बचत पथ का चयन किया जा सकता है। (ई) गैस सेंसर को कैलिब्रेट करने के लिए, उपयोगकर्ता को (एफ) गैस डिटेक्टर पर घुंडी को चालू करने की आवश्यकता होती है ताकि (जी-एच) ओ 2 पहचान को 1 में समायोजित किया जा सके। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: माप का प्रारंभ और रोकना. (A) प्रयोग "प्रयोग" पर क्लिक करके शुरू किया जाता है, फिर "भागो" पर क्लिक करके। (बी) उपयोगकर्ता देख सकते हैं, वास्तविक समय, 12 पिंजरों में से कौन सा वर्तमान में मापा जा रहा है (लाल आयत), साथ ही साथ पहले से ही एकत्र किए गए माप के साथ एक तालिका। (C) प्रयोग को "प्रयोग" पर क्लिक करके रोका जा सकता है, फिर "रोकें" पर क्लिक करके। (D) डेटा को "फ़ाइल" पर क्लिक करके Excel में निर्यात किया जा सकता है, फिर "निर्यात करें" और फिर "सभी विषयों को निर्यात करें CSV." कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: मेटाबोलिक पैरामीटर प्राप्त किए गए। (क) ऑक्सीजन की खपत। (बी) सीओ 2 उत्पादन। (c) ऊर्जा व्यय (ईई) दुबला द्रव्यमान के लिए सामान्यीकृत। (d) श्वसन विनिमय अनुपात (RER)। (ई) शारीरिक गतिविधि के स्तर की गणना एक्स, वाई, जेड लेजर बीम ब्रेक गिनती के योग के रूप में की जाती है। डेटा SEM ± माध्य दिखाता है। छात्र का t-test, ** P < 0.01, ***P < 0.001. n = 7-8 मादा चूहों प्रति समूह. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: ANCOVA विश्लेषण मोटापे से ग्रस्त चूहों में ऊर्जा व्यय में परिवर्तन की उचित व्याख्या की अनुमति देता है। (ए-एम) मादा चूहों में माप 8 सप्ताह के लिए या तो चाउ या उच्च वसा वाले आहार (एचएफडी) खिलाया जाता है। (a) शरीर का वजन। (बी) वसा द्रव्यमान। (c) दुबला द्रव्यमान। (d) भोजन का सेवन। छात्र का टी-टेस्ट, *** पी < 0.001। (ई) एक्स, वाई, जेड (एफ) श्वसन गुणांक अनुपात (आरईआर) में लेजर बीम ब्रेक की गिनती के रूप में चयापचय पिंजरों के साथ शारीरिक गतिविधि का मूल्यांकन किया गया था। (जी) ऑक्सीजन की खपत (वीओ 2)। (एच) सीओ 2 उत्पादन (वीसीओ 2)। (I) ऊर्जा व्यय (ईई) को अप्रत्यक्ष कैलोरीमेट्री द्वारा मापा गया था। ऊर्जा व्यय (जे) दुबला द्रव्यमान और (के) शरीर के वजन के लिए सामान्यीकृत किया गया था। * पी < 0.05 दो-एनोवा का उपयोग कर. ** पी< 0.01, ***पी< 0.001. (एल) रात में ऊर्जा व्यय (ईई) बनाम कुल शरीर के वजन या (एम) दुबला द्रव्यमान का कोवरिएट विश्लेषण (एएनसीओवीए)। डैश्ड लाइनें प्रत्येक समूह में VO2 और EE को निर्धारित करने के लिए मॉडलिंग किए गए औसत शरीर वजन मूल्यों का प्रतिनिधित्व करती हैं। * पी < 0.05 ANCOVA का उपयोग कर. n = 7-8 मादा चूहों प्रति समूह. डेटा SEM ± माध्य दिखाता है। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: चयनात्मक π3-एगोनिस्ट, CL-316,243 तीव्र रूप से thermoneutrality पर anesthetized चूहों में ऊर्जा व्यय बढ़ जाती है। मादा चूहों को पेंटोबार्बिटल (60 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ बेहोश किया गया था और 30 डिग्री सेल्सियस पर सेट चयापचय पिंजरों में रखा गया था। संज्ञाहरण के तहत ऊर्जा व्यय तब तक दर्ज किया गया था जब तक कि लगातार 3 मापों ने समान मूल्यों को नहीं दिखाया, जो पूर्ण संज्ञाहरण को दर्शाता है। पिंजरे # 1 से माउस को ऑक्सीजन की खपत माप के तुरंत बाद सीएल -316,243 (1 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ इंजेक्ट किया गया था। एक ही इंजेक्शन दृष्टिकोण का उपयोग अन्य पिंजरों में यह सुनिश्चित करने के लिए किया गया था कि सभी चूहों में इंजेक्शन और पहले माप के बीच एक ही समय बीत गया। (क) ऑक्सीजन की खपत। (बी) सीओ 2 उत्पादन। (ग) ऊर्जा व्यय। n = 4 मादा चूहे। डेटा SEM ± माध्य दिखाता है। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 1: CLAMS प्रणाली में Oxymax सॉफ़्टवेयर द्वारा ऑक्सीजन की खपत, CO2 उत्पादन और ऊर्जा व्यय की गणना करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सूत्र। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

अप्रत्यक्ष कैलोरीमेट्री का उपयोग वर्षों से पूरे शरीर के ऊर्जा व्यय का आकलन करने के लिए किया गया है। यहां वर्णित यह प्रोटोकॉल बेसल चयापचय दर को मापने और चयापचय पिंजरों का उपयोग करके विवो में बीए थर्मोजेनिक क्षमता का निर्धारण करने का एक सीधा तरीका प्रदान करता है।

यहां वर्णित अप्रत्यक्ष कैलोरीमेट्री विधि इस बात की पुष्टि करती है कि शरीर के वजन मूल्यों द्वारा ऊर्जा व्यय मूल्यों को विभाजित करना भ्रामक हो सकता है। उदाहरण के लिए, यह निष्कर्ष निकाल सकता है कि मोटापे के साथ सभी माउस मॉडल में ऊर्जा व्यय व्यवस्थित रूप से कम है। हालांकि, मोटापे के कुछ माउस मॉडलों में कुल ऊर्जा व्यय अधिक हो सकता है, जैसा कि मोटापे के लिए अग्रणी भोजन के सेवन में वृद्धि के मामले में होता है। इसलिए, वसा द्रव्यमान द्वारा ऊर्जा व्यय को विभाजित करने से हमेशा ऊर्जा व्यय में प्राथमिक दोषों के बिना मोटापे से ग्रस्त चूहों में मोटापे के लिए जिम्मेदार प्रक्रिया की गलत व्याख्या होगी। इसके अलावा, दुबला द्रव्यमान द्वारा विभाजित करना भी अनुचित है जब दुबला द्रव्यमान में परिवर्तन होता है, क्योंकि दुबला द्रव्यमान ऊर्जा व्यय के साथ सह-भिन्न होता है, और ऊर्जा व्यय दुबला द्रव्यमान में किसी भी बदलाव की तुलना में अधिक महत्वपूर्ण कमी दिखा सकता है। इसका मतलब यह है कि शरीर के वजन या दुबला द्रव्यमान द्वारा ऊर्जा व्यय का विभाजन केवल तभी किया जा सकता है जब शरीर के वजन या शरीर की संरचना (यानी, दुबला द्रव्यमान और वसा द्रव्यमान) में कोई परिवर्तन परीक्षण किए गए समूहों के बीच नहीं देखा जाता है। नतीजतन, सबसे सुरक्षित दृष्टिकोण ANCOVA प्रदर्शन करना है। इस विषय पर उत्कृष्ट लेखों में व्यापक रूप से चर्चा की गई है, उनमें से सभी ने निष्कर्ष निकाला है कि कुल शरीर के वजन या दुबला द्रव्यमान 4,5 में अंतर के साथ चूहों के समूहों के बीच ऊर्जा व्यय की तुलना करने के लिए सहप्रसरण (ANCOVA) का विश्लेषण आवश्यक है। यहां, सिग्माप्लॉट का उपयोग इन-हाउस एनकोवा विश्लेषण करने के लिए किया गया था, लेकिन कई अन्य उन्नत सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है। CalR वेबसाइट अपने टेम्पलेट्स में से एक में डेटा अपलोड करने की अनुमति देती है, लेकिन यह हमेशा प्रयोगात्मक डिजाइन 5 के आधार पर संभव नहीं हो सकता है। ANCOVA "इन-हाउस" करने के लिए सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर होने से डेटा विश्लेषण और प्रस्तुति पर अधिक लचीलापन मिलता है, लेकिन यह अधिक समय लेने वाला है6।

चूहों के लिए थर्मोन्यूट्रलिटी लगभग 30 डिग्री सेल्सियस है, जो थर्मोजेनिक ब्राउन और बेज एडिपोसाइट्स (बीए) 1 की गतिविधि को दबा देती है। परिवेश का तापमान (21 डिग्री सेल्सियस) थर्मोन्यूट्रलिटी से नीचे है, जिसका अर्थ है कि बीए थर्मोजेनेसिस 21 डिग्री सेल्सियस पर रखे गए चूहों में ऊर्जा व्यय में योगदान देगा। तो, परिवेश के तापमान बनाम पर चूहों के बीच ऊर्जा व्यय में अंतर। थर्मोन्यूट्रलिटी पर चूहों का उपयोग कम आक्रामक तरीके से ऊर्जा व्यय में बीए के योगदान को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, इस प्रक्रिया के लिए 4 सप्ताह के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर बाड़े के निरंतर उपयोग की आवश्यकता होती है, थर्मोन्यूट्रलिटी के साथ भी शारीरिक गतिविधि में अंतर होता है। इसके अलावा, थर्मोन्यूट्रलिटी अन्य ऊतकों में चयापचय परिवर्तन को प्रेरित करती है, न कि केवल बीए में। एक ऐसे संदर्भ में जहां मुख्य उद्देश्य बीए थर्मोजेनिक क्षमता में परिवर्तनों का अध्ययन करना है, यहां वर्णित औषधीय दृष्टिकोण में लंबी अवधि में थर्मोन्यूट्रलिटी में आवास चूहों पर लाभों की एक सूची है।

परिणाम कुछ घंटों में प्राप्त किए जाते हैं, और संज्ञाहरण ऊर्जा व्यय में शारीरिक गतिविधि और अन्य व्यवहार परिवर्तनों के योगदान को दबा देता है। चूहों में आनुवांशिक जोड़तोड़ के प्रभावों का आकलन करते समय, बीए और अन्य ऊतकों में चयापचय को बदला जा सकता है। इस प्रकार, एनेस्थेटिक चूहों में सीएल -316,243 उपचार वह दृष्टिकोण है जो बीए गतिविधि में परिवर्तन को उच्च गतिशील सीमा और विशिष्टता के साथ समझ सकता है, जिसमें अन्य ऊतकों से उपजी ऊर्जा व्यय से कम confounders होते हैं। वैकल्पिक रूप से, CL-316,243 को जागरूक चूहों में इंजेक्ट किया जा सकता है क्योंकि सिस्टम शारीरिक गतिविधि को माप सकता है। इसलिए, यदि शारीरिक गतिविधि में परिवर्तन होता है, तो इसका अनुमान लगाया जा सकता है और नियंत्रित किया जा सकता है5। संक्षेप में, जबकि संज्ञाहरण उच्चतम गतिशील सीमा प्रदान कर सकता है, यदि आवश्यक हो तो माप संज्ञाहरण के बिना किया जा सकता है, क्योंकि शारीरिक गतिविधि की निगरानी की जा सकती है।

चयापचय पिंजरों का उपयोग करते समय, चूहों के तनाव के बारे में सावधानी बरती जानी चाहिए, और उचित वसूली आवश्यक है। व्यक्तिगत आवास का सामाजिक अलगाव और चयापचय पिंजरे का नया वातावरण चूहों पर तनाव देता है, जिसके परिणामस्वरूप भोजन का सेवन कम हो जाता है और वजन कम होता है। इस प्रकार, भोजन के सेवन और शरीर के वजन को हर 24 घंटे में निगरानी करने की आवश्यकता होती है। चूहे चयापचय पिंजरे में रखने के बाद सामान्य भोजन का सेवन 48-72 घंटे ठीक करते हैं। नतीजतन, अंशांकन और ऑक्सीजन की खपत माप तब शुरू होती है जब भोजन का सेवन ठीक हो जाता है। चयापचय पिंजरों प्रणाली पर होने के बावजूद, अंशांकन और उपाय इस अनुकूलन अवधि के दौरान नहीं किए जाते हैं, जैसा कि परिभाषा के अनुसार, बीएमआर को तनाव मुक्त माउस में प्राप्त किया जाना चाहिए। इस अवधि के दौरान माप से बचने से डिटेक्टर जीवनकाल बढ़ जाता है और ड्रीयराइट के उपयोग और खपत को कम कर देता है (जो ऑक्सीजन डिटेक्टर क्षति को रोकने के लिए पानी को फंसाता है)। नई और अधिक महंगी प्रणालियों ने घर-पिंजरे-आधारित मापों का उपयोग किया, जो तनाव को कम करता है।

ANCOVA विश्लेषण
शरीर के वजन में अंतर के साथ चूहों के दो समूहों के बीच ऊर्जा व्यय की तुलना करते समय एक ANCOVA (सहप्रसरण का विश्लेषण) की आवश्यकता होती है। कारण यह है कि दुबला द्रव्यमान में वृद्धि ऊर्जा व्यय में वृद्धि होगी। ANCOVA परीक्षण करता है कि क्या ऊर्जा व्यय समूहों के बीच सांख्यिकीय रूप से काफी बदल गया है, जो शरीर के वजन और दुबला द्रव्यमान में अंतर से स्वतंत्र है। ANCOVA यह निर्धारित करके प्राप्त करता है कि क्या ऊर्जा व्यय अलग-अलग था यदि दोनों समूहों के पास एक ही शरीर का वजन या दुबला द्रव्यमान था। हालांकि, ANCOVA का उपयोग करके एक ही शरीर के वजन / दुबला द्रव्यमान पर ऊर्जा व्यय की गणना करने के लिए, कोवरिएट (शरीर का वजन / दुबला द्रव्यमान) और चर (ऊर्जा व्यय) के बीच सहसंबंध समूहों के बीच समान होना चाहिए। इस सहसंबंध की समानता का परीक्षण प्रसरण 5 की समानता के लिए लेवेन के परीक्षण का उपयोग करके किया जाता है।

ANCOVA को अधिक उन्नत सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करने की आवश्यकता होती है, जैसे कि SigmaPlot। वैकल्पिक रूप से, विभिन्न मुफ्त वेबसाइटों का उपयोग किया जा सकता है5। यदि ANCOVA से पता चलता है कि समूहों के बीच मनाया गया प्रभाव कोवरिएट (शरीर के वजन / दुबला द्रव्यमान) के मूल्य पर निर्भर नहीं करता है, तो सॉफ्टवेयर परीक्षण करेगा कि चर (ऊर्जा व्यय, VO2, VCO2) का औसत एक समान कोवरिएट (शरीर के वजन / दुबला द्रव्यमान) पर समूहों के बीच अलग है या नहीं। सॉफ्टवेयर एक सुझाए गए सांख्यिकीय परीक्षण के साथ कई तुलना करने की पेशकश करेगा। यदि सांख्यिकीय महत्व तक पहुंच जाता है, तो यह पुष्टि करेगा कि ऊर्जा व्यय किसी भी दिए गए शरीर के वजन मूल्य पर चूहों के दो समूहों के बीच काफी अलग है। समान ढलान मॉडल के लिए प्रतिगमन समीकरण विश्लेषण से प्राप्त किया जा सकता है, जिसका उपयोग GraphPad या अन्य ग्राफिकल सॉफ़्टवेयर में publication6 के लिए एक ग्राफ उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है।

संशोधन और समस्या निवारण
इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सीएलएएमएस प्रणाली छोटे पिंजरों द्वारा गठित की जाती है जो घर के पिंजरों से बहुत अलग होती हैं जो चूहों का उपयोग किया जाता है, जिसमें बिस्तर शामिल हैं। इसके अलावा, चूहे सामाजिक जानवर हैं, और उन्हें व्यक्तिगत रूप से घर देने की आवश्यकता है, बिस्तर के बिना एक नए पिंजरे के साथ, चूहों के लिए प्रारंभिक तनाव का कारण बनता है। इस प्रकार, चूहों को अपने नए वातावरण के अनुकूल होने और तनाव को कम करने की अनुमति देने के लिए कम से कम 2 दिनों का अनुकूलन आवश्यक है। आमतौर पर, भोजन का सेवन तीसरे दिन अपने घर के पिंजरों में दर्ज किए गए पिंजरों में दर्ज किया गया था। ऊर्जा खर्च करने के लिए बीए क्षमता का आकलन करने के लिए यह अनुकूलन अवधि अनावश्यक है, क्योंकि यह एनेस्थेटिक चूहों में किया जाता है।

Pentobarbital एक लघु-अभिनय barbiturate है जिसे शामक या संवेदनाहारी एजेंट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इसका उपयोग उच्च खुराक पर इच्छामृत्यु के लिए भी किया जाता है। एक अज्ञात कारण के लिए, कभी-कभी यह देखा गया था कि 30 डिग्री सेल्सियस पर पेंटोबार्बिटल की प्रभावकारिता परिवेश के तापमान की तुलना में अलग है। इसलिए, थर्मोन्यूट्रलिटी पर माउस मॉडल में विभिन्न पेंटोबार्बिटल खुराक का परीक्षण करने की सलाह दी जाती है। पेंटोबार्बिटल के मुख्य प्रतिकूल प्रभावों में श्वसन अवसाद और हृदय संबंधी प्रभाव शामिल हैं, जैसे कि रक्तचाप में कमी, स्ट्रोक की मात्रा और हाइपोटेंशन 8।

सीमाओं
बीटा 3-एड्रीनर्जिक रिसेप्टर्स वसा ऊतक में व्यक्त किए जाते हैं और मायोकार्डियम, रेटिना, पित्ताशय की थैली, मस्तिष्क, मूत्राशय और रक्त वाहिकाओं में पता लगाने योग्य होते हैं। इस प्रकार, CL-316,243 संभावित रूप से इन अन्य ऊतकों में ऊर्जा व्यय को बढ़ा सकता है जहां रिसेप्टर व्यक्त किया जाता है। हालांकि, यह प्रदर्शित किया गया था कि नियंत्रण चूहों में CL-316,243 द्वारा प्रेरित अधिकांश ऊर्जा व्यय UCP-1 निर्भर, एक बीए-विशिष्ट प्रोटीन 10,11 है। यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि कुछ आनुवंशिक संशोधन अन्य ऊतकों में सीएल -316,243 के कार्यों को बढ़ा सकते हैं। इसके अलावा, UCP1 स्वतंत्र श्वसन का अंश अभी भी सक्रिय वसा ऊतक में वर्णित एटीपी-खपत व्यर्थ चक्रों द्वारा संचालित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकइस प्रोटोकॉल पेपर के लिए हितों का कोई टकराव घोषित नहीं करते हैं। एम.एल. Enspire Bio LLC के लिए एक सह-संस्थापक और सलाहकार है।

Acknowledgments

एमएल को यूसीएलए में चिकित्सा विभाग द्वारा वित्त पोषित किया जाता है, पी 30 डीके 41301 (यूसीएलए: डीडीआरसी एनआईएच) और पी 30 डीके063491 (यूसीएसडी-यूसीएलए डीईआरसी) से पायलट अनुदान।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CLAMS-Oxymax System Columbus Instruments CLAMS-center feeder-ENC Including enviromental enclosure and Zirconia oxygen sensor
Desktop PC with Oxymax Software HP/Columbus N/A PC needed to be purchased separately
Drierite jug (Calcium Sulfate with Cobalt Chloride Indicator) Fisher Scientific 23-116681 Needed to dry the gas entering the oxygen sensor, humidity can damage the sensor
NMR for body composition Echo-MRI Echo-MRI 100 Measure lean and fat mass in alive mice. It is necessary for ANCOVA analyses.
CL-316-243 Sigma C5976 Injected to the mice subcutaneously to activate thermogenesis
High fat diet Research Diets D12266B Provided to the mice prior and during measurements
Pentobarbital/Nembutal Pharmacy at DLAM N/A Anesthesia for the mice
Primary standard grade gas (tank and regulator) Praxair NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590 20.50% Oxygen, 0.50% CO2 balanced with nitrogen used for calibration

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References

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जीव विज्ञान अंक 177
बेसल ऊर्जा व्यय और मोटापे से ग्रस्त चूहों में ऊर्जा खर्च करने के लिए थर्मोजेनिक एडिपोसाइट्स की क्षमता का निर्धारण
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Shum, M., Zhou, Z., Liesa, M.… More

Shum, M., Zhou, Z., Liesa, M. Determining Basal Energy Expenditure and the Capacity of Thermogenic Adipocytes to Expend Energy in Obese Mice. J. Vis. Exp. (177), e63066, doi:10.3791/63066 (2021).

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