Summary
本工作描述了一种经食管心房爆裂起搏的实验方案，用于有效诱导大鼠心房颤动（AF）。该方案可用于具有健康或重塑心脏的大鼠，允许研究AF病理生理学，鉴定新的治疗靶点以及评估新的治疗策略。
Abstract
动物研究为我们理解心房颤动（AF）病理生理学和治疗管理带来了重要的见解。再入是心房颤动发病机制的主要机制之一，需要一定数量的心肌组织才能发生。由于心房面积小，啮齿动物长期以来一直被认为是对心房颤动的“抗性”。虽然自发性心房颤动已被证明发生在大鼠身上，但这些模型中发生心律失常需要长期随访（长达50周）。本工作描述了一种经食管心房爆裂起搏的实验方案，用于快速有效地诱导大鼠心房颤动。该方案可以成功地用于具有健康或重塑心脏的大鼠，在存在各种危险因素的情况下，允许研究心房颤动病理生理学，鉴定新的治疗靶点，以及评估新的预防和/或治疗策略。
Introduction
心房颤动 （AF） 是临床实践中最常见的持续性心律失常，其发病率和患病率在世界范围内继续急剧增加1.根据最近的研究，这种心律失常影响高达4%的世界人口2。然而，鉴于阵发性心房颤动可能无症状，因此可能无法逃脱检测，心房颤动的真实患病率可能远高于文献中提出的患病率。
心房颤动的病理生理学已被深入研究。然而，这种复杂性心律失常的潜在机制仍然不完全阐明，这反映在有限的治疗方案中，疗效值得怀疑。动物研究为我们理解心房颤动病理生理学和治疗管理带来了重要的见解。再入是AF发病机制3的主要机制之一，需要一定数量的心肌组织才能发生。因此，大型动物在心房颤动研究中通常是首选，而由于其心房面积小，啮齿动物长期以来一直被认为对心房颤动具有“抗性”。然而，大型动物的使用主要受到处理困难的阻碍。同时，尽管自发性心房颤动已被证明发生在大鼠4中，但需要长期随访（长达50周）才能在这些模型中发生心律失常5。还开发了确保小型啮齿动物快速发生心房颤动的模型。大多数情况下，这些模型使用急性电刺激，通常在存在其他有利条件的情况下，例如伴随的副交感神经刺激或窒息，以人为诱导心房颤动6，7。尽管这些模型有效，但无法评估心房颤动相关的关键特征，例如心房的进行性电、结构、自主神经或分子重塑，也无法评估常规或非常规抗心律失常药物对心房底物或室性心律失常风险的影响8，9。
本工作描述了一种长期经食管心房爆裂起搏的实验方案，用于快速有效地诱导大鼠心房颤动。该方案适用于急性和长期研究，并且可以在存在各种危险因素的情况下成功用于具有健康或重塑心脏的大鼠，从而可以研究AF病理生理学，鉴定新的治疗靶点以及评估新的预防和/或治疗策略。
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Protocol
涉及动物受试者的程序由Târgu Mureş的医学，药学，科学和技术大学“George Emil Palade”伦理委员会批准，罗马尼亚国家卫生兽医和食品安全局批准，并符合国际实验动物科学理事会指南（指令2010/63 / EU）。
1. 经食管心房爆裂起搏方案
- 将成年雄性Wistar大鼠（200-400克体重）随机分为两组：STIM和SHAM。
- 麻醉动物。
- 对于诱导，使用2.5%异氟醚，4升/分钟，99.5%O2。
- 对于维持，使用腹膜内给予氯胺酮/美托咪定（75.0 / 0.5mg / kg）的混合物。
- 通过测试角膜反射（5%葡萄糖溶液）和伤害感受性戒断反射（脚趾捏合）来检查麻醉深度。使用直肠温度计监测呼吸频率（麻醉期间下降50%是可以接受的;正常频率在70-120次呼吸/分钟之间）和体温（正常温度在96.5-99.5°F或35.9-37.5°C之间）。
注意：只有在麻醉效果得到确认后，才继续该过程。在整个实验方案中定期监测麻醉深度。需要时重复腹腔内氯胺酮/美托咪定注射。 - 将眼药膏涂抹在双眼，以防止角膜损伤。
- 将动物置于仰卧位，并将其放在加热垫上，以将体温保持在~37°C。
- 将三个表面ECG电极以导联II配置连接到大鼠四肢上（图1A）。
- 将负极放在右前肢上。
- 将正极放在左后肢上。
- 将接地电极放在左前肢上。
- 使用细弹性手镯串线将电极固定到位。
- 打开表面心电图记录并使用商业或本地开发的采集程序10在整个过程中执行连续的心电图记录（图1B）。
- 对于电刺激，使用连接到基于微控制器的心脏起搏器10的5-6 F四极导管。
- 一旦动物被麻醉，将导管通过口腔插入食道。测量上门牙和心脏之间的距离（通过触诊评估），以接近导管插入食道的深度。
注意：注意不要用力插入导管，因为存在食管穿孔的风险。 - 确认刺激导管在心房水平的正确位置，如下所示。
- 以400刺激/分钟的频率施加电刺激（刺激持续时间6 ms）。
- 检查ECG示踪是否显示心房的恒定捕获（即，每个电刺激之后是狭窄的QRS复合物）（图2）。
- 确定舒张阈值，即获得心房捕获所需的最低电压（通常在 10 V 至 20 V 之间）。
注意：对 STIM 组中的动物执行以下操作。 - 确定导管的正确位置后，将刺激器的频率设置为4，000个刺激/分钟（刺激持续时间6 ms），电压高于舒张阈值3 V（图3）。
- 适用于每只动物15个连续的刺激周期，每个20秒，周期11之间的自由间隔为5分钟。根据研究目标，以5天/周的速度，在每天的同一时间为每只大鼠重复方案10天。
- 检查刺激的有效性，如下所示。
- 确定窦房结恢复时间（SNRT），该时间间隔出现在快速起搏结束时，其时间间隔长于窦性心律期间记录的周期长度（图4A），并表示超速抑制结束后恢复窦性心律所需的时间间隔。
注意：过驱抑制表示通过以高于内在节律的速率电刺激心脏来抑制窦房结活动。 - 确定心房颤动发作的发生，此处定义为存在三次或更多次连续的不规则的室上搏动（即，具有狭窄 QRS 波群的不规则心室反应），P 波不存在或被小的、扭曲的“f”波取代（图 4B）。
- 确定窦房结恢复时间（SNRT），该时间间隔出现在快速起搏结束时，其时间间隔长于窦性心律期间记录的周期长度（图4A），并表示超速抑制结束后恢复窦性心律所需的时间间隔。
- 如果心房颤动发作在应执行下一个刺激周期时（即，在周期之间的五个自由分钟结束时）没有自发结束，则不要应用下一个刺激。
- 再等5分钟。如果AF发作在这10分钟后仍然持续，请结束当天的实验方案。
注意：如果需要评估电致心房颤动的严重程度，可以进行更长的心电图监测。
- 再等5分钟。如果AF发作在这10分钟后仍然持续，请结束当天的实验方案。
- 如果在刺激结束时发生严重的心动过缓或心搏停止（即，由于迷走神经的电刺激），则结束方案。如果电活动不能迅速恢复正常，则进行外部心脏按摩并腹腔内给予硫酸阿托品（0.05mg / kg）。
- 在手术结束时，腹膜内给予阿替哌唑（1mg / kg）逆转麻醉。将大鼠单独安置在干净的笼子中，并补充热量，并定期观察，直到它们完全恢复。在协议结束时不需要其他特定的动物护理。
- 分析表面心电图示踪并确定以下内容。
- AF的诱导性以百分比表示（即，[刺激周期数，然后是AF发作/施加的刺激周期总数]x 100）。
- 每个 AF 发作的持续时间。
- 存在“持续性”（即>10 分钟）心房颤动发作。
注意：对 SHAM 组中的动物执行以下操作。
- 对于SHAM组中的大鼠，如上所述遵循步骤1.1至1.7，而不施加任何电刺激。
- 在不施加任何电刺激的情况下将导管保持在适当的位置80分钟（即在STIM大鼠中完成方案所需的时间），同时连续记录表面ECG。
- 在手术结束时，用阿替哌唑（1mg / kg）逆转麻醉。在协议结束时不需要其他特定的动物护理。
- 分析表面心电图示踪并确定步骤1.16中描述的参数。
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Representative Results
在一项概念验证研究中，22只成年雄性Wistar大鼠（200-400克）被随机分为两组：STIM（n = 15）和SHAM（n = 7）。所有动物都被单独安置在聚碳酸酯笼子里，在气候控制的房间（21-22°C）中，在整个研究过程中可以自由获得水和干粮。上述经食管刺激方案适用于所有动物，每周5天，共10天。所有动物都经历了相同的方案，除了SHAM组中的大鼠没有接受主动电刺激。
正如预期的那样，在整个方案中，没有在SHAM动物中诱导AF发作。因此，在该组中无法评估其他参数（即心房颤动发作的持续时间和“持续性”心房颤动发作的存在）。
在刺激的第一天，15只STIM动物中有12只（80%）出现了心房颤动发作（相对风险= 3.33，p <0.001，而SHAM组使用Fisher的精确测试）。在STIM大鼠中，在刺激第一天应用的164个刺激周期中，有42个随后是AF发作（中位诱导率为20%[四分位数范围为6.67-72.22]，而SHAM组为0%）（图5）。
在10天的方案中，在所有动物中有效地诱导了AF（图6）。在整个方案的整个过程中，在STIM动物中平均诱导了15.6±8.7次心房颤动。在所施加的刺激周期总数中，20.05%的人随后是心房颤动，41次（17.30%）的心房颤动发作持续超过600 s。持续少于600秒的心房颤动发作的平均持续时间为40.12秒（表1）。
图1：表面心电图记录。 （A）心电图电极定位-两个在动物的前肢水平，一个在动物的左后肢。（B）应用电刺激前记录的表面心电图示踪。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：确认心房捕获的心电图示踪。 心电图示踪确认导管的正确位置，即在每次电刺激后以400次刺激/分钟的频率观察到狭窄的QRS复合物。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：基于微控制器的心脏起搏器设置。 刺激参数设置为4，000个刺激/分钟的频率（ppm：每分钟脉冲数），刺激持续时间为6 ms（WDTh：宽度），张力为11 V（即，舒张压阈值以上3 V）。 请点击此处查看此图的大图。
图4：ECG示踪证实了刺激方案的有效性。 （A）窦房结恢复时间（SNRT）。请注意，停止刺激（SNRT）的时间间隔长于窦性心律期间记录的周期长度（RR间隔，即两个连续QRS复合物的R波之间的间隔，代表心脏周期的持续时间）。（B）心房电刺激周期完成后出现心房颤动发作。注意不规则的窄QRS波群，没有P波，以及小的，扭曲的“f”波。 请点击此处查看此图的大图。
图5：STIM（n = 15）和SHAM（n = 7）组刺激第一天心房颤动（AF）的诱导性。 数据表示为中位数和四分位距。 请点击此处查看此图的大图。
图6：在STIM大鼠刺激方案的10天内，心房颤动的平均每日诱导性。请点击此处查看此图的放大版本。
| 电致心房颤动发作 （n = 237） | 数字 （%） | 平均持续时间（秒） |
| 持续时间 ≥600 秒 | 41 (17.30%) | - |
| 持续时间 < 600 秒 | 196 (82.70%) | 40.12 |
表1：STIM组电诱发的“持续性”和“非持续性”心房颤动发作的时间参数。
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Discussion
本文描述了一种长期经食管心房爆裂起搏的实验方案，用于快速有效地诱导大鼠心房颤动，适用于急性和长期心房颤动研究。本文描述的10天刺激方案已成功用于开发“继发性自发性心房颤动模型”（即，在通过电刺激诱导AF一段时间后，心房颤动自发发展的模型）10。然而，方案的持续时间可以根据研究的确切目的而有所不同。
其他参数，例如刺激导管的大小，也可以根据动物的大小进行调整。然而，应注意避免使用过大的导管，因为它们可能对气管造成压力并阻碍正常呼吸。对于200-400g大鼠，5-6 F导管对气管造成的压力可以忽略不计，并允许在不需要气管插管的情况下实施该方案。
该方案的一个关键步骤是将刺激导管在食道内的正确定位，位于心房水平（步骤1.7）。此步骤只能在仔细检查麻醉深度后进行，因为缺乏有效的麻醉会增加方案以下步骤中心肺骤停的风险。使用表面心电图监测心脏的电活动通常提供足够的数据来确认导管正确定位在食道内（即，以高于固有心率的频率进行刺激，说明窦房结上的过驱抑制现象，并且每个刺激之后是狭窄的QRS波群）。然而，进行食管心电图记录可用于进一步确认刺激导管的正确位置。
考虑到Wistar大鼠12的正常基线心率，重要的是以高于大鼠自身心率的频率（即>400刺激/分钟）进行初始刺激，以确保持续捕获心房（步骤1.8）。在此步骤中，刺激频率应适应每只动物的基线心率。在存在正确的刺激率的情况下，缺乏恒定的心房捕获可能是由于导管位置不正确或刺激在低于舒张阈值的电压下（步骤1.9）。这两种情况都可能导致低效刺激和协议失败。鉴于体温的变化可促进心律失常13，应注意在整个过程中保持恒定的体温（37°C）。
这里描述的技术也具有许多局限性。鉴于迷走神经在解剖学上与食道的接近，在治疗方案期间可同时发生迷走神经的电刺激，增加心肺骤停的风险。此外，人们应该记住，副交感神经刺激也可能导致该模型中心房颤动的发生，并且其他模型可能更适合旨在评估和/或操纵自主神经系统的研究。
动物模型在解开心房颤动背后的病理生理机制和改善治疗策略方面继续发挥重要作用。理想的动物AF模型应该是快速和易于重建的，可重复的，并且应该尽可能地模仿在人类中观察到的病理学14。在啮齿动物中，大多数心房颤动模型包括急性心房颤动诱导，最常见的是存在其他有利因素，此外还有心房6，15的电刺激。然而，这些模型不能评估进行性心房重塑在心房颤动病理生理学中的作用，不能测试各种抗心律失常药物的长期作用，也不能评估与慢性抗心律失常治疗相关的室性心律失常风险8，9。在其他研究16中，将单一刺激方案应用于长期重塑的，易患AF的心房。虽然该策略克服了其中一些缺点，但它没有考虑心房颤动 本身 对心房性心律失常重塑和未来心房颤动发生的影响8，9。同时，在刺激方案完成后，延长（例如，10天）应用上述经食管心房起搏方案诱导进行性心房前心律失常重塑并创造自发发生心房颤动所需的心房环境10。
因此，本文中描述的实验模型不仅可以有效地用于评估急性心房颤动诱导，而且可以用于创建（继发性）自发性心房颤动的模型。因此，该模型带来了许多主要优势，为更好地了解心房颤动发生和维持所涉及的机制以及识别和测试新的治疗策略创造了前提。
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Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了罗马尼亚教育和研究部CNCS - UEFISCDI的赠款支持，项目编号PN-III-P1-1.1-TE-2019-0370，在PNCDI III内。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antisedan (Atipamezole Hydrochloride) 5mg / mL, solution for injection | Orion Corporation | 06043/4004 | for Rats use 1 mg / kg |
| Dormitor (Medetomidine Hydrochloride) 1 mg / mL, solution for injection | Orion Corporation | 06043/4003 | for Rats use 0.5 mg / kg |
| E-Z Anesthesia Single Animal System | E-Z Systems Inc | EZ-SA800 | Allows the manipulation of one animal at a time |
| Isoflurane 99.9%, 100 mL | Rompharm Company | N01AB06 | |
| Ketamine 10%, 25 mL | for Rats use 75 mg / kg | ||
| Microcontroller-based cardiac pacemaker for small animals | Developed in our laboratory (See Reference number 10 in the manuscript) | ||
| Surface ECG recording system | Developed in our laboratory (See Reference number 10 in the manuscript) |
References
- Kornej, J., Börschel, C. S., Benjamin, E. J., Schnabel, R. B. Epidemiology of atrial fibrillation in the 21st century: Novel methods and new insights. Circulation Research. 127 (1), 4-20 (2020).
- Hindricks, G., et al. 2020 ESC Guidelines for the diagnosis and management of atrial fibrillation developed in collaboration with the European Association for Cardio-Thoracic Surgery (EACTS): The Task Force for the diagnosis and management of atrial fibrillation of the European Society of Cardiology (ESC). European Heart Journal. 42 (5), 373 (2021).
- Veenhuyzen, G. D., Simpson, C. S., Abdollah, H. Atrial fibrillation. Canadian Medical Association Journal. 171 (7), 755-760 (2004).
- Lau, D. H., et al. Atrial arrhythmia in ageing spontaneously hypertensive rats: unraveling the substrate in hypertension and ageing. PloS One. 8 (8), 72416 (2013).
- Scridon, A., et al. Unprovoked atrial tachyarrhythmias in aging spontaneously hypertensive rats: The role of the autonomic nervous system. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 303 (3), 386-392 (2012).
- Haugan, K., Lam, H. R., Knudsen, C. B., Petersen, J. S. Atrial fibrillation in rats induced by rapid transesophageal atrial pacing during brief episodes of asphyxia: a new in vivo model. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 44 (1), 125-135 (2004).
- Sugiyama, A., Takahara, A., Honsho, S., Nakamura, Y., Hashimoto, K. A simple in vivo atrial fibrillation model of rat induced by transesophageal atrial burst pacing. Journal of Pharmacological Sciences. 98 (3), 315-318 (2005).
- Scridon, A. Dissociation between animal and clinical studies. where do we go wrong. Romanian Journal of Cardiology. 31 (3), 497-500 (2021).
- Mulla, W., et al. Rapid atrial pacing promotes atrial fibrillation substrate in unanesthetized instrumented rats. Frontiers in Physiology. 10, 1218 (2019).
- Scridon, A., et al. Spontaneous atrial fibrillation after long-term transesophageal atrial burst pacing in rats. Technical and procedural approach to a new in vivo atrial fibrillation model. Romanian Journal of Laboratory Medicine. 26 (1), 105-112 (2018).
- Halatiu, V. B., et al. Chronic exposure to high doses of bisphenol A exhibits significant atrial proarrhythmic effects in healthy adult rats. Romanian Journal of Cardiology. 31 (3), 587-595 (2021).
- Zaciragić, A., Nakas-ićindić, E., Hadzović, A., Avdagić, N. Average values of electrocardiograph parameters in healthy, adult Wistar rats. Medical Archives. 58 (5), 268-270 (2004).
- Cheshire, W. P. Thermoregulatory disorders and illness related to heat and cold stress. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 196, 91-104 (2016).
- Șerban, R. C., Scridon, A. Data linking diabetes mellitus and atrial fibrillation-how strong is the evidence? From epidemiology and pathophysiology to therapeutic implications. Canadian Journal of Cardiology. 34 (11), 1492-1502 (2018).
- Nishida, K., Michael, G., Dobrev, D., Nattel, S. Animal models for atrial fibrillation: clinical insights and scientific opportunities. Europace. 12 (2), 160-172 (2010).
- Qiu, H., et al. DL-3-n-Butylphthalide reduces atrial fibrillation susceptibility by inhibiting atrial structural remodeling in rats with heart failure. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 391 (3), 323-334 (2018).
