Summary
لا يزال الكشف السريع والقياس الكمي الموثوق به لأحداث تحرير الحمض النووي الريبي على نطاق الجينوم أمرا صعبا ويعتمدان حاليا على طرق تسلسل الحمض النووي الريبي المباشرة. يستخدم البروتوكول الموصوف هنا الرحلان الكهربائي الهلامي المتدرج في درجة الحرارة الدقيقة (μTGGE) كطريقة بسيطة وسريعة ومحمولة للكشف عن تحرير الحمض النووي الريبي.
Abstract
تحرير الحمض النووي الريبي هو عملية تؤدي إلى تغييرات تسلسل ما بعد النسخ في الحمض النووي الريبي. يعتمد الكشف عن تحرير الحمض النووي الريبي وتحديده كميا بشكل أساسي على تقنيات تسلسل Sanger وتسلسل الحمض النووي الريبي. ومع ذلك ، يمكن أن تكون هذه الطرق مكلفة وتستغرق وقتا طويلا. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام نظام الرحلان الكهربائي الهلامي المتدرج في درجة الحرارة الدقيقة المحمول (μTGGE) كنهج غير تسلسلي للكشف السريع عن تحرير الحمض النووي الريبي. وتستند العملية إلى مبدأ الرحلان الكهربائي، الذي يستخدم درجات حرارة عالية لتشويه عينات الأحماض النووية أثناء تحركها عبر هلام بولي أكريلاميد. عبر مجموعة من درجات الحرارة ، تشكل شظية الحمض النووي تدرجا من الحمض النووي المزدوج بالكامل إلى خيوط منفصلة جزئيا ثم إلى حمض نووي منفصل تماما. تنتج المواقع التي تم تحريرها بواسطة الحمض النووي الريبي مع قواعد النيوكليوتيدات المتميزة ملفات تعريف ذوبان مختلفة في تحليلات μTGGE. استخدمنا النهج القائم على μTGGE لتوصيف الاختلافات بين ملفات تعريف الذوبان لأربعة أجزاء من الحمض النووي الريبي المحررة والأجزاء المقابلة غير المحررة (من النوع البري). تم حساب درجات تشابه النمط (PaSSs) من خلال مقارنة أنماط النطاق التي تنتجها الحمض النووي الريبي المحرر وغير المحرر وتم استخدامها لتقييم قابلية تكرار الطريقة. بشكل عام ، تتيح المنصة الموضحة هنا اكتشاف طفرات قاعدة واحدة في الحمض النووي الريبي بطريقة مباشرة وبسيطة وفعالة من حيث التكلفة. ومن المتوقع أن تساعد أداة التحليل هذه في التوصل إلى نتائج جديدة في البيولوجيا الجزيئية.
Introduction
يمكن أن تشير متغيرات النوكليوتيدات المفردة (SNVs) في الحمض النووي الريبي الجينومي ، بما في ذلك متغيرات A-to-I و C-to-U و U-to-C ، إلى أحداث تحرير الحمض النووي الريبي. ومع ذلك ، فإن اكتشاف SNVs في الحمض النووي الريبي لا يزال مهمة صعبة تقنيا. تقليديا ، يتم تحديد نسبة الحمض النووي الريبي المحرر إلى الحمض النووي الريبي غير المعدل عن طريق التسلسل المباشر ، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي (PCR) الخاص بالأليل ،أو تغيير طبيعة الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) إلى 1،2،3،4،5،6. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب ليست فعالة من حيث الوقت أو التكلفة بشكل خاص ، ودقتها المنخفضة ، الناجمة عن ارتفاع مستويات الضوضاء ، تشكل اختناقات تكنولوجية للكشف عن SNV القائم على الحمض النووي الريبي 7,8. هنا ، نصف بروتوكولا يعتمد على الرحلان الكهربائي الهلامي المتدرج في درجة الحرارة (TGGE) لتحديد تعدد أشكال النيوكليوتيدات المفردة (SNPs) كطريقة بديلة تلغي الحاجة إلى نهج تسلسل الحمض النووي الريبي المباشرة لتحليلات تحرير الحمض النووي الريبي.
الرحلان الكهربائي هو الطريقة المفضلة لفصل وتحليل الجزيئات الحيوية في مختبرات علوم الحياة. يتيح TGGE فصل شظايا الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل والتي هي بنفس الحجم ولكن لها تسلسلات مختلفة. تعتمد هذه التقنية على الاختلافات المرتبطة بالتسلسل في درجات حرارة انصهار شظايا الحمض النووي والتغيرات اللاحقة في تحركاتها في المواد الهلامية المسامية مع تدرج درجة حرارة خطي 9,10. ذوبان شظايا الحمض النووي يولد ملامح ذوبان محددة. بمجرد أن يصل المجال ذو أدنى درجة حرارة انصهار إلى درجة الحرارة المقابلة في موضع معين في الجل ، يحدث الانتقال من بنية حلزونية إلى بنية مذابة جزئيا ، وسيتوقف ترحيل الجزيء عمليا. لذلك ، يستخدم TGGE كلا من التنقل (معلومات الحجم) والتحولات الهيكلية الناجمة عن درجة الحرارة لشظايا الحمض النووي (المعلومات المعتمدة على التسلسل) ، مما يجعلها نهجا قويا لتوصيف شظايا الحمض النووي. نقاط السمة في نمط انصهار TGGE ، والتي تتوافق مع ثلاثة تحولات هيكلية لجزيء الحمض النووي ، هي نقطة التفكك الأولي للحبلا ، ونقطة التفكك منتصف الخيط ، ونقطة التفكك النهائية للحبلا (الشكل 1). تؤثر اختلافات التسلسل داخل المجالات ، حتى الاختلافات أحادية القاعدة ، على درجة حرارة الانصهار ، وبالتالي ، فإن الجزيئات ذات التسلسلات المختلفة ستظهر أنماط ذوبان منفصلة (تمسخ) في تحليلات TGGE. لذلك ، يمكن استخدام TGGE لتحليل SNVs في الحمض النووي الريبي الجينومي ويمكن أن يكون طريقة عالية الإنتاجية لا تقدر بثمن للكشف عن تحرير الحمض النووي الريبي. يتم فقدان هذا الكسب عالي الإنتاجية عند استخدام TGGE التقليدي القائم على الرحلان الكهربائي الهلامي. ومع ذلك ، يمكن استخدام نسخة مصغرة من TGGE ، تسمى microTGGE (μTGGE) ، لتقصير الوقت الكهربائي الهلامي وتسريع التحليل مع زيادة 100 ضعف في الإنتاجية11. تم تحسين بساطة واكتناز طريقة μTGGE من خلال إدخال PalmPAGE12 ، وهو نظام هرهلام كهربائي قابل للتطبيق في الميدان ومحمولة باليد وبأسعار معقولة.
هنا ، يتم استخدام بروتوكول جديد قائم على TGGE لفحص ثلاثة أنواع من مواقع تحرير الحمض النووي الريبي (A-to-I و C-to-U و U-to-C) في أربعة جينات ، بما في ذلك اثنان من أنسجة Arabidopsis thaliana واثنان معبرا عنهما في خلايا HEK293 الثديية (الشكل 1A). يدمج البروتوكول استخدام PalmPAGE (الأجهزة) ، وهو نظام محمول للكشف السريع عن تحرير الحمض النووي الريبي ، و uMelt (برنامج)13. مع متوسط وقت تشغيل يتراوح بين 15 و 30 دقيقة ، يتيح هذا البروتوكول التعرف السريع والموثوق والسهل على تحرير الحمض النووي الريبي دون الحاجة إلى نهج تسلسل الحمض النووي الريبي المباشر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تحسين الجزء المستهدف
ملاحظة: تم استخدام أربعة جينات معدلة في تطوير هذا البروتوكول ، بما في ذلك جينان نوويان (AT2G16586 و AT5G02670) من A. thaliana ، والجينات المشفرة بروتين الفلورسنت الأزرق (BFP) وبروتين الفلورسنت الأخضر المحسن (EGFP) المعبر عنه في خلايا HEK293.
- لتحديد شظايا الجينات ذات ملفات تعريف الذوبان المختلفة ، التي تمثل المناطق المحررة مقابل المناطق غير المحررة ، قم بإنشاء منحنيات ذوبان متوقعة باستخدام الأداة المستندة إلى الويب uMelt HETS ، وهي امتداد لبرنامج uMelt الأصلي13.
ملاحظة: تتنبأ هذه الأداة بأشكال منحنيات الانصهار لمنتجات التباين والتجانس المتجانسة. - لكل جين مستهدف ، صمم ثلاثة أزواج من شظايا الجينات (300-324 نقطة أساس في الطول). يتكون كل زوج من جزء مع موقع تم تحريره وجزء من النوع البري المقابل مع موقع غير محرر ، يقع إما في النهاية الطرفية 5 أو الموضع الأوسط أو النهاية الطرفية 3 بوصة.
- حدد الزوج غير المحرر/المحرر الذي أظهر الفرق الأقصى بين مناطق الانصهار على محور الهيلية لمزيد من التحليل. لتحليل μTGGE ، قم بتوليف الجزء الجيني المحدد عن طريق تضخيم PCR ، كما هو موضح في القسم 2 أدناه.
- صمم الاشعال الأمامي والعكسي باستخدام برنامج DNADynamo (https://www.bluetractorsoftware.com/DynamoDemo.htm) وتحقق باستخدام أداة NCBI Primer-BLAST .
- تمييع الاشعال في المخزن المؤقت TE (10 mM Tris-HCl يحتوي على 1 mM EDTA· Na2) وتخزينها بتركيز 100 pmol / μL. قبل الاستخدام ، قم بتخفيف كل تمهيدي تم ضبطه على تركيز 10 pmol / μL باستخدام الماء المقطر.
2. استخراج الحمض النووي الريبي وتضخيم RT-PCR للجزء المستهدف
- استخراج الحمض النووي الريبي
- استخراج الحمض النووي الريبي الكلي من مصدر الجينات المحررة وغير المحررة باستخدام الطرق القياسية ، مثل استخراج TRIzol14 أو المجموعات المتاحة تجاريا.
- قم بإجراء توليف cDNA المقابل باستخدام بروتوكول RT-PCR قياسي كما هو موضح في الخطوة 2.2.
- النسخ العكسي
- أضف 1 ميكرولتر من التمهيدي oligo (dT) ، و 1 ميكرولتر من مزيج dNTP 10 mM ، و 10 ميكرولتر من إجمالي الحمض النووي الريبي ، و 10 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم إلى أنبوب طرد مركزي دقيق خال من النوكلياز.
- سخني الخليط على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم احتضنيه على الثلج لمدة 1 دقيقة على الأقل.
- اجمع محتويات الأنبوب عن طريق الطرد المركزي بسرعة قصوى (12000 × جم) لمدة 2-3 ثوان ، وأضف 4 ميكرولتر من المخزن المؤقت ReverTra Ace 5x ، و 1 ميكرولتر من 0.1 M DTT ، و 1 ميكرولتر من M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) النسخ العكسي (200 U / μL ، جدول المواد).
- اخلطي عن طريق السحب لأعلى ولأسفل بلطف. إذا كنت تستخدم الاشعال العشوائية، احتضن الأنبوب عند 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- احتضن الأنبوب عند 55 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة ثم قم بتعطيل التفاعل عن طريق التسخين عند 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، في سخان حمام جاف / كتلة رقمية.
- قياس تركيز cDNA باستخدام مقياس الطيف الضوئي وتخزينه عند -25 درجة مئوية.
-
تضخيم PCR والتسلسل التأكيدي للمنتجات
- أضف الكواشف التالية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق خال من النوكلياز: 4 ميكرولتر من 5x Taq Polymerase Buffer ، و 2 ميكرولتر من مزيج dNTP 2 mM ، و 2 ميكرولتر من 25 mM MgCl 2 ، و 1.6 ميكرولتر من مجموعة التمهيدي (إلى الأمام والخلف ؛ كل 10 mM) ، و 2 ميكرولتر من قالب cDNA ، و 0.1 ميكرولتر من بوليميراز Taq (2.5 U / μL) ، و 8.3 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم (الحجم النهائي ، 20 ميكرولتر).
- أداء PCR مع ظروف ركوب الدراجات التالية: تمسخ الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ؛ 35 دورة من تمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، والتلدين عند درجة حرارة مناسبة (اعتمادا على مجموعة التمهيدي المحددة المستخدمة) لمدة 30 ثانية ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ؛ ثم تمديد نهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
- لتنقية منتجات PCR ، أضف 2 U من Exonuclease I و 0.5 U من فوسفاتيز الروبيان القلوي (ExoSAP). احتضن الأنبوب في جهاز تدوير حراري عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ، متبوعا ب 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، ثم حافظ على درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الخطوة التالية.
- للتسلسل التأكيدي ، أضف 11.5 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم ، و 2.5 ميكرولتر من التمهيدي الأمامي أو الخلفي ، و 1 ميكرولتر من منتجات PCR (مع ExoSAP) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.
ملاحظة: استخدم خدمات تسلسل الحمض النووي (على سبيل المثال، Eurofins Genomics) لتحليل التسلسل. - للتحقق من خصوصية منتجات PCR ، قم بإجراء التسلسل باستخدام كل من الاشعال الأمامي والخلفي. وترد في الجدول 1 أزواج التمهيدي المستخدمة في التحليل التمثيلي.
- قم بتخفيف منتجات PCR النقية إلى تركيز 200 نانوغرام / ميكرولتر بالماء منزوع الأيونات. بعد ذلك ، امزج 6 ميكرولتر من المنتج النقي مع 3 ميكرولتر من صبغة تحميل هلام 6x في أنبوب 250 ميكرولتر وارفع الحجم الإجمالي إلى 12 ميكرولتر بالماء المعقم. قم بتخزين منتج PCR (عند -25 درجة مئوية) حتى يصبح جاهزا للمتابعة مع μTGGE كما هو موضح أدناه.
3. تحليل μTGGE
ملاحظة: يتم إجراء تحليل μTGGE باستخدام نظام مصغر واقتصادي. يوضح الشكل 2 نظرة عامة على النظام الكامل ، بما في ذلك أشرطة الجل ، وحامل كاسيت الجل ، ومنصة الرحلان الكهربائي الهلامي الأفقي ، وإمدادات الطاقة ، ونظام التصوير الهلامي.
- تجميع أشرطة الجل
- يظهر كاسيت الجل المستخدم في تحليل μTGGE في الشكل 2A. يتكون التصميم من ثلاثة ألواح هلام مقاس 1 بوصة: لوحة هلام سفلية ، لوحة هلام علوية ، ولوحة سابقة للحارة. شطيرة لوحة الجل العلوي بين الطبقين الآخرين وتجميعها في حامل كاسيت الجل لبلمرة الهلام.
- إعداد هلام بولي أكريلاميد
- أضف 7.2 جم من اليوريا إلى أنبوب سعة 50 مل وتذوب في 10 مل من الماء المعقم. سخني العينة في الميكروويف لمدة 20-30 ثانية ثم أحضريها إلى درجة حرارة الغرفة (RT).
- أضف 3 مل من 5x Tris / borate / EDTA (TBE) العازلة (جدول المواد) ، و 2.25 مل من 40٪ (ث / v) أكريلاميد / مكرر (19: 1) ، و 75 ميكرولتر من 10x بيرسلفات الأمونيوم ، و 15 ميكرولتر من رباعي ميثيل إيثيلين ديامين إلى المحلول.
- صب محلول الجل على الفور في حامل كاسيت الجل ببطء ، وتجنب تكوين فقاعات الهواء.
- توليد ملفات تعريف الانصهار باستخدام وحدة μTGGE
- استخدم النسخة الاقتصادية المصغرة من جهاز μTGGE الموضح في الشكل 2 مع تدرج درجة حرارة (25-65 درجة مئوية) مضبوط عموديا على اتجاه هجرة الحمض النووي.
- انقع وسادات العازلة للرحلان الكهربائي العلوية والسفلية (0.5 سم × 2.5 سم) في 2 مل من المخزن المؤقت 1x TBE.
- ضع كاسيت الجل في وحدة غرفة الرحلان الكهربائي الأفقي وضع الوسادات العازلة العلوية والسفلية وفقا لذلك ، كما هو موضح في الشكل 2.
- بعد ذلك ، قم بتحميل 10 ميكرولتر من منتج PCR في البئر الأوسط (الأطول) و 1 ميكرولتر من منتج PCR في كل جانب بئر.
- بعد انتظار لمدة 1 دقيقة ، قم بتوصيل وحدة الطاقة وتزويد 100 فولت لمدة 12 دقيقة عند تدرج درجة حرارة خطية من 25-65 درجة مئوية.
- بعد اكتمال الجري ، أخرج الكاسيت وأزل الغطاء الزجاجي العلوي.
- صب 300 ميكرولتر من 10x صبغة SYBR Gold على الجل. تصور ملامح الذوبان باستخدام مصباح LED الأزرق المثبت في الجهاز الكهربائي بحجم راحة اليد.
ملاحظة: يجب حفظ ملف ناعم لصورة الجل لحساب درجة تشابه النمط (PaSS). - كرر كل تجربة كهروفيرية 3x لتأكيد قابلية تكرار البيانات.
4. حسابات PaSS
ملاحظة: يتم إجراء العمليات الحسابية باستخدام برنامج μTGGE Analyzer.
- قم بتنزيل البرنامج وفتحه.
- افتح ملف JPEG الذي يحتوي على صورة الجل. لاحظ أن البرنامج سيقبل ملفات تنسيق JPEG فقط.
- انقر فوق الزر " إطار" وحدد المنطقة المناسبة (الإطار) لصورة الهلام.
- انقر فوق الزر تصحيح الإحداثيات وأضف نقطتين مرجعيتين، كما هو موضح في الشكل 1B.
- انقر على زر إضافة نقاط المعالم وأضف نقاط عينة كما هو موضح في الشكل 1B. ثم احفظ بيانات صورة الهلام المعالجة بتنسيق μTGGE (*.tgg).
- انقر فوق الزر " عينة" وحدد خيار البحث عن نقاط بسيطة لمقارنة صورتين أو أكثر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استخدام μTGGE لتحديد تغيرات قاعدة النيوكليوتيدات المفردة في أحداث تحرير الحمض النووي الريبي
تم استخدام أربعة جينات معدلة لهذا البروتوكول (الجدول 1) ، بما في ذلك جين BFP المنتج في خلايا HEK293 (مع تحرير الحمض النووي الريبي C-to-U بواسطة إنزيمات deaminase من مركب تحرير البروتين الشحمي B mRNA. APOBEC115) ، جين EGFP الذي يحتوي على كودون إيقاف المغرة (TAA) المنتج في خلايا HEK293 (مع تحرير الحمض النووي الريبي من A إلى I بواسطة الأدينوسين دياميناس الذي يعمل على الحمض النووي الريبي 1 ؛ ADAR116)، والجينات النووية AT2G16586 وAT5G02670 في A. thaliana17,18 (مع تحرير الحمض النووي الريبي من U-to-C). تم تأكيد اختلافات النيوكليوتيدات المفردة بين العينات المحررة وغير المحررة المقابلة عن طريق تسلسل الحمض النووي. ثم تم إجراء تحليل μTGGE لفحص الاختلافات بين منحنيات الانصهار للعينات (الشكل 3).
بالنسبة لنوع تحرير الحمض النووي الريبي من C-to-U، أظهرت العينة غير المحررة ذات القاعدة C الأصلية نمط انصهار أطول عند نقطة انصهار نهاية الخيط من العينة المحررة باستخدام قاعدة U المعدلة (الشكل 3A). بالنسبة لنوع تحرير الحمض النووي الريبي من A إلى I(G)، عرضت العينة التي تم تحريرها باستخدام قاعدة I(G) المعدلة نمط انصهار أطول عند نقطة انصهار نهاية الخيط مقارنة بالعينة غير المحررة ذات القاعدة A الأصلية (الشكل 3B). بالنسبة لنوع تحرير الحمض النووي الريبي U-to-C "العكسي" ، تم تحليل جينين. بالنسبة للجين AT2G16586 ، أظهرت العينة المعدلة مع قاعدة C المعدلة نمط انصهار أطول بين نقاط الانصهار الأولي للحبلا ونقاط الانصهار النهائية للحبلا من العينة غير المحررة ذات قاعدة U الأصلية (الشكل 3C). ومع ذلك ، لم يلاحظ نمط مماثل للجين AT5G02670 الآخر (الشكل 3D). ومع ذلك، كان هناك فرق واضح بين الأنواع غير المحررة والمحررة عند نقطة الانصهار النهائية. وهذا يدل على أن مراقبة ملفات تعريف الذوبان بوضوح هي خطوة مهمة في التمييز بين الأنواع غير المحررة والمعدلة.
التحليل الكمي لأنماط ذوبان μTGGE التي تمثل أحداث تحرير الحمض النووي الريبي
بعد ذلك ، قمنا بحساب قيم PaSS11 لتقييم قابلية تكرار ملفات تعريف الذوبان المستندة إلى μTGGE والتي تمثل أحداث تحرير الحمض النووي الريبي الأربعة الموضحة أعلاه. توفر قيمة PaSS مقياسا لمدى قرب وجود نمطين من الانصهار ، مما يولد قيمة أعلى (الحد الأقصى: 1) لأنماط الانصهار المتشابهة للغاية. وبالتالي ، من المتوقع أن تكون قيم PaSS لمقارنات العينات غير المحررة والمحررة أقل من واحد. وكما هو مبين في الشكل 1 ب، تم استخدام نقاط المعالم لأنماط الانصهار التي تتوافق مع التحولات الهيكلية من الحمض النووي المزدوج إلى الحمض النووي الأحادي الخيط لحساب قيم PaSS. للقضاء على المتغيرات التجريبية ، تم إجراء التطبيع بمساعدة الكمبيوتر باستخدام نقطتين مرجعيتين داخليتين: النقطة المرجعية # 1 ، التي تمثل موضع العينة في شكل مزدوج تقطعت به السبل (الممر الأيسر) ، والنقطة المرجعية # 2 ، التي تمثل موضع العينة في شكل واحد تقطعت به السبل (الممر الأيمن). تم تطبيع إحداثيات نقاط المعالم إلى إحداثيات النقاط المرجعية الداخلية ثم تم استخدامها لحساب قيم PaSS. تم تكرار كل تجربة ثلاث مرات ، وتم تحديد متوسط القيمة. وكما هو متوقع، كانت قيم PaSS للعينات الأربع المحررة أقل من عينة واحدة (الشكل 4). كانت قيم PaSS لأنواع تحرير الحمض النووي الريبي من C-to-You و A-to-I أقل من تلك الموجودة في نوعي تحرير الحمض النووي الريبي U-to-C. من المحتمل أن يكون هذا الاختلاف مرتبطا بالمواقع المعنية لمواقع التحرير. وعلى وجه التحديد، كانت المواقع التي تم تحريرها من C-to-You وA-to-I قريبة نسبيا من النهايات الطرفية 5 '(في الموقعين 48 و 59 من شظايا 300 نقطة أساس تقريبا، على التوالي)، في حين كانت المواقع المعدلة من U-to-C تقع بالقرب من منتصف الأجزاء (في الموقعين 152 و 169). تشير هذه النتائج إلى أنه يمكن اكتشاف المواقع المحررة الموجودة في المواقع الطرفية باستخدام μTGGE بسهولة أكبر من تلك الموجودة في وسط الشظايا.
تحسين أنماط ذوبان TGGE لتحديد أحداث تحرير الحمض النووي الريبي
كما أشارت نتائجنا السابقة إلى أن قيمة PaSS قد تختلف اعتمادا على الموضع المحدد لموقع تحرير الحمض النووي الريبي ، فحصنا الاختلافات بين أنماط ذوبان جزء 300 نقطة أساس من جين BFP (المعبر عنه في خلايا HEK293T) حيث يقع موقع تم تحريره من C-to-U بالقرب من النهاية الطرفية 5 ، بالقرب من النهاية الطرفية 3 ، أو في وسط الجزء (الشكل 5A). قبل تحليل μTGGE ، تم التنبؤ بأنماط ذوبان الجزء غير المحرر وثلاثة أجزاء تم تحريرها باستخدام أداة uMelt HETS المستندة إلى الويب. أظهر هذا التحليل أنه من المتوقع أن يؤدي تعديل C-to-U إلى تحويل منحنى الانصهار إلى اليسار على طول محور درجة الحرارة (الشكل 5B). تم ترتيب قيم PaSS المحسوبة من تحليلات μTGGE للأجزاء غير المحررة والأجزاء الثلاثة المحررة على النحو التالي: تحرير الحمض النووي الريبي الطرفي الطرفي 5 أقدام < تحرير الحمض النووي الريبي الطرفي 3 أقدام < مركز تحرير الحمض النووي الريبي الطرفي 5 أقدام و 3 أقدام (الشكل 5C). والجدير بالذكر أن قيم PaSS هذه كانت متسقة مع النتائج المتوقعة باستخدام uMelt. تشير هذه النتائج إلى أن الاختلافات في قاعدة النيوكليوتيدات الموجودة في الطرف الطرفي 5 أو 3 أقدام تؤدي إلى اختلافات أكبر بين قيم PaSS للجينات المحررة وغير المحررة من اختلافات قاعدة النيوكليوتيدات الموجودة بشكل أكثر مركزية. بالإضافة إلى ذلك ، تشير هذه النتائج إلى أنه يمكن استخدام المعرفة المسبقة بالاختلافات بين ملفات تعريف الانصهار للجينات المحررة وغير المعدلة كدليل لتحسين شظايا الجينات لتحرير الحمض النووي الريبي.
الشكل 1: الإجراء المستخدم لتحديد تحرير الحمض النووي الريبي بواسطة μTGGE. (A) أنواع أحداث تحرير الحمض النووي الريبي التي تم فحصها. (ب) رسم تخطيطي لملامح الذوبان النموذجية للجينات المحررة وغير المحررة. في μTGGE ، تهاجر عينة عبر هلام تدرج درجة الحرارة ، مما ينتج عنه انحناء مميز. يتم تعيين نقاط المعالم الخاصة بنمط الانصهار ثم معالجتها لحساب قيمة درجة تشابه النمط (PaSS). يتم إجراء حساب PaSS كما هو موضح في المعادلة ، حيث يكون المتجه P لكل نقطة معلم في موضعه المقابل ووظيفة درجة الحرارة والتنقل (أي المتجه P = P (T ، m)). تمثل الحروف الزائدة (1) و (2) الجينات المحررة وغير المحررة ، على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: رسوم توضيحية وصور فوتوغرافية لجهاز الرحلان الكهربائي الهلامي بحجم راحة اليد. (أ) تجميع الثلاثة 1 في أشرطة الهلام. (ب) رسم توضيحي لحامل كاسيت الجل مع لوحة تدرج درجة الحرارة. تظهر الصورة مواضع الوسادات العازلة العلوية والسفلية، وكذلك مواضع العينة بعد التحميل الأولي. (ج) نظرة عامة على النظام الكامل ، بما في ذلك مصدر الطاقة ، ومنصة الرحلان الكهربائي الهلامي الأفقي ، ونظام التصوير الهلامي. يوفر هذا النظام حلا قابلا للتطبيق للتحليلات السريعة القائمة على الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد في الموقع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحليلات TGGE لتغيرات النيوكليوتيدات المفردة في أحداث تحرير الحمض النووي الريبي. تم فحص ملفات تعريف الذوبان لثلاثة أنواع مختلفة من تحرير الحمض النووي الريبي باستخدام أربعة جينات. (أ) تحرير الحمض النووي الريبي من C إلى U في BFP المعبر عنه في خلايا HEK293T. (ب) تحرير الحمض النووي الريبي من A إلى I(G) في EGFP المعبر عنه في خلايا HEK293T. (C) تحرير الحمض النووي الريبي من U-to-C في جين AT2G16586 من A. thaliana. (D) تحرير الحمض النووي الريبي من U-to-C في الجين AT5G02670 من A. thaliana. يتم تمييز مواقع المواقع التي تم تحريرها باللون الأصفر (بخط أحمر)، ويتم تسطير مواضع التمهيدي. يشار إلى الاختلافات بين أنماط الانصهار للعينات المحررة وغير المحررة بواسطة دوائر حمراء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: متوسط قيم PaSS للجينات الأربعة المعدلة التي تم فحصها هنا. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري لثلاثة نسخ متماثلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تحليل PaSS الخاص بالموضع (أ) تم نقل موقع تحرير الحمض النووي الريبي من النوع C-to-U في جين BFP المعبر عنه في خلايا HEK293T إلى النهاية الطرفية 5 '، أو النهاية الطرفية 3' ، أو مركز جزء الجين. (ب) التنبؤ النظري بأنماط انصهار الأجزاء غير المحررة والثلاثة المحررة المبينة في (أ). تم تنفيذ التنبؤات باستخدام uMelt. (ج) متوسط قيم PaSSللجينات المحررة الموضحة في (A). تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري لثلاثة نسخ متماثلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| S.No | تحرير الحمض النووي الريبي | مصدر | موضع | معرف الجين | التمهيدي الأمامي | التمهيدي العكسي | طول التسلسل | ||
| 1 | C-to-U | خلايا HEK293T | 48عشر | EGFP | AAGCTGACCC TGAAGTTCATC |
GCTGTTGTAGT TGTACTCCAGC |
324 | ||
| 2 | من الألف إلى الياء | خلايا HEK293T | 59عشر | EGFP | AGGGCGATGC CACCTACGGCA |
CCGTCCTCCT TTAAGTCGA |
300 | ||
| 3 | U-to-C | أرابيدوبسيس | 152عشر | AT2G16586 | GGGCGATGTT ACGCTCGATGA |
GTGAAGAGTAA CATGGCGTT |
301 | ||
| 4 | U-to-C | أرابيدوبسيس | 169عشر | AT5G02670 | CCAGTTGGCAG AATCCAGTCA |
CTAGCTTCCAC TGTTGAGATTC |
300 | ||
الجدول 1: قائمة الجينات المستخدمة في البروتوكول الحالي
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يلعب تحرير الحمض النووي الريبي دورا مهما في علم الأحياء. ومع ذلك ، فإن الطرق الحالية للكشف عن تحرير الحمض النووي الريبي ، مثل الكروماتوغرافيا والتسلسل ، تمثل العديد من التحديات بسبب تكلفتها العالية ، ومتطلبات الوقت المفرطة ، والتعقيد. البروتوكول الموضح هنا هو طريقة بسيطة وسريعة وفعالة من حيث التكلفة للكشف عن تحرير الحمض النووي الريبي الذي يستخدم نظاما محمولا ومجهريا يعتمد على TGGE. يمكن استخدام هذا النظام للتمييز بين الجينات المحررة وغير المعدلة قبل تسلسل سانجر. على وجه التحديد ، يمكن تمييز الجينات المعدلة وغير المحررة مع تعديلات النيوكليوتيدات أحادية القاعدة بناء على التغيرات في ملفات تعريف ذوبان TGGE. نظرا لأنه يتضمن 1 في المواد الهلامية ، يتطلب النظام كميات صغيرة جدا من العينات ويتيح الكشف السريع عن الاختلافات بين التسلسلات. بالإضافة إلى ذلك ، من السهل جدا اتباع البروتوكول الموصوف هنا لكل من الخبراء والقادمين الجدد إلى هذا المجال. يعد تحسين جزء الجين المستهدف أمرا بالغ الأهمية للتمييز الواضح بين المناطق المحررة وغير المحررة ، ويتم تبسيط هذه العملية في البروتوكول الحالي.
يتوافق هذا البروتوكول مع التحليلات متعددة الإرسال باستخدام الاشعال الموسومة بالفلورسنت. بالنسبة للتحليلات الكمية، يمكن وضع علامة على عينات الحمض النووي الريبي غير المعروفة (المحررة أو غير المحررة) بالتألق الأخضر وتمييزها بمعيار مرجعي أحمر موسوم بالتألق (محرر أو غير محرر) أثناء تحليل TGGE.
بالإضافة إلى إظهار قدرة طريقة μTGGE على اكتشاف أحداث تحرير الحمض النووي الريبي للنيوكليوتيد الأحادي ، قمنا أيضا بالتحقق من صحة التشابه بين النتيجة التجريبية التي تم الحصول عليها باستخدام μTGGE والنتيجة النظرية التي تم الحصول عليها لنفس الجزء الجيني باستخدام uMELT. علاوة على ذلك ، وجدنا أن الاختلافات في قاعدة النيوكليوتيدات الموجودة في طرفي 5 و 3 من شظايا الجينات تنتج اختلافات أكبر في ملفات تعريف ذوبان μTGGE (أي قيم PaSS أصغر) من تلك الموجودة نحو مركز الشظايا. على الرغم من أن البروتوكول الحالي واعد ، إلا أنه قد يقتصر على تحليل واكتشاف أنواع محددة من تعديلات النيوكليوتيدات أثناء تحرير الحمض النووي الريبي. سيتم إجراء المزيد من التحسين والتطوير لهذا البروتوكول لتحليل الأنواع و / أو المواقع الأخرى لتحرير الحمض النووي الريبي في بحثنا القادم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل منحة معونة للبحث العلمي من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (17H02204 و 18K19288). تم دعم روتشيكا ماليا من قبل الحكومة اليابانية (منحة MEXT). نشكر السيدة راديكا بياني (مختبر تاكاغي، JAIST) والدكتورة كيرتي شارما (شركة BioSeeds Corporation) على المساعدة في التجارب المتعلقة بالرحلان الكهربائي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2U ExoI | Takara | 2650A | Exonuclease I |
| 40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1) | Thermo fisher | AM9022 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Thermo Fisher | 17874 | |
| Centrifuge Mini spin | eppendorf | 5452000034 | |
| Digital dry bath/ block heater | Thermo fisher | NA | |
| Gold Taq Polymerase Master mixture | Promega | M7122 | |
| LATaq DNA polymerase | TAKARA | RR002A | Taq Polymerase |
| micro-TGGE cassette holder | BioSeeds Corp. | BS-GE-CH | |
| micro-TGGE apparatus | Lifetech Corp. | TG | |
| micro-TGGE gel cassette | BioSeeds Corp. | BS-TGGE-C | |
| NanoDrop 1000 | Thermo fisher | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Plant Rneasy Mini kit | Qiagen | 74904 | |
| ReverTra Ace Master Mix | TOYOBO | TRT101 | M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | Takara | 2660B | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Thermo fisher | S11494 | |
| TBE buffer | Thermo fisher | B52 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai tesque | 33401-72 | |
| Urea, Nuclease and protease tested | Nacalai tesque | 35940-65 |
References
- Chateigner-Boutin, A. L., Small, I. A rapid high-throughput method for the detection and quantification of RNA editing based on high-resolution melting of amplicons. Nucleic Acids Research. 35 (17), 114 (2007).
- Chen, Y. C., et al. A real-time PCR method for the quantitative analysis of RNA editing at specific sites. Analytical Biochemistry. 375 (1), 46-52 (2008).
- Barbon, A., Vallini, I., La Via, L., Marchina, E., Barlati, S. Glutamate receptor RNA editing: a molecular analysis of GluR2, GluR5 and GluR6 in human brain tissues and in NT2 cells following in vitro neural differentiation. Molecular Brain Research. 117 (2), 168-178 (2003).
- Gallo, A., Thomson, E., Brindle, J., O'Connell, M. A., Keegan, L. P. Micro-processing events in mRNAs identified by DHPLC analysis. Nucleic Acids Research. 30 (18), 3945-3953 (2002).
- Schiffer, H. H., Heinemann, S. F. A Quantitative method to detect RNA editing events. Analytical Biochemistry. 276 (2), 257-260 (1999).
- Burns, C. M., et al. Regulation of serotonin-2C receptor G-protein coupling by RNA editing. Nature. 387 (6630), 303-308 (1997).
- Marian, A. J.
- Bird, A. Genome biology: Not drowning but waving. Cell. 154 (5), 951-952 (2013).
- Jones, B. M., Knapp, L. A. Temporal temperature gradient electrophoresis for detection of single nucleotide polymorphisms. Methods in Molecular Biology. 578, Clifton, N.J. 153-165 (2009).
- Riesner, D., et al. Temperature-gradient gel electrophoresis of nucleic acids: analysis of conformational transitions, sequence variations, and protein-nucleic acid interactions. Electrophoresis. 10 (5-6), 377-389 (1989).
- Biyani, M., Nishigaki, K. Hundred-fold productivity of genome analysis by introduction of micro-temperature gradient gel electrophoresis. Electrophoresis. 22 (1), 23-28 (2001).
- Rathore, H., Biyani, R., Kato, H., Takamura, Y., Biyani, M. Palm-size and one-inch gel electrophoretic device for reliable and field-applicable analysis of recombinase polymerase amplification. Analytical Methods. 11 (39), 4969-4976 (2019).
- Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
- Bhakta, S., Sakari, M., Tsukahara, T. RNA editing of BFP, a point mutant of GFP, using artificial APOBEC1 deaminase to restore the genetic code. Scientific Reports. 10 (1), 17304 (2020).
- Azad, T. A., Qulsum, U., Tsukahara, T. Comparative activity of adenosine deaminase acting on RNA (ADARs) isoforms for correction of genetic code in gene therapy. Current Gene Therapy. 19 (1), 31-39 (2019).
- Ruchika, O. C., Sakari, M., Tsukahara, T. Genome-wide identification of U-To-C RNA editing events for nuclear genes in Arabidopsis thaliana. Cells. 10 (3), 635 (2021).
- Tsukahara, T. The U-to-C RNA editing affects the mRNA stability of nuclear genes in Arabidopsis thaliana. Biochemical and Biophysical Research Communications. 571, 110-117 (2021).
