Bestämning av basala energiförbrukning och kapaciteten hos termogena adipocyter att förbruka energi hos feta möss

Summary

Detta manuskript beskriver ett protokoll för att mäta den basala ämnesomsättningen och den oxidativa kapaciteten hos termogena adipocyter hos överviktiga möss.

Abstract

Energiförbrukningsmätningar är nödvändiga för att förstå hur förändringar i ämnesomsättningen kan leda till fetma. Basal energiförbrukning kan bestämmas hos möss genom att mäta hela kroppens syreförbrukning, _{CO2-produktion} och fysisk aktivitet med hjälp av metaboliska burar. Termogena bruna/beige adipocyter (BA) bidrar avsevärt till gnagar energiförbrukning, särskilt vid låga omgivningstemperaturer. Här beskrivs mätningar av basala energiförbrukning och total BA-kapacitet att förbruka energi hos feta möss i två detaljerade protokoll: den första förklarar hur man ställer in analysen för att mäta basala energiförbrukning med hjälp av analys av kovarians (ANCOVA), en nödvändig analys med tanke på att energiförbrukningen varierar med kroppsmassan. Det andra protokollet beskriver hur man mäter BA:s energiförbrukningskapacitet in vivo hos möss. Detta förfarande innebär anestesi, som behövs för att begränsa utgifter orsakade av fysisk aktivitet, följt av injektion av beta3-adrenergat agonist, CL-316,243, som aktiverar energiförbrukningen i BA. Dessa två protokoll och deras begränsningar beskrivs tillräckligt detaljerat för att möjliggöra ett lyckat första experiment.

Introduction

Metabolism kan definieras som integrering av de biokemiska reaktioner som är ansvariga för näringsupptag, lagring, omvandling och nedbrytning som celler använder för att växa och utföra sina funktioner. Metaboliska reaktioner omvandlar energin i näringsämnen till en form som kan användas av celler för att syntetisera nya molekyler och utföra arbete. Dessa biokemiska reaktioner är i sig ineffektiva när det gäller att omvandla denna energi till en användbar form för att upprätthålla ^livet1. Sådan ineffektivitet resulterar i energiavledning i form av värme, där denna värmeproduktion används för att kvantifiera en organisms standardmetabolism (SMR) ^. Standardtillståndet definierades klassiskt som värmeproduktion som förekommer i en vaken men vilande vuxen, inte intag eller smältning av mat, vid termoneutralitet och utan ^stress1. Basala ämnesomsättningen (BMR) eller basala energiförbrukning hos möss kallas SMR men hos individer som intar och smälter mat under mild termisk stress (omgivningstemperaturer 21-22 °C)¹. Utmaningarna och svårigheterna med att direkt mäta värmeproduktionen gjorde att indirekt kalorimetri, nämligen beräkning av värmeproduktion från syreförbrukningsmätningar, blev det mest populära tillvägagångssättet för att bestämma BMR. Beräkning av BMR från syreförbrukning är möjlig eftersom oxidation av näringsämnen av mitokondrier för att syntetisera ATP är ansvarig för 72% av det totala syre som konsumeras i en organism, med 8% av den totala syreförbrukningen som också förekommer i mitokondrier men utan att generera ATP (uncoupled andning)¹. Majoriteten av de återstående 20% av syre som konsumeras kan hänföras till näringsoxidation på andra subcellulära platser (peroxisomal fettsyra oxidation), anabola processer, och reaktiva syre arter ^bildas1. År 1907 etablerade Lusk således en ekvation, baserad på empiriska mätningar, som ofta används för att omvandla syreförbrukning och _{CO2-produktion} till energiavledning som värme. Hos människor står hjärnan för ~ 25% av BMR, muskuloskeletala systemet för ~ 18,4%, levern för ~ 20 %, hjärtat för ~ 10% och fettvävnaden för ~ 3-7%². Hos möss är vävnadsbidraget till BMR något annorlunda, med hjärnan som representerar ~ 6,5%, skelettmuskeln ~ 13%, levern ~ 52%, hjärtat ~ 3,7% och fettvävnad ~ 5%³.

Anmärkningsvärt nog är de biokemiska reaktionerna som definierar BMR inte fasta och förändras som svar på olika behov, såsom externt arbete (fysisk aktivitet), utveckling (vävnadstillväxt), inre påfrestningar (motverka infektioner, skador, vävnadsomsättning) och förändringar i omgivningstemperaturen (kallt försvar)¹. Vissa organismer rekryterar aktivt processer för att generera värme i kall exponering, vilket innebär att värme som produceras av ämnesomsättningen inte bara är en oavsiktlig biprodukt. Istället valde evolutionen regleringsmekanismer som specifikt kunde uppreglera värmeproduktionen genom att ändra hastigheten på metaboliska ^reaktioner1. Således kan samma syreförbrukningsmätningar användas för att bestämma en organisms förmåga att generera värme som svar på kyla.

Två stora processer bidrar till värmegenerering vid kall exponering. Den första är skakningar, vilket genererar värme genom att öka mitokondriell oxidativ fosforylering och glykolys i muskler för att täcka det fysiska arbetet som utförs av ofrivillig muskelkontraktion. Därför kommer kall exponering att öka syreförbrukningen i ^musklerna1. Den andra är Non-Shivering Thermogenesis, som sker genom en ökning av syreförbrukningen i bruna och beige adipocyter (BA). Avledning av energi till värme i BA medieras av mitokondriellt frikopplingsprotein 1 (UCP1), vilket gör det möjligt att komma in i mitokondriell matris igen, vilket minskar mitokondriell protongradient. Avledning av den mitokondriella protongradienten av UCP1 ökar värmeproduktionen genom höjningen av elektronöverföring och syreförbrukning och den energi som frigörs genom protonavledning i sig utan att generera ATP (frikopplad). Dessutom kan termogen BA rekrytera ytterligare mekanismer som höjer syreförbrukningen utan att orsaka en stor upplösning i protongradienten, genom att aktivera fruktil oxidativ ATP-syntes och konsumtionscykler. De metaboliska burar som beskrivs här, nämligen CLAMS-Oxymax-systemet från Columbus Instruments, erbjuder möjligheten att mäta energiförbrukningen vid olika omgivningstemperaturer. Men för att bestämma BA termogen kapacitet med hjälp av mätningar av hela kroppens syreförbrukning måste man: (1) eliminera bidraget från frossa och andra icke-BA-metaboliska processer till energiförbrukning och (2) specifikt aktivera BA termogen aktivitet in vivo. Således beskriver ett andra protokoll hur man selektivt aktiverar BA in vivo med farmakologi hos sövda möss vid termoneutralitet (30 °C), med anestesi och termoneutralitet som begränsar andra icke-BA termogena processer (dvs. fysisk aktivitet). Den farmakologiska strategin för att aktivera BA är att behandla möss med β3-adrenerga receptoragonisten CL-316 246. Anledningen är att kall exponering främjar ett sympatiskt svar som frigör noradrenalin för att aktivera β-adrenergiska receptorer i BA, som aktiverar UCP1 och fettoxidation. Dessutom är β3-adrenerga receptoruttryck mycket berikat i fettvävnad hos möss.

Protocol

Alla experiment godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid University of California, Los Angeles (UCLA). Möss administrerades sin kost och vatten ad libitum i den metaboliska buren, inrymd i en temperaturkontrollerad miljö (~ 21-22 eller 30 °C) med en 12h ljus / mörk cykel. 8 veckor gamla honmöss som utfodrats med en fettrik kost eller chow diet i 8 veckor användes för denna studie.

1. Mätning av basal metabolisk hastighet (BMR)

1. Mät musens totala kroppsvikt med hjälp av en viktskala med noggrannhet i intervallet 0,1 g.
   OBS: Detta måste göras innan mössen inhyssas i metaboliska burar och efter 2-3 dagars acklimatiseringsperiod till de metaboliska burarna.
2. Mät kroppssammansättning, inklusive fett och mager massa hos icke-sövda möss, med hjälp av ett lämpligt kroppssammansättningsanalyssystem (se Materialtabell).
   OBS: Dessa mätningar behövs för att bestämma energiförbrukningen och utförs parallellt med totala kroppsviktsmätningar (steg 1.1).
3. Ställ in de metaboliska burarna och starta acklimatiseringsperioden.
   OBS: Det metaboliska bursystemet innehåller ett hölje som gör det möjligt för användaren att kontrollera husets temperatur och ljus i 12 burar (figur 1A,B). Varje bur har en vattenflaska, en matare och ett galler (bild 1C). Gallret separerar musen från botten av buret, vilket möjliggör avföringssamling. När buret har installerats på varje förutbestämt utrymme innehåller ett lock som förseglar buret vattenflaskans spår, provtagningsluften, luftflödessystemet och den fysiska aktivitetssensorn (figur 1D).
   1. Slå på temperaturhöljet, luftflödessystemet och datorn 2 h innan analysen startas.
   2. Efter 2 h öppnar du programvaran som styr höljet (se Tabell över material) och luftflödet och låter programvaran testa datorns kommunikation med utrustningen.
      OBS: Oxymax programvara användes för det nuvarande arbetet.
   3. När kommunikationen har upprättats klickar du på Arkiv och sedan på Experimentkonfiguration (bild 2A) och väljer den experimentkonfiguration som fördesignats av leverantören (eller konfigurerat från en tidigare analys).
   4. Klicka på Experiment och klicka sedan på Egenskaper, som öppnar fönstret Experimentegenskaper (bild 2B).
   5. I fönstret Egenskaper ställer du in parametrarna för miljöhöljet, inklusive omgivningstemperaturen (21 °C) och 12 h Ljuscyklerna.
      OBS: Genom att hålla programvaran öppen och igång kan luft strömma in i burarna och höljet för att bibehålla de valda temperatur- och ljuscyklerna. Således kan hela systemet fungera med möss inuti burarna i flera dagar, även utan att mäta syre och _CO2.
   6. Klicka på Experiment och klicka sedan på Installationsprogrammet så öppnas fönstret Experimentinställningar , där parametrarna för varje metabolisk bur definieras.
   7. Tilldela varje mus-ID till den enskilda buren där musen är inrymd (bild 2C).
   8. Inkludera mager massa eller total kroppsvikt för varje mus endast om inga skillnader i kroppsvikt observeras mellan grupper.
      OBS: Att få råvärden för syreförbrukning och energiförbrukning underlättar ANCOVA-analyser.
   9. Ställ in luftflödet på den metaboliska buren på 0,5-0,6 L/min.
   10. Markera sökvägen och namnet i fönstret Installationsprogrammet för experiment. Välj säkerhetskopieringskatalogen (bild 2D).
   11. Tillsätt en förviktad mängd mat till matarna som täcker minst matintag i 1 dag.
       OBS: Om burarna har integrerade vågar kan maten läggas till direkt, och programvaran kommer att spela in den.
   12. Tillsätt vattenflaskorna. Kontrollera att flaskan är korrekt förseglad och inte läcker.
   13. 24 h efter tillsats av maten, väg maten som finns kvar på buret.
       OBS: De gram mat som tillsätts minus de gram mat som finns kvar mäter matintaget.
   14. Starta syre-, _CO2- och aktivitetsmätningarna (steg 1.4.10) när födointagsvärdena är desamma som för möss som hålls i vanliga burar.
       OBS: Här är acklimatiseringsperioden (vanligtvis 2-3 dagar) klar och energiförbrukningsmätningar kan starta.
4. Indirekta kalori- och aktivitetsmätningar för att bedöma energiförbrukningen
   1. Mät kroppsvikt, fett och mager massa hos alla möss innan du påbörjar mätningarna.
      OBS: Dessa är de kroppsvikts- och magra massavärden som används för att utföra ANCOVA-analyser.
   2. Kalibrera CLAMS-systemets _O2 - och _CO2 Zirconia-baserade detektor (se Materialtabell) med rekommenderad syrekoncentration. kalibrera alltid om detektorn innan du påbörjar ett nytt experiment.
   3. Använd en kalibreringsgas med känd sammansättning (20,50% syre och 0,50% _CO2).
      OBS: Gasleverantörer hänvisar ofta till denna gas som "Primär standardkvalitet".
   4. Slå på och se till att tankens utgångstryck är på 5-10 psi.
   5. Öppna programvaran för kalibreringsverktyg för kalibrering och testning av gassensorerna (figur 2E). Klicka på Experiment och kalibrera sedan.
   6. Tryck på Start. Vänta sedan tills sensorerna testas och tills programvaran ber användaren att vrida på gassensorns knoppar (bild 2F) tills värdet på _{O2-identiteten} är 1 (figur 2G-H). Klicka på Nästa när steget är klart.
      OBS: Om kalibreringsverktyget utför alla aktuella steg går kalibreringen automatiskt vidare till nästa steg när förloppsindikatorn är fylld.
   7. Kontrollera kalibreringsresultaten när alla steg har slutförts och resultaten presenteras.
   8. Stäng av kalibreringsgasen.
   9. Byt mat och tillsätt tillräckligt med mat under en period på 48-72 timmar.
      OBS: Även om burar kan öppnas under energiförbrukningsmätningarna för att övervaka kroppsvikten och ändra maten dagligen, kan möss stressas av dessa manipuleringar, och mätningar går förlorade när burarna öppnas. Därför rekommenderas att undvika manipulering under mätperioden.
   10. I programvaran klickar du på Experiment och kör sedan för att starta syre-, _CO2 - och aktivitetsmätningarna (figur 3A).
       OBS: Utförandet av mätningarna kan spåras i realtid i en ruta längst ned till vänster i programvaran (röd rektangel, figur 3B). Den röda rektangeln i figur 3B visar att systemet mäter bur #1 med intervall #3, nämligen den tredje mätningen. En mätning i en bur kan ta ca 1 min. Således, med 12 burar anslutna, kan syreförbrukningen mätas ungefär var 12: e minut. Kontinuerliga mätningar på minst 48 timmar rekommenderas.
   11. Stoppa experimentet genom att klicka på Experiment och sedan stoppa (bild 3C).
   12. Öppna burarna, väg mössen och maten. Samla avföring för att beräkna antalet kalorier och lipider som utsöndras under mätperioden 48-72 h.
       OBS: Avföring kan lagras vid -20 °C för senare analyser. Dessa burar kan inte effektivt användas för att samla urin.
   13. Klicka på Experiment och exportera sedan alla ämnen som en CSV-fil (bild 3D).
       OBS: För att underlätta ANCOVA-analyser är det viktigt att exportera råa syreförbrukningsvärden (_VO2) och _{CO2-produktion} (VCO2) utan att normaliseras av kroppsvikten.
5. Dataanalys och kvalitetskontroll
   1. I det exporterade CSV-arket (figur 3D) (från steg 1.4.13) använder du de råvärden för syreförbrukningen (_VO2) och _{CO2-produktionen} (VCO2) mätt var 12:e minut under den 2–3-dagarsperiod som automatiskt anges av programvaran och inkludera en tidsstämpel, nämligen den timme och det datum då de mättes.
      VO2- och _VCO2-värden korrigeras automatiskt om kroppsvikt eller magra massavärden läggs till.
   2. I det exporterade CSV-arket använder du de råvärdena för andningsutbytesförhållandet (RER: _VCO2/_VO2) som automatiskt beräknas och listas av programvaran enligt deras tidsstämpel.
      OBS: Värden nära 1 visar att musen främst oxiderar kolhydrater, medan värden närmare 0,7 representerar att musen huvudsakligen oxiderar fett. RER över 1 kan uppstå under anaerob träning, eftersom kroppen utvisar mer _CO2 för att kompensera för acidosen som orsakas av laktat. RER högre än 1 kan indikera stress. Den exporterade CSV-filen innehåller också de råa värdena från Energiförbrukning (EE) eller Värmeproduktion i kalorier per minut per mus, mätt var 12: e minut under 2-3 dagar. Här innehåller alla listade värden en tidsstämpel.
   3. Eftersom enstaka EE-värden per mus behövs för en ANCOVA, genomsnitt EE-värden som registrerats mellan 09:00-16:00 för ljusfasen (dagen) och 19:00-04:00 för den mörka (natt) fasen per mus och dag.
      Obs: Detta kan göras manuellt med Excel eller Graph Pad. Om du väljer dessa tvågångsfönster undviks medelvärdet av de mellanliggande, gradvisa och instabila EE-värden som är associerade med övergången till den ljus-mörka fasen.
   4. Under en period på 48 timmar beräknar du medelvärdet av de två dagsljusvärdena och de två mörka fasvärdena per mus med Excel eller Graph Pad.
   5. Om du vill kvantifiera den totala fysiska aktiviteten använder du Excel eller Graph Pad för att summera antalet x-, y- och z-strålebrytningar som mäts i de metaboliska burarna och listas i CSV-filen för varje mus.
      Obs: Den totala aktiviteten x,y,z beräknas genom att först göra medelvärdet för varje X, Y, Z per mus och cykel. Sedan bestäms summan av varje genomsnittlig X, Y, Z-värden per mus och cykel för att rita data som i figur 5E (är medelvärdet på 2 dagar).
   6. Alternativt kan du representera de data som visar varje mätvärde över tid, vilket genererar kurvor som illustrerar förändringarna i EE under övergången från ljusa till mörka cykler.
      OBS: Se diskussionsavsnittet om hur och när ANCOVA-analyser ska utföras, och de olika formlerna som används för att beräkna _VO2, _VCO2 och EE finns i kompletterande fil 1.

2. Mätning av termogena adipocyters kapacitet att förbruka energi

1. Ställ in mätningar och musbehandlingar. Se steg 1 för detaljer om de experimentella preparaten för att övervaka syreförbrukningen, eftersom termogen kapacitet i adipocyter bestäms indirekt genom syreförbrukning enligt steg 2.1.1-2.2.2.
   OBS: Detta protokoll kräver musbedövning och akut behandling med beta-3-receptoragonisten CL-316,243 (se Tabell över material), vilket ger en snabb bedömning av BA termogen kapacitet.
   1. Utför kroppssammansättningsanalys och väg mössen. Slå på MUSSLOR, ställ in temperaturen vid 30 °C (termoneutralitet) och vänta i 2 timmar tills hela systemet värms upp.
   2. Ställ in resten av analysvillkoren, inklusive ljus, tilldela mus-ID till varje bur och lägg till kroppsviktsvärdet för varje mus i motsvarande bur om ingen skillnad i kroppsvikt observeras mellan grupperna.
   3. Kalibrera syre-/_{CO2-detektorn} som i steg 1.4.2-1.4.7.
   4. Starta experimentet i programvaran.
   5. Injicera varje mus med pentobarbital (60-120 mg/kg) och placera varje mus i deras tilldelade metaboliska bur (steg 2.1.2).
      OBS: Den dos av pentobarbital som krävs för att hålla möss som sover vid termoneutralitet (30 °C) varierar med musstammen och genotypen. Det rekommenderas att testa olika pentobarbitala doser från 50 till 120 mg/kg och väljer den som håller musen sövd under 2-3 h vid 30 °C. Effektiv anestesi är avgörande för att ta bort den fysiska aktivitetens bidrag till energiförbrukningen.
   6. För att säkerställa anestesi, observera möss efter pentobarbital injektion tills de är helt sovande och deras minskade syreförbrukning blir stadig.
   7. Vänta med att få minst 3 stabila syreförbrukningshastigheter i följd innan du injicerar CL-316,243.
      OBS: I väntan på stabilisering av syreförbrukningen, förbered sprutorna med CL-316,243 för varje mus (1 mg/kg).
   8. Öppna bur #1 och injicera CL-316,243 subkutant omedelbart efter en _VO2 och _VCO2 mätning inträffade i bur #1. Sätt tillbaka musen i bur nr 1 omedelbart efter injektionen.
      OBS: Mätningar indikeras i realtid i den nedre vänstra delen av programvaran (figur 3B, röd rektangel).
   9. Vänta tills bur nr 2 mäts (figur 3B, röd rektangel) och fortsätt sedan som i steg 2.1.8 för bur #2.
      OBS: Att injicera CL-316,243 omedelbart efter en mätning gör det möjligt att upprätthålla tidskonstanten mellan injektionerna. Till exempel, om det finns 12 möss / burar igång, med mätningar som samlas in i enskilda burar sekventiellt och samlingen varar 55 s per bur, bör du injicera en mus varje minut. Med dessa injektionshastigheter kommer den första mätningen att ske efter 12 min efter injektion i alla 12 burar.
   10. Fortsätt energiförbrukningen tills energiförbrukningen är platå för 5-6 på varandra följande mätningar, vanligtvis 90-180 min efter injektion.
       OBS: Möss kan vakna upp från anestesin under experimenten. Dessa möss måste tas bort från analysen. Därför kommer testning av pentobarbitala doser i förväg att öka effektiviteten i studierna.
   11. Stoppa energiförbrukningen, men håll mössen vid sina burar vid 30 °C tills de vaknar.
   12. När mössen är helt vakna, inspektera mössens hälsa och returnera dem till sina ursprungliga burar.
   13. Exportera data för varje mus som en CSV-fil med hjälp av utrustningsprogramvaran enligt beskrivningen i avsnitt 1.4.13.
2. Dataanalys
   DATAANALYSEN utfördes av Excel eller Graphpad
   1. Plotta de 3-5 på varandra följande värdena för _VO2, _VCO2 och EE som är stabila och konstanta över tiden, eftersom dessa är de värden som representerar ämnesomsättningen när möss är helt sövda.
   2. Rita sedan de första och följande på varandra följande _VO2-, _VCO2- och EE-mätningarna som erhållits efter injektionen.
      OBS: De absoluta värdena för EE och vikningsökningen i EE inducerad genom injektion indikerar BA termogen ^funktion7.

Representative Results

Figur 4 visar _VO2, VCO2, Värmeproduktion/Energiförbrukning (EE), Respiratory Exchange Ratio (RER) och X, Y, Z fysiska aktivitetsvärden som erhållits med hjälp av filmssystemets metaboliska burar. VO2 och _VCO2 som tillhandahålls av MUSSEssystemet är volymen gas (ml) per minut och kan redan delas upp av kroppsvikten eller de magra massvärdena genom att ange dessa viktvärden i CLAMS-programvaran innan mätningarna påbörjas. Kroppsviktsvärden får dock inte anges om skillnader i kroppsvikt mellan grupper av möss observeras, eftersom ANCOVA-analys behövs och Oxymax-programvaran inte kan utföra dessa beräkningar. Energiförbrukningen (värmen) beräknas i kcal/h med hjälp av Lusk-ekvationen. Möss är nattliga och spenderar mer energi under natten/ mörkperioden, vilket innebär att energiförbrukningsberäkningar måste separeras enligt ljuscykeln. Som förväntat har möss under den mörka fasen högre _{O2-förbrukning}, _{CO2-produktion} och därmed högre EE, vilket visas i figur 4C. Möss på en vanlig diet och i matat tillstånd, med matintag som förekommer i den mörka cykeln, kännetecknas av RER-värden nära 1 (figur 4D), vilket innebär en preferens att använda kolhydrater. Under ljuscykeln, när möss mestadels sover och därmed snabbt, sker en övergång till fettoxidation, med RER-värden närmare 0,7. Följaktligen ökar fysisk aktivitet, mätt som x,y,z laserstrålebrott, under den mörka fasen och minskar under ljusfasen (figur 4E).

Vi jämförde 16 veckor gamla honmöss som utfodrades med en fettrik diet (8 veckor) med chow-matade möss, vilket gjorde det möjligt att jämföra energiförbrukningen mellan grupper av möss med skillnader i kroppsvikt. Som förväntat ökar fettrik kostmatning fettmassan utan att ändra muskelmassan (figur 5A-C). Fettrika dietmatade möss åt mer Kcal/dag, främst på grund av högre kaloritäthet per gram mat (figur 5D). Dessutom var fysisk aktivitet liknande mellan chow och fettrik dietmatade möss, även under den mörka perioden (figur 5E). De lägre värdena för RER visar att fettrika dietmatade möss föredrar att använda fett som primärt substrat för oxidation, som förväntat med högre fettintag och muskelinsulinresistens (figur 5F). Syreförbrukningen ökar hos fettrika dietmatade möss, men inte _{co2-produktion} (figur 5G-H). Ökningen av syreförbrukningen hos fettrika dietmatade möss åtföljs av en betydande ökning av värmeproduktionen/energiförbrukningen per mus (figur 5I). Att dividera energiförbrukningen med den magra massan hos varje mus ledde dock inte till några skillnader i energiförbrukning (figur 5J), medan uppdelningen av den totala kroppsvikten visade en minskning av energiförbrukningen hos fettrika dietmatade möss (figur 5K). Sammantaget tyder dessa resultat på att uppdelning av energiförbrukningsdata med mager massa eller total kroppsvikt kan leda till motsatta slutsatser om effekterna av fettrik kost som matar på energiförbrukningen. Som föreslås i flera studier gör analysen av kovarians (ANCOVA) det möjligt att avgöra om skillnader i energiförbrukning finns oberoende av förändringarna i kroppsvikt. För att illustrera denna punkt utfördes en ANCOVA-analys med samma data som visas i figur 5A-K, där energiförbrukningen är den beroende variabeln och kroppsvikten eller muskelmassan som kovarianerna. Medan ankova utför med hjälp av total kroppsvikt som kovarians visar endast en trend för fettrika dietmatade möss att ha högre energiförbrukning (figur 5L), visar de fettrika dietmatade mössen en betydande ökning av energiförbrukningen när mager massa används (figur 5M). Dessa uppgifter tyder på att användning av total kroppsvikt för att utföra ANCOVA-analyser skulle kunna underskatta ^{energiförbrukningen4}. Orsakerna kan vara att: (1) fettvävnad endast bidrar till ~ 5% av den totala energiförbrukningen och (2) ökningen av fettmassa inducerad av fettrik kostmatning beror främst på en utvidgning av triglyceridhalten i adipocyter, snarare än från en ökning av antalet oxidativa termogena adipocyter.

Bruna och beige adipocyter (BA) bidrar till termogenes och följaktligen till energiförbrukning hos gnagare. BA:s bidrag till energiförbrukningen in vivo kan inte bara bestämmas genom att mäta hela kroppens syreförbrukning och beräkna BMR, eftersom flera vävnader förbrukar syre. Metoden att bestämma BA termogen kapacitet in vivo innebär anestesi först, vilket behövs för att begränsa syreförbrukningen i alla vävnader. Därefter kombineras anestesi med ett farmakologiskt tillvägagångssätt för att aktivera termogenes, mestadels i termogen BA. Eftersom beta-3 adrenerga receptorer uttrycks främst i fettvävnad, kan beta-3 adrenergic agonist CL-316,243 användas för att aktivera BA termogen funktion. Dessutom kan de sövda mössen placeras i ett temperaturkontrollerat hölje vid 30 °C för att förhindra okontrollerad sympatisk BA-aktivering som orsakas av omgivande termisk stress. Figur 6 visar möss som utfodrats med en fettrik diet som bedövas med pentobarbital och placeras i de metaboliska burarna vid 30 °C, för att registrera energiförbrukning vid den undermåliga ämnesomsättningen (figur 6A-C,D). Denna mätning följdes av CL-316,243 injektion, som ökade syreförbrukning, _CO2 produktion och energiförbrukning, som förväntat från BA aktivering (figur 6A-C). En 2-3-faldig ökning av energiförbrukningen efter beta-3 agonist behandling kan ^upptäckas7.

Figur 1: De metaboliska burarna med miljöhölje och montering av enskilda metaboliska burar. (A) De metaboliska burarna i miljöhöljet. (B) Höljet kan rymma 12 metaboliska burar och gör det möjligt att kontrollera temperatur och ljus. C) Komponenter i de metaboliska burarna före montering. D) Metaboliska burar förseglade med locket. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Bild 2: Experimentell installation och kalibrering av syresensorn. (A) En skärmdump av Oxymax-programvaran som styr de metaboliska burarna, som visar val och öppning av ett "Experimentellt konfigurationsfönster" för att ställa in (B) experimentella egenskaper, nämligen omgivande ljus, och temperatur. Sedan konfigureras experimentet med hjälp av fönstret (C) "Experimentell installation" för att tilldela ett mus-ID, kroppsvikt eller mager massa till varje bur, samt luftflödet för de 12 burarna. (D) I samma "Experimentella installation" -fönster kan en filsparsökväg väljas. (E) För att kalibrera gassensorn måste användaren vrida på ratten på (F) gasdetektorn för att justera (G-H) _{O2-identiteten} till 1. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Bild 3: Start och stopp av mätningarna. (A) Experimentet startas genom att klicka på "Experiment" och sedan "Kör". (B) Användarna kan i realtid se vilken av de 12 burarna som för närvarande mäts (röd rektangel), samt en tabell med de mätningar som redan samlats in. (C) Experimentet kan stoppas genom att klicka på "Experiment" och sedan "Stopp". (D) Data kan exporteras till Excel genom att klicka på "Arkiv", sedan "Exportera" och sedan "Exportera alla ämnen csv". Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 4: Erhöll metaboliska parametrar. A) Syreförbrukning. B_{) Koldioxidproduktion}. C) Energiförbrukningen (EE) normaliserades till mager massa. D) Andningsutbytesförhållande (RER). (E) Fysiska aktivitetsnivåer beräknas som summan av X, Y, Z laserstrålebrott räknas. Data visar medelvärdet ± SEM. Studentens t-test, **P < 0,01, ***P < 0,001. n = 7-8 honmöss per grupp. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 5: ANCOVA-analysen gör det möjligt att på lämpligt sätt tolka förändringar i energiförbrukningen hos feta möss. A) Kroppsvikt. B) Fettmassa. C) Mager massa. D) Intag av livsmedel. Studentens t-test, ***P < 0,001. (E) Fysisk aktivitet bedömdes med de metaboliska burarna som antal laserstrålebrott i X, Y, Z. (F) Andningskoefficientförhållandet (RER). G) Syreförbrukning (_VO2). H) Produktion _av koldioxid (_VCO2). (I) Energiförbrukningen mättes med indirekt kalorimetri. Energiförbrukningen normaliserades till (J) Mager massa och (K) kroppsvikt. *P < 0,05 med Two-ANOVA. **P< 0,01, ***P< 0,001. (L) Kovariansanalys (ANCOVA) av energiförbrukningen (EE) nattetid jämfört med total kroppsvikt eller (M) mager massa. Streckade linjer representerar de genomsnittliga kroppsviktsvärdena som modelleras för att bestämma _VO2 och EE i varje grupp. *P < 0,05 med ANCOVA. n = 7-8 honmöss per grupp. Data visar medelvärde ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6: Den selektiva β3-agonisten CL-316 243 ökar kraftigt energiförbrukningen hos sövda möss vid termoneutralitet. Honmöss bedövades med pentobarbital (60 mg/kg) och placerades i de metaboliska burarna som sattes till 30 °C. Energiförbrukningen under anestesi registrerades tills 3 på varandra följande mätningar visade samma värden, vilket återspeglar fullständig anestesi. Musen från bur #1 injicerades med CL-316,243 (1 mg/kg) omedelbart efter en syreförbrukning mätning. Samma injektionsmetod användes i de andra burarna för att säkerställa att samma tid gick mellan injektion och den första mätningen hos alla möss. A) Syreförbrukning. B_{) Koldioxidproduktion}. C) Energiförbrukning. n = 4 honmöss. Data visar medelvärde ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande fil 1: Formler som används av Oxymax programvara i CLAMS-systemet för att beräkna syreförbrukning, _{CO2-produktion} och energiförbrukning. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Indirekt kalorimetri har använts i åratal för att bedöma hela kroppens ^{energiförbrukning4}. Detta protokoll beskrivs häri ger en enkel metod för att mäta den basala ämnesomsättningen och bestämma BA termogen kapacitet in vivo med hjälp av metaboliska burar.

Den indirekta kalorimetrimetoden som beskrivs här bekräftar att uppdelning av energiförbrukningsvärden efter kroppsviktsvärden kan vara vilseledande. Till exempel kan man dra slutsatsen att energiförbrukningen systematiskt är lägre i alla musmodeller med fetma. Den totala energiförbrukningen kan dock vara högre i vissa musmodeller av fetma, som vid en ökning av matintaget som leder till fetma. Därför kommer uppdelning av energiförbrukningen med fettmassa alltid att orsaka en feltolkning av processen som ansvarar för fetma hos feta möss utan primära defekter i energiförbrukningen. Dessutom är delning med mager massa också olämpligt när förändringar i mager massa uppstår, eftersom mager massa varierar med energiförbrukningen, och energiförbrukningen kan visa en mer betydande minskning än någon förändring i muskelmassa. Detta innebär att uppdelning av energiförbrukningen efter kroppsvikt eller muskelmassa endast kan utföras om inga förändringar i kroppsvikt eller kroppssammansättning (dvs. mager massa och fettmassa) observeras mellan de testade grupperna. Därför är det säkraste tillvägagångssättet att utföra ANCOVA. Detta ämne har diskuterats mycket i utmärkta artiklar, som alla drar slutsatsen att en analys av kovarians (ANCOVA) är avgörande för att jämföra energiförbrukningen mellan grupper av möss med skillnader i total kroppsvikt eller mager ^massa4,5. Här användes SigmaPlot för att utföra ANCOVA-analyser internt, men många andra avancerade statistiska analysprogram kan användas. CalR-webbplatsen tillåter att ladda upp data i en av deras mallar, men det kanske inte alltid är möjligt beroende på den experimentella ^designen5. Att ha statistisk programvara för att utföra ANCOVA "internt" ger mer flexibilitet vid dataanalys och presentation, men det är mer ^{tidskrävande6}.

Thermoneutrality för möss är cirka 30 °C, vilket undertrycker aktiviteten hos termogena bruna och beige adipocyter (BA)¹. Omgivningstemperaturen (21 °C) är lägre än termoneutraliteten, vilket innebär att BA-termogenes kommer att bidra till energiförbrukningen hos möss som är inrymda vid 21 °C. Så skillnaden i energiförbrukning mellan möss vid omgivningstemperatur kontra. möss vid termoneutralitet kan användas för att bestämma BA:s bidrag till energiförbrukningen på ett mindre invasivt sätt. Denna procedur kräver dock kontinuerlig användning av inneslutningen vid 30 °C i 4 veckor, med termoneutralitet som också orsakar skillnader i fysisk aktivitet. Dessutom inducerar termoneutralitet metaboliska förändringar i andra vävnader, inte bara i BA. I ett sammanhang där huvudsyftet är att studera förändringar i BA termogen kapacitet har det farmakologiska tillvägagångssätt som beskrivs här en lista över fördelar jämfört med att hysa möss vid termoneutralitet under en lång period.

Resultaten erhålls på några timmar, och anestesin undertrycker bidraget från fysisk aktivitet och andra beteendeförändringar i energiförbrukningen. Vid bedömning av effekterna av genetiska manipuleringar hos möss kan metabolismen ändras i BA och andra vävnader. Således är CL-316,243 behandling i sövda möss det tillvägagångssätt som kan urskilja förändringar i BA-aktivitet med ett högre dynamiskt omfång och specificitet, med färre confounders från energiförbrukning som härrör från andra vävnader. Alternativt kan CL-316,243 injiceras i medvetna möss eftersom systemet kan mäta fysisk aktivitet. Därför, om en förändring i fysisk aktivitet inträffar, kan den uppskattas och ^{kontrolleras5}. Sammanfattningsvis, medan anestesi kan ge det högsta dynamiska intervallet, kan mätningar göras utan anestesi om det behövs, eftersom fysisk aktivitet kan övervakas.

Vid användning av de metaboliska burarna måste försiktighet iakttas när det gäller mössstress, och korrekt återhämtning är nödvändig. Den sociala isoleringen av enskilda bostäder och den nya miljön i den metaboliska buren stressar mössen, vilket resulterar i minskat matintag och viktminskning. Således måste matintag och kroppsvikt övervakas var 24: e timme. Möss återhämtar normalt matintag 48-72 h efter att ha placerat dem i den metaboliska buren. Som ett resultat startar kalibrerings- och syreförbrukningsmätningar när matintaget återvinns. Trots att det metaboliska bursystemet är på utförs kalibrering och åtgärder inte under denna acklimatiseringsperiod, eftersom BMR per definition måste erhållas i en stressfri mus. Att undvika mätningar under denna period ökar detektorns livslängd och minskar användningen och förbrukningen av drierit (vilket fångar upp vatten för att förhindra skador på syredetektorn). Nyare och dyrare system använde hembursbaserade mätningar, vilket minskar stressen.

ANCOVA analyserar
En ANCOVA (analys av kovarians) behövs vid jämförelse av energiförbrukningen mellan två grupper av möss med skillnader i ^kroppsvikt4. Anledningen är att en ökning av muskelmassa kommer att öka energiförbrukningen. ANCOVA testar om energiförbrukningen statistiskt sett ändras avsevärt mellan grupperna, oberoende av skillnader i kroppsvikt och muskelmassa. ANCOVA uppnår detta genom att avgöra om energiförbrukningen skilde sig åt om båda grupperna hade samma kroppsvikt eller muskelmassa. För att beräkna energiförbrukningen vid samma kroppsvikt/magra massa med ankova måste korrelationen mellan kovariat (kroppsvikt/mager massa) och variabeln (energiförbrukning) vara likartad mellan grupperna. Likheten mellan denna korrelation testas med Levenes test för variansjämlikhet5.

ANCOVA kräver att man använder mer avancerad programvara för statistisk analys, till exempel SigmaPlot. Alternativt kan olika gratiswebbplatser ^användas5. Om ANCOVA visar att den effekt som observerats mellan grupper inte beror på kovariantens värde (kroppsvikt/mager massa), kommer programvaran att testa om medelvärdet av variabeln (energiförbrukning, _VO2, _VCO2) skiljer sig mellan grupperna vid en liknande kovarians (kroppsvikt/mager massa). Programvaran kommer att erbjuda att göra flera jämförelser med ett föreslaget statistiskt test. Om statistisk signifikans uppnås kommer det att bekräfta att energiförbrukningen skiljer sig avsevärt mellan de två grupperna av möss vid ett givet kroppsviktsvärde. Regressionsekvationen för modellen med lika sluttningar kan erhållas från analysen, som kan användas i GraphPad eller annan grafisk programvara för att generera ett diagram för ^publicering6.

Ändringar och felsökning
Musslorsystemet som används i detta protokoll består av små burar som skiljer sig mycket från de hemburar som möss är vana vid, vilket inkluderar sängkläder. Dessutom är möss sociala djur, och behovet av att hysa dem individuellt, tillsammans med en ny bur utan sängkläder, orsakar initial stress för mössen. Således är en acklimatisering på minst 2 dagar nödvändig för att möss ska kunna anpassa sig till sina nya miljöer och minska stress. Vanligtvis kommer matintaget tillbaka till vad som registrerades i deras hemburar den tredje dagen. Denna acklimatiseringsperiod är onödig för att bedöma BA-kapaciteten att förbruka energi, eftersom den utförs i sövda möss.

Pentobarbital är ett kortverkande barbiturarat som kan användas som lugnande medel eller bedövningsmedel, men det används också för dödshjälp vid högre doser. Av okänd anledning märktes det ibland att effekten av pentobarbital vid 30 °C skiljer sig från vid omgivningstemperatur. Därför rekommenderas att testa olika pentobarbitala doser i musmodellen vid termoneutralitet. De viktigaste biverkningarna av pentobarbital inkluderar andningsdepression och kardiovaskulära effekter, såsom sänkt blodtryck, strokevolym och ^hypotoni8.

Begränsningar
Beta3-adrenerga receptorer uttrycks i fettvävnad och kan påvisas i myokardiet, näthinnan, gallblåsan, hjärnan, urinblåsan och ^blodkärlen9. Som sådan, CL-316,243 kan potentiellt öka energiförbrukningen i dessa andra vävnader där receptorn uttrycks. Det visades dock att den största delen av den energiförbrukning som CL-316 243 inducerar i kontrollmöss är UCP-1 beroende, ett BA-specifikt ^protein10,11. Det måste beaktas att vissa genetiska modifieringar kan förvärra cl-316,243 i andra vävnader. Dessutom kan fraktionen av UCP1 oberoende andning fortfarande drivas av ATP-konsumerande meningslösa cykler beskrivs i aktiverad fettvävnad.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CLAMS-Oxymax System	Columbus Instruments	CLAMS-center feeder-ENC	Including enviromental enclosure and Zirconia oxygen sensor
Desktop PC with Oxymax Software	HP/Columbus	N/A	PC needed to be purchased separately
Drierite jug (Calcium Sulfate with Cobalt Chloride Indicator)	Fisher Scientific	23-116681	Needed to dry the gas entering the oxygen sensor, humidity can damage the sensor
NMR for body composition	Echo-MRI	Echo-MRI 100	Measure lean and fat mass in alive mice. It is necessary for ANCOVA analyses.
CL-316-243	Sigma	C5976	Injected to the mice subcutaneously to activate thermogenesis
High fat diet	Research Diets	D12266B	Provided to the mice prior and during measurements
Pentobarbital/Nembutal	Pharmacy at DLAM	N/A	Anesthesia for the mice
Primary standard grade gas (tank and regulator)	Praxair	NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590	20.50% Oxygen, 0.50% CO2 balanced with nitrogen used for calibration