Summary
本研究は、ラットにおける心房細動(AF)の効率的な誘導のための経食道心房バーストペーシングの実験的プロトコールを記載する。このプロトコルは、健康な心臓または改造された心臓を有するラットにおいて使用することができ、AF病態生理学の研究、新規治療標的の同定、および新しい治療戦略の評価を可能にする。
Abstract
動物実験は、心房細動(AF)の病態生理学と治療管理に関する私たちの理解に重要な洞察をもたらしました。AFの病因に関与する主なメカニズムの1つである再突入は、起こるために一定の質量の心筋組織を必要とする。心房のサイズが小さいため、げっ歯類は長い間AFに対して「耐性」と考えられてきました。自発的なAFはラットで起こることが示されているが、これらのモデルで不整脈が起こるためには長期追跡調査(最大50週間)が必要である。本研究は、ラットにおけるAFの迅速かつ効率的な誘導のための経食道心房バーストペーシングの実験的プロトコールを記載する。このプロトコルは、多種多様な危険因子の存在下で、健康な心臓または改造された心臓を有するラットにおいて首尾よく使用することができ、AF病態生理学の研究、新規治療標的の同定、および新規予防および/または治療戦略の評価を可能にする。
Introduction
心房細動(AF)は、臨床現場で遭遇する最も一般的な持続性心不整脈であり、その発生率および有病率は世界中で劇的に増加し続けています1。この不整脈は、最近の研究によると、世界人口の最大4%に影響を与えます2。しかし、発作性AFが無症候性であり、したがって検出を免れる可能性があることを考えると、AFの真の有病率は、文献に提示されたものよりもはるかに高い可能性が高い。
AFの病態生理学は熱心に研究されている。それにもかかわらず、この複雑な不整脈の根底にあるメカニズムは不完全に解明されたままであり、これは限られた治療選択肢に反映され、疑わしい有効性を有する。動物実験は、AF病態生理学および治療管理に関する我々の理解に重要な洞察をもたらしている。AFの病因3に関与する主なメカニズムの1つである再突入は、起こるために一定の質量の心筋組織を必要とする。したがって、大型動物はAF研究において一般的に好まれてきたが、一方、それらの心房のサイズが小さいため、げっ歯類は長い間AFに対して「耐性」と考えられてきた。しかし、大型動物の使用は、主に取り扱いの困難さによって妨げられています。一方、自発的なAFはラット4で起こることが示されているが、これらのモデル5で不整脈が起こるためには長期追跡調査(最大50週間)が必要である。小型げっ歯類における迅速なAF発生を保証するモデルも開発されている。ほとんどの場合、これらのモデルは、AF 6,7を人工的に誘導するために、しばしば付随する副交感神経刺激または窒息などの他の好ましい条件の存在下で、急性電気刺激を使用する。効率的ではあるが、そのようなモデルは、心房の進行性の電気的、構造的、自律的、または分子的リモデリングなどの重要なAF関連特徴の評価、または心房基質に対する従来型または非従来型の抗不整脈薬の効果、または心室性前性不整脈のリスクに対する評価を可能にしない8,9。
本研究は、ラットにおけるAFの迅速かつ効率的な誘導のための長期経食道心房バーストペーシングの実験的プロトコールを記載する。このプロトコルは、急性および長期研究の両方に適しており、多種多様な危険因子の存在下で、健康な心臓または改造された心臓を有するラットにおいて首尾よく使用することができ、AF病態生理学の研究、新規治療標的の同定、および新規予防および/または治療戦略の評価を可能にする。
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Protocol
動物被験者を含む手順は、Târgu Mureșの医学、薬学、科学技術大学「George Emil Palade」の倫理委員会、ルーマニア国立衛生獣医および食品安全機関によって承認され、国際実験動物科学評議会のガイドライン(指令2010/63/EU)に準拠しました。
1. 経食道心房バーストペーシングプロトコル
- 成体雄Wistarラット(体重200〜400g)をSTIMおよびSHAMの2つのグループにランダム化する。
- 動物を麻酔する。
- 誘導には、2.5%イソフルラン、4L/分、99.5%O2を使用してください。
- 維持のために、腹腔内投与されるケタミン/メデトミジン(75.0/0.5mg / kg)の混合物を使用する。
- 角膜反射(5%グルコース溶液)と侵害受容離脱反射(つま先ピンチ)をテストして麻酔の深さを確認してください。直腸体温計(常温は96.5〜99.5°Fまたは35.9〜37.5°C)を使用して呼吸数(麻酔中は50%の低下が許容され、正常率は70〜120呼吸/分)と体温を監視します。
注:麻酔の有効性が確認された後にのみ、手順を続行してください。プロトコル全体を通して定期的に麻酔の深さを監視します。必要に応じて腹腔内ケタミン/メデトミジン注射を繰り返します。 - 角膜損傷を防ぐために、両目に眼科用軟膏を塗布する。
- 動物を仰臥位に置き、体温を〜37°Cに維持するために加熱パッドの上に置きます。
- 3つの表面ECG電極をリードII構成でラットの四肢に取り付けます(図1A)。
- 負極を右前肢に置きます。
- 正極を左後肢に置きます。
- 接地電極を左前肢に置きます。
- 細い伸縮性のあるブレスレットストリングコードを使用して電極を所定の位置に固定します。
- 表面ECG記録をオンにし、市販または地元で開発された取得プログラム10を使用して、手順全体を通して連続ECG記録を実行する(図1B)。
- 電気刺激のために、マイクロコントローラベースの心臓ペースメーカー10に接続された5〜6F四極カテーテルを使用する。
- 動物が麻酔をかけられたら、カテーテルを口腔を通して食道に挿入します。上部切歯と心臓の間の距離を測定し(触診によって評価)、カテーテルを食道に挿入する深さを近似する。
注意:食道穿孔の恐れがあるため、カテーテルを無理に動かさないように注意してください。 - 以下のようにして心房レベルで刺激カテーテルの正しい位置を確認する。
- 400刺激/分の周波数で電気刺激を加えます(刺激持続時間6ms)。
- ECGトレースが心房の一定の捕捉を示しているかどうかを確認します(つまり、各電気刺激の後に狭いQRS複合体が続きます)(図2)。
- 拡張期スレッショルド、すなわち心房キャプチャを得るために必要な最低電圧(一般に、10V~20V)を決定します。
メモ: STIMグループの動物に対して、次の操作を行います。 - カテーテルの正しい位置が決まったら、拡張期閾値より3V高い電圧で、刺激器を4,000刺激/分(刺激持続時間6ms)の周波数に設定します(図3)。
- 各動物に刺激の15連続したサイクル、それぞれ20秒、サイクル11の間に5分の自由な間隔で適用する。研究の目的に応じて、各ラットのプロトコールを10日間、週5日の割合で、毎日同時に繰り返します。
- 刺激の効果を以下のように確認してください。
- 洞結節回復時間(SNRT)を特定します。この時間は、洞調律中に記録された周期長よりも長い時間間隔として急速ペーシングの最後に現れ(図4A)、オーバードライブ抑制終了後の洞調律の再開に必要な時間間隔を表します。
注:オーバードライブ抑制は、内因性リズムよりも高い速度で心臓を電気的に刺激することによる洞結節活動の阻害を表す。 - AFエピソードの発生を特定する(ここでは、P波が存在しないか、または小さく歪んだ「f」波に置き換えられた、3つ以上の連続した不規則な上室性拍動(すなわち、狭いQRS複合体を有する不規則な心室応答)の存在として定義される(図4B)。
- 洞結節回復時間(SNRT)を特定します。この時間は、洞調律中に記録された周期長よりも長い時間間隔として急速ペーシングの最後に現れ(図4A)、オーバードライブ抑制終了後の洞調律の再開に必要な時間間隔を表します。
- AFエピソードが、次の刺激サイクルが実行されるべき時間(すなわち、サイクル間の5つの自由な分の終わりまでに)に自発的に終了しない場合、次の刺激を適用しないでください。
- さらに5分間待ちます。AFエピソードが10分後もまだ続く場合は、その日のプロトコルを終了します。
注:電気的に誘発されるAFの重症度の評価が必要な場合は、より長いECGモニタリングを行うことができる。
- さらに5分間待ちます。AFエピソードが10分後もまだ続く場合は、その日のプロトコルを終了します。
- 重度の徐脈または収縮不全が刺激の終了時に(すなわち、迷走神経の電気刺激のために)起こる場合、プロトコルを終了する。電気的活動が急速に正常に戻りない場合は、外部心臓マッサージを行い、硫酸アトロピン(0.05mg / kg)を腹腔内に投与する。
- 処置の終わりに、腹腔内投与されたアチパメゾール(1mg / kg)で麻酔を逆転させる。ラットを補助的な熱で清潔なケージに個々に収容し、完全に回復するまで定期的に観察する。議定書の最後には、他の特定の動物の世話は必要ありません。
- 表面ECGトレースを分析し、以下を決定します。
- パーセンテージで表されたAFの誘導性(すなわち、[AFエピソードに続く刺激サイクル数/適用された刺激サイクルの総数]×100)。
- 各 AF エピソードの継続時間。
- 「持続的」(すなわち、>10分)AFエピソードの存在。
メモ: SHAMグループの動物に対して、次の操作を行います。
- SHAM群のラットについては、電気刺激を施さずに、上記の手順1.1~1.7に従ってください。
- 表面ECGを連続的に記録しながら、電気刺激を加えることなくカテーテルを80分間所定の位置に維持する(すなわち、STIMラットにおけるプロトコールを完了するのに必要な時間)。
- 処置の終わりに、アチパメゾール(1mg / kg)で麻酔を逆転させる。議定書の最後には、他の特定の動物の世話は必要ありません。
- 表面ECGトレースを分析し、ステップ1.16で説明したパラメータを決定します。
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Representative Results
概念実証研究では、22匹の成体雄Wistarラット(200〜400g)を、STIM(n = 15)およびSHAM(n = 7)の2つのグループにランダムに割り付けた。すべての動物をポリカーボネートケージ、気候制御された部屋(21〜22°C)に個々に飼育し、研究を通して水およびドライフードに自由にアクセスできるようにした。上述の経食道刺激プロトコールを、10日間、週5日間、全ての動物に適用した。すべての動物は、SHAM群のラットが活発な電気刺激を受けなかったことを除いて、同じプロトコールを受けた。
予想通り、AFのエピソードは、プロトコル全体を通してSHAM動物において誘発されなかった。したがって、このグループでは、他のパラメータ(すなわち、AFエピソードの持続時間および「持続的」AFエピソードの存在)を評価することができなかった。
刺激の初日に、15匹のSTIM動物のうち12匹(80%)がAFエピソードを提示した(フィッシャーの正確検定を用いたSHAM群に対して相対リスク= 3.33、p<0.001)。STIMラットでは、刺激初日に適用された164回の刺激サイクルのうち、42回がAFエピソード(誘導率中央値は20%[四分位範囲6.67-72.22]対SHAM群では0%)であった(図5)。
10日間のプロトコールの間、AFは全ての動物において効率的に誘導された(図6)。プロトコールの全期間にわたって、平均15.6±8.7エピソードのAFがSTIM動物において誘導された。適用された刺激サイクルの総数のうち、20.05%がAFであり、AFの41(17.30%)エピソードが600秒以上続いた。600秒未満持続するAFエピソードの平均持続時間は40.12秒である(表1)。
図1:表面ECG記録。 (A)ECG電極の位置決め - 動物の前肢のレベルで2つ、左後肢に1つ。(B)電気刺激を加える前に記録された表面ECGトレース。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:心房の捕捉を確認するECGトレース。 ECGトレースは、カテーテルの正しい位置を確認する、すなわち、400刺激/分の周波数で各電気刺激の後に狭いQRS複合体が観察される。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:マイクロコントローラベースの心臓ペースメーカーの設定 刺激パラメータは、周波数4,000刺激/分(ppm:1分あたりのパルス数)、刺激持続時間6ms(WDTh:幅)、張力11V(すなわち、拡張期閾値より3V高い)に設定される。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:刺激プロトコルの有効性を確認するECGトレース。刺激の停止時の時間間隔(SNRT)は、洞調律中に記録されたサイクル長よりも長いことに留意されたい(RR間隔、すなわち、2つの連続したQRS複合体のR波間の間隔は、心周期の持続時間を表す)。(b)心房電気刺激サイクルの完了後の心房細動エピソードの出現。不規則で狭いQRS錯体、P波の不在、および小さく歪んだ「f」波に注意してください。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:STIM(n=15)およびSHAM(n=7)群における刺激の初日における心房細動(AF)の誘導性。 データは中央値と四分位範囲として表されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:STIMラットにおける刺激プロトコルの10日間における心房細動の1日平均誘導率。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 電気的に誘発された心房細動エピソード(n = 237) | 数値(%) | 平均継続時間 (秒) |
| 期間 ≥600 秒 | 41 (17.30%) | - |
| 期間< 600 秒 | 196 (82.70%) | 40.12 |
表1:STIM群における電気的に誘発された「持続性」および「非持続性」心房細動エピソードの時間的パラメータ。
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Discussion
本論文は、ラットにおけるAFの迅速かつ効率的な誘導のための長期経食道心房バーストペーシングの実験プロトコールを記載しており、急性および長期AF研究の両方に適した。本明細書に記載される10日間の刺激プロトコルは、「二次自発的AFモデル」(すなわち、電気刺激によるAF誘導の期間に続いて、AFが自発的に発達するモデル)を開発するために首尾よく使用されている10。しかしながら、プロトコールの期間は、研究の正確な目的に応じて変化し得る。
刺激カテーテルのサイズなどの他のパラメータも、動物のサイズに応じて調整することができる。しかし、過度に大きなカテーテルは気管に圧力をかけ、正常な呼吸を妨げる可能性があるため、使用を避けるように注意する必要があります。200〜400gラットの場合、5〜6Fカテーテルは気管に無視できる程度の圧力を与え、気管内挿管を必要とせずにプロトコルを実施することを可能にする。
プロトコルの重要なステップは、食道内の刺激カテーテルを心房のレベルで正しく配置することです(ステップ1.7)。このステップは、効果的な麻酔の欠如がプロトコルの次のステップ中に心肺停止のリスクを増加させるので、麻酔の深さを注意深くチェックした後にのみ行うべきである。表面ECGを用いて心臓の電気的活動を監視することは、一般に、カテーテルが食道の内側に正しく配置されていることを確認するのに十分なデータを提供する(すなわち、内因性心拍数よりも高い周波数での刺激は、洞結節上のオーバードライブ抑制現象を示し、各刺激の後に狭いQRS複合体が続く)。しかし、食道心電図記録を行うことは、刺激カテーテルの正しい位置をさらに確認するために使用することができる。
Wistarラット12の正常なベースライン心拍数を考慮すると、心房の一定の捕捉を確実にするために、ラット自身の心拍数よりも高い周波数(すなわち、>400刺激/分)で初期刺激を行うことが重要である(ステップ1.8)。このステップの間、刺激頻度は各動物のベースライン心拍数に適合させる必要があります。正しい刺激速度の存在下では、一定の心房捕捉の欠如は、カテーテルの誤った位置決めまたは拡張期閾値未満の電圧での刺激のいずれかに起因する可能性がある(ステップ1.9)。どちらのシナリオも、非効率的な刺激とプロトコルの障害につながる可能性があります。体温の変動が心臓不整脈13を促進する可能性があることを考えると、処置全体を通して一定の体温(37°C)を維持することに注意を向けるべきである。
本明細書に記載される技術はまた、多くの制限を有する。迷走神経の解剖学的近接性を考えると、迷走神経の付随する電気刺激はプロトコル中に起こり得、心肺停止のリスクを高める。さらに、副交感神経刺激は、このモデルにおけるAFの発生にも寄与する可能性があり、自律神経系の評価および/または操作を目的とした研究には、他のモデルがより適切である可能性があることに留意すべきである。
動物モデルは、AFの根底にある病態生理学的メカニズムを解明し、治療戦略を改善する上で重要な役割を果たし続けている。理想的な動物AFモデルは、迅速かつ容易に再現でき、再現可能でなければならず、ヒトで観察された病理を可能な限り模倣すべきである14。げっ歯類では、ほとんどのAFモデルは、心房の電気刺激に加えて、他の好ましい因子の存在下で最も一般的には急性AF誘導からなる6,15。しかし、そのようなモデルは、AF病態生理学における進行性心房リモデリングの役割を評価することができず、様々な抗不整脈薬の長期的効果を試験することができず、慢性抗不整脈治療に関連する心室性不整脈前リスクを評価することができない8,9。他の研究16では、慢性的に改造されたAFを起こしやすい心房に単一の刺激プロトコルが適用された。この戦略はこれらの欠点のいくつかを克服するが、心房前不整脈リモデリングおよび将来のAF発生に対するAF自体の影響を考慮に入れていない8,9。一方、上述の経食道心房ペーシングプロトコルの長期(例えば、10日間)適用は、刺激プロトコールが完了した後、進行性の心房前不整脈リモデリングを誘導し、AFの自発的発生に必要な心房環境を作り出す10。
したがって、本明細書に記載される実験モデルは、急性AF誘導を評価するためだけでなく、(二次的な)自発的AFのモデルを作成するためにも効率的に使用することができる。したがって、このモデルは、AFの発生および維持に関与するメカニズムのより良い理解、ならびに新しい治療戦略の同定および試験のための前提を作り出す、多くの主要な利点をもたらす。
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Disclosures
著者には利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、PNCDI III内のルーマニア教育研究省、CNCS - UEFISCDI、プロジェクト番号PN-III-P1-1.1-TE-2019-0370の助成金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antisedan (Atipamezole Hydrochloride) 5mg / mL, solution for injection | Orion Corporation | 06043/4004 | for Rats use 1 mg / kg |
| Dormitor (Medetomidine Hydrochloride) 1 mg / mL, solution for injection | Orion Corporation | 06043/4003 | for Rats use 0.5 mg / kg |
| E-Z Anesthesia Single Animal System | E-Z Systems Inc | EZ-SA800 | Allows the manipulation of one animal at a time |
| Isoflurane 99.9%, 100 mL | Rompharm Company | N01AB06 | |
| Ketamine 10%, 25 mL | for Rats use 75 mg / kg | ||
| Microcontroller-based cardiac pacemaker for small animals | Developed in our laboratory (See Reference number 10 in the manuscript) | ||
| Surface ECG recording system | Developed in our laboratory (See Reference number 10 in the manuscript) |
References
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