Summary
O presente trabalho descreve um protocolo experimental de estouro atrial transesofágico para a indução eficiente da fibrilação atrial (AF) em ratos. O protocolo pode ser utilizado em ratos com corações saudáveis ou remodelados, permitindo o estudo da fisiopatologia af, identificação de novos alvos terapêuticos e avaliação de novas estratégias terapêuticas.
Abstract
Estudos em animais trouxeram importantes insights sobre nossa compreensão sobre fibrilação atrial (AF) fisiologia e manejo terapêutico. A reentrada, um dos principais mecanismos envolvidos na patogênese af, requer uma certa massa de tecido miocárdio para ocorrer. Devido ao pequeno tamanho do atria, os roedores têm sido considerados "resistentes" à AF. Embora a AF espontânea tenha sido demonstrada como ocorrência em ratos, o acompanhamento a longo prazo (até 50 semanas) é necessário para que a arritmia ocorra nesses modelos. O presente trabalho descreve um protocolo experimental de explosão atrial transesofágica para indução rápida e eficiente de AF em ratos. O protocolo pode ser utilizado com sucesso em ratos com corações saudáveis ou remodelados, na presença de uma ampla variedade de fatores de risco, permitindo o estudo da fisiopatologia af, identificação de novos alvos terapêuticos e avaliação de novas estratégias profiláticas e/ou terapêuticas.
Introduction
A fibrilação atrial (AF) é a arritmia cardíaca sustentada mais comum encontrada na prática clínica e sua incidência e prevalência continuam a aumentar dramaticamente em todo o mundo1. Essa arritmia afeta até 4% da população mundial, de acordo com estudos recentes2. No entanto, dado que a AF paroxísmica pode ser assintomática e, portanto, escapar da detecção, a verdadeira prevalência de AF provavelmente será muito maior do que a apresentada na literatura.
A fisiopatologia da AF tem sido intensamente estudada. No entanto, os mecanismos subjacentes dessa arritmia complexa permanecem incompletamente elucidados e isso reflete nas limitadas opções terapêuticas, com eficácia questionável. Estudos em animais trouxeram importantes insights sobre nossa compreensão sobre a fisiopatologia af e o manejo terapêutico. A reentrada, um dos principais mecanismos envolvidos na patogênese3 da AF, requer uma certa massa de tecido miocárdio para ocorrer. Assim, os animais de grande porte têm sido geralmente preferidos em estudos de AF, enquanto que, devido ao pequeno tamanho de sua atria, os roedores têm sido considerados 'resistentes' à AF. No entanto, o uso de animais de grande porte é dificultado principalmente por dificuldades de manuseio. Enquanto isso, embora a AF espontânea tenha sido demonstrada como ocorrer em ratos4, o acompanhamento a longo prazo (até 50 semanas) é necessário para que a arritmia ocorra nesses modelos5. Modelos que garantem a rápida ocorrência de AF em pequenos roedores também foram desenvolvidos. Na maioria das vezes, esses modelos usam estimulação elétrica aguda, muitas vezes na presença de outras condições favoráveis, como estimulação parassimpático concomitante ou asfixia, para induzir artificialmente AF 6,7. Embora eficientes, tais modelos não permitem a avaliação de características críticas relacionadas à AF, como a progressiva remodelagem elétrica, estrutural, autônoma ou molecular do atria, nem os efeitos de drogas antiarrítmicas convencionais ou não convencionais no substrato atrial ou sobre o risco de pro-arritmia ventricular 8,9.
O presente trabalho descreve um protocolo experimental de explosão atrial transesofágica de longo prazo para indução rápida e eficiente de AF em ratos. O protocolo é adequado para estudos agudos e de longo prazo e pode ser utilizado com sucesso em ratos com corações saudáveis ou remodelados, na presença de uma ampla variedade de fatores de risco, permitindo o estudo da fisiopatologia af, identificação de novos alvos terapêuticos e avaliação de novas estratégias profiláticas e/ou terapêuticas.
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Protocol
Os procedimentos envolvendo matérias animais foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Medicina, Farmácia, Ciência e Tecnologia "George Emil Palade" de Târgu Mureş, pela Autoridade Nacional De Veterinária Sanitária e Segurança Alimentar da Romênia e cumpriram as diretrizes do Conselho Internacional de Ciência Animal laboratorial (Diretiva 2010/63/UE).
1. Protocolo de aceleração do estouro atrial transesofágico
- Randomize ratos Wistar masculinos adultos (200-400 g de peso corporal) em dois grupos: STIM e SHAM.
- Anestesiar os animais.
- Para indução, utilize 2,5% de isoflurane, 4 L/min, 99,5% O2.
- Para manutenção, utilize uma mistura de cetamina/medetomidina (75,0/0,5 mg/kg) administrada intraperitoneally.
- Verifique a profundidade da anestesia testando o reflexo da córnea (solução de glicose de 5%) e o reflexo de retirada nociceptiva (beliscão do dedo do dedo do sol). Monitore a taxa respiratória (uma queda de 50% é aceitável durante a anestesia; a taxa normal é entre 70-120 respirações/minutos) e a temperatura corporal usando um termômetro retal (a temperatura normal é entre 96,5 - 99,5 °F ou 35,9 - 37,5 °C).
NOTA: Continue o procedimento somente após a eficácia da anestesia ser confirmada. Monitore a profundidade da anestesia periodicamente durante todo o protocolo. Repita a injeção intraperitoneal de cetamina/medetomidina quando necessário. - Aplique uma pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar danos na córnea.
- Coloque o animal em posição supina e coloque-o em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal a ~37 °C.
- Conecte os três eletrodos ECG de superfície aos membros do rato em uma configuração II de chumbo (Figura 1A).
- Coloque o eletrodo negativo na parte direita.
- Coloque o eletrodo positivo na barra traseira esquerda.
- Coloque o eletrodo de aterramento no membro dianteiro esquerdo.
- Fixar os eletrodos na posição usando cabos de corda elásticos finos.
- Ligue a gravação de ECG superficial e realize a gravação contínua de ECG durante todo o procedimento (Figura 1B) usando um programa de aquisição comercial ou desenvolvido localmente10.
- Para estimulação elétrica, use um cateter quadripolar 5-6 F conectado a um marca-passo cardíaco baseado em microcontrolador10.
- Uma vez que o animal é anestesiado, insira o cateter através da cavidade oral, no esôfago. Meça a distância entre os incisivos superiores e o coração (avaliado pela palpação) para aproximar a profundidade em que o cateter deve ser inserido no esôfago.
ATENÇÃO: Tenha cuidado para não forçar o cateter, pois há risco de perfuração esofágica. - Confirme a posição correta do cateter de estimulação no nível da ária da seguinte forma.
- Aplique estimulação elétrica em uma frequência de 400 estímulos/minutos (duração de estímulo de 6 ms).
- Verifique se o rastreamento do ECG mostra captura constante do atria (ou seja, cada estímulo elétrico é seguido por um complexo QRS estreito) (Figura 2).
- Determine o limiar diastólico — ou seja, a menor tensão necessária para obter captura atrial (geralmente, entre 10 V e 20 V).
NOTA: Realize o seguinte para os animais do grupo STIM. - Uma vez determinada a posição correta do cateter, ajuste o estimulador em uma frequência de 4.000 estímulos/minutos (duração de estímulo de 6 ms), em uma tensão 3 V acima do limiar diastólico (Figura 3).
- Aplique a cada animal 15 ciclos sucessivos de estimulação, 20 s cada, com um intervalo livre de 5 minutos entre os ciclos11. Dependendo dos objetivos do estudo, repita o protocolo para cada rato por 10 dias, a uma taxa de 5 dias/semana, ao mesmo tempo em cada dia.
- Verifique a eficácia da estimulação da seguinte forma.
- Identifique o tempo de recuperação do nódulo sinusino (SNRT), que aparece no final do ritmo rápido como um intervalo de tempo maior do que o comprimento do ciclo registrado durante o ritmo sinusal (Figura 4A) e representa o intervalo de tempo necessário para a retomada do ritmo sinusal após o término da supressão do overdrive.
NOTA: A supressão do overdrive representa a inibição da atividade do nódulo sinusal estimulando eletricamente o coração a uma taxa maior do que o ritmo intrínseco. - Identifique a ocorrência do episódio AF, que aqui é definido como a presença de três ou mais batidas supraventriculares irregulares consecutivas (ou seja, resposta ventricular irregular com complexos QRS estreitos), com ondas P ausentes ou substituídas por pequenas e distorcidas ondas "f" (Figura 4B).
- Identifique o tempo de recuperação do nódulo sinusino (SNRT), que aparece no final do ritmo rápido como um intervalo de tempo maior do que o comprimento do ciclo registrado durante o ritmo sinusal (Figura 4A) e representa o intervalo de tempo necessário para a retomada do ritmo sinusal após o término da supressão do overdrive.
- Se o episódio AF não terminar espontaneamente quando o próximo ciclo de estimulação deve ser realizado (ou seja, até o final dos cinco minutos livres entre os ciclos), não aplique a próxima estimulação.
- Espere mais 5 minutos. Se o episódio af ainda continuar após esses 10 minutos, termine o protocolo para esse dia.
NOTA: Se for desejada avaliação da gravidade da AF induzida eletricamente, um monitoramento mais longo do ECG pode ser realizado.
- Espere mais 5 minutos. Se o episódio af ainda continuar após esses 10 minutos, termine o protocolo para esse dia.
- Se a bradicardia grave ou astole ocorrer no final da estimulação (ou seja, devido à estimulação elétrica do nervo vago), acabe com o protocolo. Se a atividade elétrica não voltar ao normal rapidamente, realize massagem cardíaca externa e administre sulfato de atropina (0,05 mg/kg) intraperitoneally.
- Ao final do procedimento, reverta a anestesia com atipamezole (1 mg/kg) administrada intraperitoneally. Abrigar os ratos individualmente em gaiolas limpas com calor suplementar e observar periodicamente até que estejam totalmente recuperados. Nenhum outro cuidado específico com animais é necessário no final do protocolo.
- Analise os rastreamentos de ECG da superfície e determine o seguinte.
- A induibilidade de AF expressa em percentual (ou seja, [número de ciclos de estimulação seguido por episódios de AF / número total de ciclos de estimulação aplicados] x 100).
- A duração de cada episódio af.
- A presença de episódios 'persistentes' (ou seja, >10 min) AF.
NOTA: Realize o seguinte para os animais do grupo SHAM.
- Para os ratos do grupo SHAM, siga os passos 1.1 a 1.7 como descrito acima, sem aplicar qualquer estimulação elétrica.
- Mantenha o cateter em posição por 80 minutos (ou seja, o tempo necessário para completar o protocolo em ratos STIM) sem aplicar qualquer estimulação elétrica, enquanto registra continuamente o ECG superficial.
- Ao final do procedimento, inverta a anestesia com atipamezole (1 mg/kg). Nenhum outro cuidado específico com animais é necessário no final do protocolo.
- Analise os rastreamentos de ECG de superfície e determine os parâmetros descritos na etapa 1.16.
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Representative Results
Em um estudo de prova de conceito, 22 ratos Wistar masculinos adultos (200-400 g) foram aleatoriamente atribuídos em dois grupos: STIM (n = 15) e SHAM (n = 7). Todos os animais foram alojados individualmente em gaiolas de policarbonato, em uma sala climatizado (21-22 °C), tendo livre acesso à água e alimentos secos durante todo o estudo. O protocolo de estimulação transesofágica descrito acima foi aplicado a todos os animais durante 10 dias, 5 dias por semana. Todos os animais foram submetidos ao mesmo protocolo, exceto que os ratos do grupo SHAM não receberam estimulação elétrica ativa.
Como esperado, nenhum episódio de AF foi induzido nos animais SHAM durante todo o protocolo. Assim, nenhum outro parâmetro (ou seja, a duração dos episódios de AF e a presença de episódios de AF 'persistentes') poderia ser avaliado neste grupo.
No primeiro dia de estimulação, 12 (80%) dos 15 animais STIM apresentaram episódios de AF (Risco Relativo = 3,33, p < 0,001 vs. o grupo SHAM usando o teste exato de Fisher). Nos ratos STIM, dos 164 ciclos de estimulação aplicados no primeiro dia de estimulação, 42 foram seguidos por episódios de AF (induibilidade mediana de 20% [intervalo interquartil de 6,67-72,22] vs. 0% no grupo SHAM) (Figura 5).
Durante os 10 dias de protocolo, a AF foi eficientemente induzida em todos os animais (Figura 6). Uma média de 15,6 ± 8,7 episódios de AF foi induzida nos animais STIM durante toda a duração do protocolo. Do total de ciclos de estimulação aplicados, 20,05% foram seguidos pela AF, e 41 (17,30%) episódios de AF duraram mais de 600 s. A duração média dos episódios de AF com duração inferior a 600 s é de 40,12 s (Tabela 1).
Figura 1: Gravação de ECG de superfície. (A) posicionamento de eletrodos ECG — dois ao nível dos membros dianteiros e um na cetia traseira esquerda do animal. (B) Rastreamento de ECG de superfície registrado antes de aplicar estimulação elétrica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Rastreamento do ECG confirmando a captura da atria. O rastreamento do ECG confirma a posição correta do cateter, ou seja, um complexo QRS estreito é observado após cada estímulo elétrico em uma frequência de 400 estímulos/minutos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Configurações de marca-passo cardíaco à base de microcontrolador. Os parâmetros de estimulação são definidos em uma frequência de 4.000 estímulos/minutos (ppm: pulsos por minuto), duração de estímulo de 6 ms (WDTh: largura) e tensão de 11 V (ou seja, 3 V acima do limiar diastólico). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Rastreamentos de ECG confirmando a eficácia do protocolo de estimulação. (A) O tempo de recuperação do nó sinuso (SNRT). Observe que o intervalo de tempo na cessação da estimulação (SNRT) é maior do que o comprimento do ciclo registrado durante o ritmo sinusal (intervalo RR, ou seja, o intervalo entre as ondas R de dois complexos QRS consecutivos, representando a duração de um ciclo cardíaco). (B) O aparecimento de um episódio de fibrilação atrial após a conclusão do ciclo de estimulação elétrica atrial. Observe os complexos QRS irregulares e estreitos, a ausência de ondas P e as pequenas e distorcidas ondas "f". Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Induibilidade da fibrilação atrial (AF) no primeiro dia de estimulação nos grupos STIM (n = 15) e SHAM (n = 7). Os dados são expressos como intervalo mediano e interquartil. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Indubliquação diária de fibrilação atrial durante os 10 dias do protocolo de estimulação nos ratos STIM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Episódios de fibrilação atrial induzidas eletricamente (n = 237) | Número (%) | Duração média (segundos) |
| duração ≥600 segundos | 41 (17.30%) | - |
| duração < 600 segundos | 196 (82.70%) | 40.12 |
Tabela 1: Parâmetros temporais de episódios de fibrilação atrial 'persistente' e 'não persistente' induzidas por eletricamente no grupo STIM.
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Discussion
O presente artigo descreve um protocolo experimental de longo prazo do ritmo de explosão atrial transesofágica para indução rápida e eficiente de AF em ratos, adequado para estudos de AF agudos e de longo prazo. O protocolo de estimulação de 10 dias descrito aqui foi usado com sucesso para desenvolver um "modelo de AF espontâneo secundário" (ou seja, um modelo no qual, após um período de indução de AF por estimulação elétrica, a AF desenvolve espontaneamente)10. No entanto, a duração do protocolo pode variar dependendo da finalidade exata do estudo.
Outros parâmetros, como o tamanho do cateter de estimulação, também podem ser ajustados, dependendo do tamanho dos animais. No entanto, deve-se tomar cuidado para evitar o uso de cateteres excessivamente grandes, pois podem causar pressão sobre a traqueia e impedir a respiração normal. Para ratos de 200-400 g, cateteres 5-6 F causam pressão insignificante sobre a traqueia e permitem que o protocolo seja implementado sem a necessidade de intubação endotraqueal.
Um passo fundamental do protocolo é o posicionamento correto do cateter de estimulação dentro do esôfago, ao nível da atria (passo 1.7). Esta etapa só deve ser realizada após verificação cuidadosa da profundidade da anestesia, pois a falta de anestesia efetiva aumenta o risco de parada cardiorrespiratória durante as etapas seguintes do protocolo. Monitorar a atividade elétrica do coração usando eCG superficial geralmente fornece dados suficientes para confirmar que o cateter está corretamente posicionado dentro do esôfago (ou seja, estimulação em uma frequência maior do que a frequência cardíaca intrínseca ilustra o fenômeno de supressão de overdrive no nó sinusal e cada estímulo é seguido por um complexo QRS estreito). No entanto, a realização de gravações de eletrocardiograma esofágico poderia ser usada para confirmar ainda mais a posição correta do cateter de estimulação.
Considerando a frequência cardíaca normal dos ratos Wistar12, é importante realizar a estimulação inicial em uma frequência maior que a frequência cardíaca dos ratos (ou seja, >400 estímulos/minuto), para garantir a captura constante da ária (passo 1,8). Durante esta etapa, a frequência de estimulação deve ser adaptada à frequência cardíaca de cada animal. Na presença de uma taxa de estimulação correta, a falta de captura atrial constante pode ser devido ao posicionamento incorreto do cateter ou à estimulação em uma tensão abaixo do limiar diastólico (passo 1.9). Ambos os cenários podem resultar em estimulação ineficiente e falha no protocolo. Dado que as variações na temperatura corporal podem promover arritmias cardíacas13, deve-se prestar atenção à manutenção da temperatura corporal constante (37 °C) durante todo o procedimento.
A técnica aqui descrita também tem uma série de limitações. Dada a proximidade anatômica do nervo vago ao esôfago, a estimulação elétrica concomitante do nervo vago pode ocorrer durante o protocolo, aumentando o risco de parada cardiorrespiratória. Além disso, deve-se ter em mente que a estimulação parassimpática provavelmente também contribuirá para a ocorrência de AF neste modelo e que outros modelos podem ser mais adequados para estudos que visam avaliar e/ou manipular o sistema nervoso autônomo.
Os modelos animais continuam a desempenhar um papel importante na desvendação dos mecanismos fisiodológicos que fundamentam a AF e na melhoria das estratégias terapêuticas. Um modelo af animal ideal deve ser rápido e fácil de recriar, reprodutível, e deve imitar o máximo possível a patologia observada em humanos14. Nos roedores, a maioria dos modelos de AF consiste em indução aguda de AF, mais comumente na presença de outros fatores favoráveis, além da estimulação elétrica da atria 6,15. No entanto, tais modelos não podem avaliar o papel da remodelagem atrial progressiva na fisiopatologia af, não podem testar os efeitos a longo prazo de várias drogas antiarrítmicas, e não podem avaliar o risco proarrítmico ventricular associado ao tratamento antiarrítmico crônico 8,9. Em outros estudos16, um único protocolo de estimulação foi aplicado a atrias cronicamente remodeladas, propensas a AF. Embora essa estratégia supere algumas dessas desvantagens, não leva em conta o impacto da AF per se na remodelação proarrítmica atrial e na futura ocorrência de AF 8,9. Enquanto isso, a aplicação prolongada (por exemplo, 10 dias) do protocolo de ritmo atrial transesofágico descrito acima induz a progressiva remodelação proarrítmica atrial e cria o ambiente atrial necessário para a ocorrência espontânea de AF, após os protocolos de estimulação serem concluídos10.
O modelo experimental descrito aqui pode, portanto, ser usado de forma eficiente não apenas para avaliar a indução aguda de AF, mas também para a criação de um modelo de AF (secundário) espontâneo. Esse modelo traz, portanto, uma série de grandes vantagens, criando as premissas para uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na ocorrência e manutenção da AF, bem como para identificar e testar novas estratégias terapêuticas.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do Ministério da Educação e Pesquisa da Romênia, CNCS - UEFISCDI, número do projeto PN-III-P1-1.1-TE-2019-0370, dentro do PNCDI III.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antisedan (Atipamezole Hydrochloride) 5mg / mL, solution for injection | Orion Corporation | 06043/4004 | for Rats use 1 mg / kg |
| Dormitor (Medetomidine Hydrochloride) 1 mg / mL, solution for injection | Orion Corporation | 06043/4003 | for Rats use 0.5 mg / kg |
| E-Z Anesthesia Single Animal System | E-Z Systems Inc | EZ-SA800 | Allows the manipulation of one animal at a time |
| Isoflurane 99.9%, 100 mL | Rompharm Company | N01AB06 | |
| Ketamine 10%, 25 mL | for Rats use 75 mg / kg | ||
| Microcontroller-based cardiac pacemaker for small animals | Developed in our laboratory (See Reference number 10 in the manuscript) | ||
| Surface ECG recording system | Developed in our laboratory (See Reference number 10 in the manuscript) |
References
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