Summary
El presente trabajo describe un protocolo experimental de estimulación de estallido auricular transesofágico para la inducción eficiente de la fibrilación auricular (FA) en ratas. El protocolo se puede utilizar en ratas con corazones sanos o remodelados, lo que permite el estudio de la fisiopatología de la FA, la identificación de nuevas dianas terapéuticas y la evaluación de nuevas estrategias terapéuticas.
Abstract
Los estudios en animales han aportado información importante a nuestra comprensión con respecto a la fisiopatología de la fibrilación auricular (FA) y el manejo terapéutico. La reentrada, uno de los principales mecanismos implicados en la patogénesis de la FA, requiere una cierta masa de tejido miocárdico para que se produzca. Debido al pequeño tamaño de las aurículas, los roedores han sido considerados durante mucho tiempo "resistentes" a la FA. Aunque se ha demostrado que la FA espontánea ocurre en ratas, se requiere un seguimiento a largo plazo (hasta 50 semanas) para que la arritmia ocurra en esos modelos. El presente trabajo describe un protocolo experimental de estimulación de ráfaga auricular transesofágica para la inducción rápida y eficiente de fa en ratas. El protocolo se puede utilizar con éxito en ratas con corazones sanos o remodelados, en presencia de una amplia variedad de factores de riesgo, lo que permite el estudio de la fisiopatología de la FA, la identificación de nuevas dianas terapéuticas y la evaluación de nuevas estrategias profilácticas y / o terapéuticas.
Introduction
La fibrilación auricular (FA) es la arritmia cardíaca sostenida más frecuente encontrada en la práctica clínica y su incidencia y prevalencia continúan aumentando dramáticamente en todo el mundo1. Esta arritmia afecta hasta al 4% de la población mundial según estudios recientes2. Sin embargo, dado que la FA paroxística puede ser asintomática y, por lo tanto, puede escapar a la detección, es probable que la verdadera prevalencia de fa sea mucho mayor que la presentada en la literatura.
La fisiopatología de la FA ha sido intensamente estudiada. Sin embargo, los mecanismos subyacentes de esta arritmia compleja permanecen incompletamente dilucidados y esto se refleja en las limitadas opciones terapéuticas, con una eficacia cuestionable. Los estudios en animales han aportado información importante a nuestra comprensión con respecto a la fisiopatología de la FA y el manejo terapéutico. La reentrada, uno de los principales mecanismos implicados en la patogénesis de la FA3, requiere una cierta masa de tejido miocárdico para que se produzca. Por lo tanto, los animales grandes generalmente han sido preferidos en los estudios de FA, mientras que, debido al pequeño tamaño de sus aurículas, los roedores se han considerado durante mucho tiempo "resistentes" a la FA. Sin embargo, el uso de animales grandes se ve obstaculizado principalmente por dificultades de manejo. Mientras tanto, aunque se ha demostrado que la FA espontánea ocurre en ratas4, se requiere un seguimiento a largo plazo (hasta 50 semanas) para que la arritmia ocurra en esos modelos5. También se han desarrollado modelos que aseguran la rápida aparición de FA en roedores pequeños. La mayoría de las veces, esos modelos utilizan estimulación eléctrica aguda, a menudo en presencia de otras afecciones favorables, como la estimulación parasimpática concomitante o la asfixia, para inducir artificialmente la FA 6,7. Aunque eficientes, estos modelos no permiten la evaluación de características críticas relacionadas con la FA, como la remodelación eléctrica progresiva, estructural, autónoma o molecular de las aurículas, ni los efectos de los fármacos antiarrítmicos convencionales o no convencionales sobre el sustrato auricular o sobre el riesgo de proarritmia ventricular 8,9.
El presente trabajo describe un protocolo experimental de estimulación de estallido auricular transesofágico a largo plazo para la inducción rápida y eficiente de la FA en ratas. El protocolo es adecuado tanto para estudios agudos como a largo plazo y puede usarse con éxito en ratas con corazones sanos o remodelados, en presencia de una amplia variedad de factores de riesgo, lo que permite el estudio de la fisiopatología de la FA, la identificación de nuevas dianas terapéuticas y la evaluación de nuevas estrategias profilácticas y / o terapéuticas.
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Protocol
Los procedimientos que involucran sujetos animales fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Medicina, Farmacia, Ciencia y Tecnología "George Emil Palade" de Târgu Mureș, por la Autoridad Nacional Veterinaria y de Seguridad Alimentaria Sanitaria de Rumania y cumplieron con las directrices del Consejo Internacional para la Ciencia de los Animales de Laboratorio (Directiva 2010/63 / UE).
1. Protocolo de estimulación de ráfaga auricular transesofágica
- Aleatorice ratas Wistar macho adultas (200-400 g de peso corporal) en dos grupos: STIM y SHAM.
- Anestesiar a los animales.
- Para la inducción, use 2.5% de isoflurano, 4 L/min, 99.5% O2.
- Para el mantenimiento, use una mezcla de ketamina/medetomidina (75.0/0.5 mg/kg) administrada por vía intraperitoneal.
- Compruebe la profundidad de la anestesia probando el reflejo corneal (solución de glucosa al 5%) y el reflejo de abstinencia nociceptiva (pellizco del dedo del pie). Controle la frecuencia respiratoria (una caída del 50% es aceptable durante la anestesia; la frecuencia normal está entre 70-120 respiraciones / minuto) y la temperatura corporal utilizando un termómetro rectal (la temperatura normal está entre 96.5 - 99.5 ° F o 35.9 - 37.5 ° C).
NOTA: Continúe el procedimiento solo después de que se confirme la efectividad de la anestesia. Monitoree la profundidad de la anestesia periódicamente durante todo el protocolo. Repita la inyección intraperitoneal de ketamina/medetomidina cuando sea necesario. - Aplique un ungüento oftálmico en ambos ojos para prevenir el daño corneal.
- Coloque al animal en posición supina y colóquelo en una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal a ~ 37 ° C.
- Conecte los tres electrodos de ECG de superficie a las extremidades de la rata en una configuración de plomo II (Figura 1A).
- Coloque el electrodo negativo en la extremidad anterior derecha.
- Coloque el electrodo positivo en la extremidad posterior izquierda.
- Coloque el electrodo de conexión a tierra en la extremidad anterior izquierda.
- Asegure los electrodos en su posición usando delgados cordones de cuerda de pulsera elástica.
- Encienda el registro de ECG de superficie y realice un registro continuo de ECG durante todo el procedimiento (Figura 1B) utilizando un programa de adquisición comercial o desarrollado localmente10.
- Para la estimulación eléctrica, use un catéter cuadripolar de 5-6 F conectado a un marcapasos cardíaco basado en microcontrolador10.
- Una vez que el animal esté anestesiado, inserte el catéter a través de la cavidad oral, en el esófago. Mida la distancia entre los incisivos superiores y el corazón (evaluada por palpación) para aproximarse a la profundidad a la que se debe insertar el catéter en el esófago.
PRECAUCIÓN: Tenga cuidado de no forzar el catéter, ya que existe el riesgo de perforación esofágica. - Confirme la posición correcta del catéter de estimulación a nivel de las aurículas de la siguiente manera.
- Aplicar estimulación eléctrica a una frecuencia de 400 estímulos/minuto (duración del estímulo 6 ms).
- Compruebe si el trazado del ECG muestra una captura constante de las aurículas (es decir, cada estímulo eléctrico es seguido por un complejo QRS estrecho) (Figura 2).
- Determinar el umbral diastólico, es decir, el voltaje más bajo requerido para obtener la captura auricular (generalmente, entre 10 V y 20 V).
NOTA: Realice lo siguiente para los animales del grupo STIM. - Una vez determinada la posición correcta del catéter, ajustar el estimulador a una frecuencia de 4.000 estímulos/minuto (duración del estímulo 6 ms), a una tensión 3 V por encima del umbral diastólico (Figura 3).
- Aplicar a cada animal 15 ciclos sucesivos de estimulación, 20 s cada uno, con un intervalo libre de 5 min entre ciclos11. Dependiendo de los objetivos del estudio, repita el protocolo para cada rata durante 10 días, a razón de 5 días / semana, a la misma hora en cada día.
- Compruebe la eficacia de la estimulación de la siguiente manera.
- Identifique el tiempo de recuperación del nódulo sinusal (SNRT), que aparece al final de la estimulación rápida como un intervalo de tiempo que es más largo que la duración del ciclo registrada durante el ritmo sinusal (Figura 4A) y representa el intervalo de tiempo requerido para la reanudación del ritmo sinusal después de que finaliza la supresión de sobremarcha.
NOTA: La supresión de sobremarcha representa la inhibición de la actividad del nódulo sinusal mediante la estimulación eléctrica del corazón a una velocidad superior al ritmo intrínseco. - Identificar la ocurrencia del episodio de FA, que se define aquí como la presencia de tres o más latidos supraventriculares irregulares consecutivos (es decir, respuesta ventricular irregular con complejos QRS estrechos), con ondas P ausentes o reemplazadas por ondas "f" pequeñas y distorsionadas (Figura 4B).
- Identifique el tiempo de recuperación del nódulo sinusal (SNRT), que aparece al final de la estimulación rápida como un intervalo de tiempo que es más largo que la duración del ciclo registrada durante el ritmo sinusal (Figura 4A) y representa el intervalo de tiempo requerido para la reanudación del ritmo sinusal después de que finaliza la supresión de sobremarcha.
- Si el episodio de FA no termina espontáneamente en el momento en que se debe realizar el siguiente ciclo de estimulación (es decir, al final de los cinco minutos libres entre ciclos), no aplique la siguiente estimulación.
- Espere otros 5 minutos. Si el episodio de FA aún continúa después de esos 10 minutos, finalice el protocolo para ese día.
NOTA: Si se desea evaluar la gravedad de la FA inducida eléctricamente, se puede realizar un monitoreo de ECG más largo.
- Espere otros 5 minutos. Si el episodio de FA aún continúa después de esos 10 minutos, finalice el protocolo para ese día.
- Si se produce bradicardia o asistolia grave al final de la estimulación (es decir, debido a la estimulación eléctrica del nervio vago), finalice el protocolo. Si la actividad eléctrica no vuelve a la normalidad rápidamente, realizar un masaje cardíaco externo y administrar sulfato de atropina (0,05 mg/kg) por vía intraperitoneal.
- Al final del procedimiento, invierta la anestesia con atipamezol (1 mg/kg) administrado por vía intraperitoneal. Alojar a las ratas individualmente en jaulas limpias con calor suplementario y observar periódicamente hasta que se recuperen por completo. No se requiere ningún otro cuidado específico de los animales al final del protocolo.
- Analice los trazados de ECG de superficie y determine lo siguiente.
- La inducibilidad de la FA que se expresa en porcentaje (es decir, [número de ciclos de estimulación seguidos de episodios de FA / número total de ciclos de estimulación aplicados] x 100).
- La duración de cada episodio de AF.
- La presencia de episodios de FA "persistentes" (es decir, >10 min).
NOTA: Realice lo siguiente para los animales del grupo SHAM.
- Para las ratas en el grupo SHAM, siga los pasos 1.1 a 1.7 como se describió anteriormente, sin aplicar ninguna estimulación eléctrica.
- Mantenga el catéter en su posición durante 80 minutos (es decir, el tiempo necesario para completar el protocolo en ratas STIM) sin aplicar ninguna estimulación eléctrica, mientras registra continuamente el ECG de superficie.
- Al final del procedimiento, invierta la anestesia con atipamezol (1 mg/kg). No se requiere ningún otro cuidado específico de los animales al final del protocolo.
- Analice los trazados de ECG de superficie y determine los parámetros descritos en el paso 1.16.
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Representative Results
En un estudio de prueba de concepto, 22 ratas Wistar macho adultas (200-400 g) fueron asignadas al azar en dos grupos: STIM (n = 15) y SHAM (n = 7). Todos los animales fueron alojados individualmente en jaulas de policarbonato, en una habitación climatizada (21-22 °C), teniendo libre acceso a agua y alimentos secos durante todo el estudio. El protocolo de estimulación transesofágica descrito anteriormente se aplicó a todos los animales durante 10 días, 5 días a la semana. Todos los animales se sometieron al mismo protocolo, excepto que las ratas en el grupo SHAM no recibieron estimulación eléctrica activa.
Como era de esperar, no se indujeron episodios de FA en los animales SHAM a lo largo del protocolo. Por lo tanto, no se pudieron evaluar otros parámetros (es decir, la duración de los episodios de FA y la presencia de episodios de FA "persistentes") en este grupo.
En el primer día de estimulación, 12 (80%) de los 15 animales STIM presentaron episodios de FA (Riesgo relativo = 3,33, p < 0,001 vs. el grupo SHAM utilizando la prueba exacta de Fisher). En las ratas STIM, de los 164 ciclos de estimulación aplicados en el primer día de estimulación, 42 fueron seguidos por episodios de FA (inducibilidad mediana del 20% [rango intercuartílico de 6,67-72,22] vs. 0% en el grupo SHAM) (Figura 5).
Durante los 10 días de protocolo, la FA se indujo de manera eficiente en todos los animales (Figura 6). Se indujo un promedio de 15,6 ± 8,7 episodios de FA en los animales STIM durante toda la duración del protocolo. Del total de ciclos de estimulación aplicados, el 20,05% fueron seguidos por FA, y 41 (17,30%) episodios de FA duraron más de 600 s. La duración media de los episodios de FA que duran menos de 600 s es de 40,12 s (Tabla 1).
Figura 1: Registro de ECG de superficie. (A) Posicionamiento de electrodos de ECG: dos a nivel de las extremidades anteriores y uno en la extremidad posterior izquierda del animal. (B) Rastreo de ECG de superficie registrado antes de aplicar estimulación eléctrica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Rastreo de ECG que confirma la captura de las aurículas. El trazado del ECG confirma la posición correcta del catéter, es decir, se observa un complejo QRS estrecho después de cada estímulo eléctrico a una frecuencia de 400 estímulos/minuto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ajustes de marcapasos cardíacos basados en microcontroladores. Los parámetros de estimulación se establecen a una frecuencia de 4.000 estímulos/minuto (ppm: pulsos por minuto), duración del estímulo de 6 ms (WDTh: ancho) y tensión de 11 V (es decir, 3 V por encima del umbral diastólico). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Trazas de ECG que confirman la efectividad del protocolo de estimulación. (A) El tiempo de recuperación del nódulo sinusal (SNRT). Tenga en cuenta que el intervalo de tiempo en el cese de la estimulación (SNRT) es más largo que la duración del ciclo registrada durante el ritmo sinusal (intervalo RR, es decir, el intervalo entre las ondas R de dos complejos QRS consecutivos, que representa la duración de un ciclo cardíaco). (B) La aparición de un episodio de fibrilación auricular después de la finalización del ciclo de estimulación eléctrica auricular. Tenga en cuenta los complejos QRS irregulares y estrechos, la ausencia de ondas P y las ondas "f" pequeñas y distorsionadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Inducibilidad de la fibrilación auricular (FA) en el primer día de estimulación en los grupos STIM (n = 15) y SHAM (n = 7). Los datos se expresan como mediana y rango intercuartílico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Inducibilidad media diaria de la fibrilación auricular durante los 10 días del protocolo de estimulación en las ratas STIM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Episodios de fibrilación auricular inducidos eléctricamente (n = 237) | Número (%) | Duración media (segundos) |
| duración ≥600 segundos | 41 (17.30%) | - |
| duración < 600 segundos | 196 (82.70%) | 40.12 |
Tabla 1: Parámetros temporales de los episodios de fibrilación auricular "persistente" y "no persistente" inducidos eléctricamente en el grupo STIM.
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Discussion
El presente artículo describe un protocolo experimental de estimulación de estallido auricular transesofágico a largo plazo para la inducción rápida y eficiente de la FA en ratas, adecuado para estudios de FA aguda y a largo plazo. El protocolo de estimulación de 10 días descrito en este documento se ha utilizado con éxito para desarrollar un "modelo de FA espontánea secundaria" (es decir, un modelo en el que, después de un período de inducción de FA por estimulación eléctrica, af se desarrolla espontáneamente)10. Sin embargo, la duración del protocolo puede variar dependiendo del propósito exacto del estudio.
Otros parámetros, como el tamaño del catéter de estimulación, también se pueden ajustar, dependiendo del tamaño de los animales. Sin embargo, se debe tener cuidado para evitar el uso de catéteres excesivamente grandes, ya que pueden causar presión sobre la tráquea e impedir la respiración normal. Para ratas de 200-400 g, los catéteres de 5-6 F causan una presión insignificante en la tráquea y permiten que el protocolo se implemente sin la necesidad de intubación endotraqueal.
Un paso clave del protocolo es la correcta colocación del catéter de estimulación dentro del esófago, a nivel de las aurículas (paso 1.7). Este paso solo debe realizarse después de una cuidadosa verificación de la profundidad de la anestesia, ya que la falta de anestesia efectiva aumenta el riesgo de paro cardiorrespiratorio durante los siguientes pasos del protocolo. El monitoreo de la actividad eléctrica del corazón mediante ECG de superficie generalmente proporciona datos suficientes para confirmar que el catéter está colocado correctamente dentro del esófago (es decir, la estimulación a una frecuencia superior a la frecuencia cardíaca intrínseca ilustra el fenómeno de supresión de sobremarcha en el nódulo sinusal y cada estímulo es seguido por un complejo QRS estrecho). Sin embargo, la realización de registros de electrocardiograma esofágico podría utilizarse para confirmar aún más la posición correcta del catéter de estimulación.
Teniendo en cuenta la frecuencia cardíaca basal normal de las ratas Wistar12, es importante realizar la estimulación inicial a una frecuencia superior a la propia frecuencia cardíaca de las ratas (es decir, >400 estímulos/minuto), para garantizar la captura constante de las aurículas (paso 1.8). Durante este paso, la frecuencia de estimulación debe adaptarse a la frecuencia cardíaca basal de cada animal. En presencia de una tasa de estimulación correcta, la falta de captura auricular constante podría deberse a un posicionamiento incorrecto del catéter o a la estimulación a un voltaje por debajo del umbral diastólico (paso 1.9). Ambos escenarios pueden resultar en una estimulación ineficiente y una falla en el protocolo. Dado que las variaciones en la temperatura corporal pueden promover arritmias cardíacas13, se debe prestar atención al mantenimiento de una temperatura corporal constante (37 ° C) durante todo el procedimiento.
La técnica descrita en este documento también tiene una serie de limitaciones. Dada la proximidad anatómica del nervio vago al esófago, la estimulación eléctrica concomitante del nervio vago puede ocurrir durante el protocolo, lo que aumenta el riesgo de paro cardiorrespiratorio. Además, se debe tener en cuenta que es probable que la estimulación parasimpática también contribuya a la aparición de FA en este modelo y que otros modelos pueden ser más adecuados para estudios destinados a evaluar y / o manipular el sistema nervioso autónomo.
Los modelos animales siguen desempeñando un papel importante en el desentrañamiento de los mecanismos fisiopatológicos que subyacen a la FA y en la mejora de las estrategias terapéuticas. Un modelo de FA animal ideal debe ser rápido y fácil de recrear, reproducible y debe imitar tanto como sea posible la patología observada en humanos14. En roedores, la mayoría de los modelos de FA consisten en la inducción aguda de FA, más comúnmente en presencia de otros factores favorecedores, además de la estimulación eléctrica de las aurículas 6,15. Sin embargo, tales modelos no pueden evaluar el papel de la remodelación auricular progresiva en la fisiopatología de la FA, no pueden probar los efectos a largo plazo de varios fármacos antiarrítmicos y no pueden evaluar el riesgo proarrítmico ventricular asociado con el tratamiento antiarrítmico crónico 8,9. En otros estudios16, se aplicó un protocolo de estimulación único a las aurículas crónicamente remodeladas y propensas a la FA. Aunque esta estrategia supera algunas de estas desventajas, no tiene en cuenta el impacto de la FA per se en la remodelación proarrítmica auricular y en la futura aparición de FA 8,9. Mientras tanto, la aplicación prolongada (por ejemplo, 10 días) del protocolo de estimulación auricular transesofágica descrito anteriormente induce la remodelación proarrítmica auricular progresiva y crea el ambiente auricular requerido para la aparición espontánea de FA, después de que se completen los protocolos de estimulación10.
Por lo tanto, el modelo experimental descrito en este documento puede utilizarse de manera eficiente no solo para evaluar la inducción aguda de fa, sino también para crear un modelo de FA espontánea (secundaria). Por lo tanto, este modelo aporta una serie de ventajas importantes, creando las premisas para una mejor comprensión de los mecanismos involucrados en la aparición y el mantenimiento de la FA, así como para identificar y probar nuevas estrategias terapéuticas.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una subvención del Ministerio de Educación e Investigación de Rumania, CNCS - UEFISCDI, número de proyecto PN-III-P1-1.1-TE-2019-0370, dentro de PNCDI III.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antisedan (Atipamezole Hydrochloride) 5mg / mL, solution for injection | Orion Corporation | 06043/4004 | for Rats use 1 mg / kg |
| Dormitor (Medetomidine Hydrochloride) 1 mg / mL, solution for injection | Orion Corporation | 06043/4003 | for Rats use 0.5 mg / kg |
| E-Z Anesthesia Single Animal System | E-Z Systems Inc | EZ-SA800 | Allows the manipulation of one animal at a time |
| Isoflurane 99.9%, 100 mL | Rompharm Company | N01AB06 | |
| Ketamine 10%, 25 mL | for Rats use 75 mg / kg | ||
| Microcontroller-based cardiac pacemaker for small animals | Developed in our laboratory (See Reference number 10 in the manuscript) | ||
| Surface ECG recording system | Developed in our laboratory (See Reference number 10 in the manuscript) |
References
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