Summary
זיהוי מהיר וכימות אמין של אירועי עריכת RNA בקנה מידה גנומי נותרו מאתגרים ומסתמכים כיום על שיטות ריצוף RNA ישירות. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש באלקטרופורזה של ג'ל גרדיאנט מיקרו-טמפרטורה (μTGGE) כשיטה פשוטה, מהירה וניידת לאיתור עריכת RNA.
Abstract
עריכת RNA היא תהליך שמוביל לשינויים ברצף פוסט-טרנספורמטיבי ב-RNA. זיהוי וכימות של עריכת RNA מסתמכים בעיקר על ריצוף סנגר וטכניקות ריצוף RNA. עם זאת, שיטות אלה יכולות להיות יקרות וגוזלות זמן רב. בפרוטוקול זה, מערכת אלקטרופורזה ניידת של ג'ל גרדיאנט מיקרו-טמפרטורה (μTGGE) משמשת כגישת אי-ריצוף לזיהוי מהיר של עריכת RNA. התהליך מבוסס על עקרון האלקטרופורזה, המשתמשת בטמפרטורות גבוהות כדי לנטרל דגימות של חומצות גרעין בזמן שהן נעות על פני ג'ל פוליאקרילאמיד. על פני טווח טמפרטורות, מקטע דנ"א יוצר שיפוע של דנ"א דו-גדילי מלא לגדילים מופרדים חלקית ולאחר מכן לדנ"א חד-גדילי מופרד לחלוטין. אתרים שנערכו על ידי RNA עם בסיסי נוקלאוטידים מובחנים מייצרים פרופילי התכה שונים בניתוחי μTGGE. השתמשנו בגישה המבוססת על μTGGE כדי לאפיין את ההבדלים בין פרופילי ההיתוך של ארבעה מקטעי RNA ערוכים לבין השברים הלא ערוכים (מסוג פראי) המתאימים להם. ציוני דמיון תבניות (PaSSs) חושבו על ידי השוואת תבניות הפסים שהופקו על ידי ה-RNA הערוכים והלא ערוכים, ושימשו להערכת יכולת השכפול של השיטה. באופן כללי, הפלטפורמה המתוארת כאן מאפשרת לזהות אפילו מוטציות בסיס בודדות ברנ"א בצורה פשוטה, פשוטה וחסכונית. הצפי הוא שכלי ניתוח זה יסייע לממצאים חדשים של הביולוגיה המולקולרית.
Introduction
וריאנטים של נוקלאוטידים בודדים (SNVs) ברנ"א גנומי, כולל גרסאות A-to-I, C-to-U ו-U-to-C, יכולות להצביע על אירועי עריכת RNA. עם זאת, זיהוי של SNVs ב- RNA נותר משימה מאתגרת מבחינה טכנית. באופן קונבנציונלי, היחס בין רנ"א ערוך לרנ"א לא ערוך נקבע על ידי ריצוף ישיר, תגובת שרשרת פולימראז ספציפית לאלל בזמן אמת (PCR), או דה-נטורציה של כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) מתקרבת ל-1,2,3,4,5,6. עם זאת, גישות אלה אינן חסכוניות במיוחד בזמן או באופן חסכוני במיוחד, והדיוקים הנמוכים שלהן, הנגרמים על ידי רמות גבוהות של רעש, מציבים צווארי בקבוק טכנולוגיים לזיהוי SNV מבוסס RNA 7,8. כאן נתאר פרוטוקול המבוסס על אלקטרופורזה של ג'ל שיפוע טמפרטורה (TGGE) לזיהוי פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים (SNPs) כשיטה חלופית המבטלת את הצורך בגישות ריצוף RNA ישירות לניתוחי עריכת RNA.
אלקטרופורזה היא שיטה מועדפת להפרדה וניתוח של ביומולקולות במעבדות מדעי החיים. TGGE מאפשר הפרדה של מקטעי דנ"א דו-גדיליים שהם באותו גודל אך בעלי רצפים שונים. הטכניקה מסתמכת על הבדלים הקשורים לרצף בטמפרטורות ההיתוך של שברי דנ"א ועל השינויים הבאים בניידות שלהם בג'לים נקבוביים עם שיפוע טמפרטורה ליניארי 9,10. התכה של מקטעי דנ"א יוצרת פרופילי התכה ספציפיים. ברגע שהתחום עם טמפרטורת ההיתוך הנמוכה ביותר מגיע לטמפרטורה המתאימה במיקום מסוים בג'ל, מתרחש המעבר ממבנה סלילי למבנה מומס חלקית, והנדידה של המולקולה תיעצר למעשה. לכן, TGGE משתמשת הן בניידות (מידע על גודל) והן במעברים מבניים המושרים על ידי טמפרטורה של מקטעי דנ"א (מידע תלוי רצף), מה שהופך אותה לגישה רבת עוצמה לאפיון מקטעי דנ"א. נקודות התכונה בתבנית התכה של TGGE, המתאימות לשלושה מעברים מבניים של מולקולת הדנ"א, הן נקודת הדיסוציאציה ההתחלתית של גדיל, נקודת הדיסוציאציה האמצעית של הגדיל, ונקודת הדיסוציאציה הסופית של הגדיל (איור 1). וריאציות רצף בתוך תחומים, אפילו הבדלים חד-בסיסיים, משפיעות על טמפרטורת ההיתוך, ולכן, מולקולות עם רצפים שונים יציגו דפוסי התכה בדידים (דנטורציה) בניתוחי TGGE. לכן, TGGE יכול לשמש לניתוח SNVs ברנ"א גנומי ויכול להיות שיטה בעלת תפוקה גבוהה שלא תסולא בפז לגילוי עריכת RNA. רווח זה בתפוקה גבוהה הולך לאיבוד כאשר נעשה שימוש ב- TGGE מסורתי מבוסס אלקטרופורזה של ג'ל. עם זאת, ניתן להשתמש בגרסה ממוזערת של TGGE, הנקראת microTGGE (μTGGE), כדי לקצר את הזמן האלקטרופורטי של הג'ל ולהאיץ את הניתוח עם עלייה של פי 100 בפרודוקטיביות11. הפשטות והקומפקטיות של שיטת μTGGE שופרו על ידי הצגת PalmPAGE12, מערכת אלקטרופורזה ג'לית ישימה בשדה, כף יד ובמחיר סביר.
כאן, פרוטוקול חדש המבוסס על TGGE משמש לבחינת שלושה סוגים של אתרי עריכת RNA (A-to-I, C-to-U ו-U-to-C) בארבעה גנים, כולל שניים מרקמות ה-Arabidopsis thaliana ושניים המתבטאים בתאי HEK293 של יונקים (איור 1A). הפרוטוקול משלב את השימוש ב-PalmPAGE (חומרה), מערכת ניידת לזיהוי מהיר של עריכת RNA, ו-uMelt (תוכנה)13. עם זמן ריצה ממוצע של 15-30 דקות, פרוטוקול זה מאפשר זיהוי מהיר, אמין וקל של עריכת RNA ללא צורך בגישות ריצוף RNA ישירות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. אופטימיזציה של קטע המטרה
הערה: ארבעה גנים ערוכים שימשו בפיתוח פרוטוקול זה, כולל שני גנים גרעיניים (AT2G16586 ו- AT5G02670) מ - A. thaliana, והגנים המקודדים חלבון פלואורסצנטי כחול (BFP) וחלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP) המתבטאים בתאי HEK293.
- כדי לזהות שברי גנים עם פרופילי התכה שונים, המייצגים אזורים ערוכים לעומת אזורים לא ערוכים, ליצור עקומות התכה חזויות באמצעות הכלי מבוסס האינטרנט uMelt HETS, הרחבה של תוכנת uMeltהמקורית 13.
הערה: כלי זה חוזה את הצורות של עקומות התכה עבור מוצרי הטרודופלקס והומודופלקס. - עבור כל גן מטרה, עצבו שלושה זוגות של שברי גנים (באורך של 300-324 bp). כל זוג מורכב מקטע עם אתר ערוך ומקטע תואם מסוג פראי עם אתר לא ערוך, הממוקם בקצה 5'-מסוף, מיקום אמצעי או 3' -קצה קצה.
- בחר את הזוג הלא ערוך/ערוך שהראה את ההפרש המרבי בין אזורי ההיתוך בציר ההליקיטי לניתוח נוסף. לצורך ניתוח μTGGE, סינתז את קטע הגן שנבחר על ידי הגברת PCR, כמתואר בסעיף 2 להלן.
- תכנן את הפריימרים קדימה ואחורה באמצעות תוכנת DNADynamo (https://www.bluetractorsoftware.com/DynamoDemo.htm) ואמת באמצעות הכלי NCBI Primer-BLAST.
- דילול הפריימרים במאגר TE (10 mM Tris-HCl המכיל 1 mM EDTA· Na2) ולאחסן אותם בריכוז של 100 pmol/μL. לפני השימוש, דיללו כל פריימר שנקבע לריכוז של 10 pmol/μL באמצעות מים מזוקקים.
2. מיצוי RNA והגברת RT-PCR של מקטע המטרה
- מיצוי RNA
- חלץ RNA כולל ממקור של גנים ערוכים ולא ערוכים בשיטות סטנדרטיות, כגון מיצוי TRIzol14 או ערכות זמינות מסחרית.
- בצע את הסינתזה של ה- cDNA המתאים באמצעות פרוטוקול RT-PCR סטנדרטי כמתואר בשלב 2.2.
- תמלול הפוך
- הוסיפו 1 μL של פריימר אוליגו(dT), 1 μL של תערובת dNTP של 10 mM, 10 μL של RNA כולל, ו-10 μL של מים מזוקקים סטריליים לצינור מיקרוצנטריפוג' נטול נוקלאז.
- מחממים את התערובת ב-65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ואז דוגרים על קרח למשך דקה אחת לפחות.
- אסוף את תוכן הצינור על ידי צנטריפוגה במהירות המרבית (12,000 x g) עבור 2-3 שניות, והוסף 4 μL של 5x ReverTra Ace buffer, 1 μL של 0.1 M DTT, ו-1 μL של M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) הפוך תעתיק הפוך (200 U/μL, טבלת חומרים).
- מערבבים על ידי צנרת למעלה ולמטה בעדינות. אם אתה משתמש בפריימרים אקראיים, דגירה של הצינור בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- דגירה של הצינור בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות ולאחר מכן השביתו את התגובה על ידי חימום בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, באמבטיה יבשה דיגיטלית / מחמם בלוקים.
- מדוד את ריכוז ה- cDNA באמצעות ספקטרופוטומטר ואחסן אותו בטמפרטורה של -25 מעלות צלזיוס.
-
הגברת PCR וריצוף מאשר של מוצרים
- הוסיפו את הריאגנטים הבאים לצינור מיקרו-צנטריפוג' נטול נוקלאזות: 4 μL של 5x Taq Polymerase Buffer, 2 μL של תערובת dNTP של 2 mM, 2 μL של 25 mM MgCl2, 1.6 μL של קבוצת הפריימרים (קדימה ואחורה; כל 10 mM), 2 μL של תבנית cDNA, 0.1 μL של Taq פולימראז (2.5 U/μL), ו-8.3 μL של מים מזוקקים סטריליים (נפח סופי, 20 μL).
- בצע PCR עם תנאי האופניים הבאים: דנטורציה ראשונית ב 95 °C (95 °F) למשך 2 דקות; 35 מחזורים של דנטורציה בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, חישול בטמפרטורה מתאימה (תלוי בערכת הפריימרים הספציפית המשמשת) במשך 30 שניות, והרחבה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; ולאחר מכן הארכה סופית ב 72 °C (72 °F) למשך 7 דקות.
- כדי לטהר את מוצרי ה-PCR, הוסיפו 2 U של אקסונוקלאז I ו-0.5 U של פוספטאז אלקליין שרימפס (ExoSAP). דגירה של הצינור ברכיבה תרמית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת, ולאחר מכן 80 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן שמרו על 4 מעלות צלזיוס עד לשלב הבא.
- לריצוף מאשר, הוסף 11.5 μL של מים מזוקקים סטריליים, 2.5 μL של פריימר קדימה או אחורה, ו-1 μL של מוצרי PCR (עם ExoSAP) לצינור microcentrifuge חדש.
הערה: השתמש בשירותי ריצוף דנ"א (למשל, Eurofins Genomics) לניתוח ריצוף. - כדי לאמת את הספציפיות של מוצרי ה-PCR, בצע ריצוף עם פריימרים קדימה ואחורה. זוגות הפריימרים המשמשים בניתוח הייצוגי ניתנים בטבלה 1.
- דיללו את מוצרי ה-PCR המטוהרים לריכוז של 200 ננוגרם/מיקרול עם מים שעברו דה-יוניזציה. לאחר מכן, יש לערבב 6 μL של המוצר המטוהר עם 3 μL של 6x ג'ל טעינת צבע בצינור 250 μL ולהגדיל את הנפח הכולל ל 12 μL עם מים סטריליים. אחסן את מוצר ה-PCR (בטמפרטורה של -25 °C) עד שיהיה מוכן להמשיך עם μTGGE כמתואר להלן.
3. ניתוח μTGGE
הערה: ניתוח μTGGE מבוצע באמצעות מערכת ממוזערת וכלכלית. סקירה כללית של המערכת כולה, כולל קלטות הג'ל, מחזיק קלטות הג'ל, פלטפורמת אלקטרופורזה אופקית של ג'ל, ספק כוח ומערכת הדמיית ג'ל, מוצגת באיור 2.
- הרכבה של קלטות הג'ל
- קלטת הג'ל המשמשת לניתוח μTGGE מוצגת באיור 2A. העיצוב מורכב משלוש צלחות ג'ל בגודל 1 אינץ ': צלחת ג'ל תחתונה, צלחת ג'ל עליונה וצלחת לשעבר. כרכו את צלחת הג'ל העליונה בין שתי הצלחות האחרות והרכיבו במחזיק הקסטות של הג'ל לפולימריזציה של הג'ל.
- הכנת ג'ל פוליאקרילאמיד
- מוסיפים 7.2 גרם אוריאה לצינור של 50 מ"ל ומתמוססים ב-10 מ"ל של מים סטריליים. מחממים את הדגימה במיקרוגל במשך 20-30 שניות ואז מביאים אותה לטמפרטורת החדר (RT).
- הוסף 3 מ"ל של 5x טריס / בוראט / EDTA (TBE) חיץ (טבלת חומרים), 2.25 מ"ל של 40% (w / v) אקרילאמיד / ביס (19: 1), 75 μL של 10x אמוניום persulfate, ו 15 μL של טטרהמתילאתילנדיאמין לתמיסה.
- מיד לשפוך את תמיסת הג'ל לתוך מחזיק קלטת ג'ל לאט, הימנעות היווצרות של בועות אוויר.
- יצירת פרופילי התכה באמצעות יחידת μTGGE
- השתמשו בגרסה הממוזערת והחסכונית של מנגנון ה-μTGGE המוצגת באיור 2 עם שיפוע טמפרטורה (25-65 מעלות צלזיוס) הניצב לכיוון נדידת הדנ"א.
- השרו את רפידות מאגר האלקטרופורזה העליונות והתחתונות (0.5 ס"מ x 2.5 ס"מ) ב-2 מ"ל של מאגר TBE אחד.
- הניחו את קלטת הג'ל ביחידת תא האלקטרופורזה האופקית ומקמו את רפידות המאגר העליונות והתחתונות בהתאם, כפי שמוצג באיור 2.
- לאחר מכן, טען 10 μL של מוצר ה- PCR לבאר האמצעית (הארוכה יותר) ו- 1 μL של מוצר ה- PCR לכל באר צדדית.
- לאחר המתנה של דקה אחת, חבר את יחידת הכוח וספק 100 וולט למשך 12 דקות בשיפוע טמפרטורה ליניארי מ 25-65 מעלות צלזיוס.
- לאחר סיום הריצה, הוציאו את הקלטת והסירו את כיסוי הזכוכית העליון.
- יוצקים 300 μL של כתם זהב SYBR 10x על הג'ל. דמיינו את פרופילי ההיתוך באמצעות פנס ה-LED הכחול המותקן בהתקן האלקטרופורטי בגודל כף היד.
הערה: יש לשמור קובץ רך של תמונת הג'ל עבור חישוב ציון דמיון תבנית (PaSS). - חזור על כל ניסוי אלקטרופורטי פי 3 כדי לאשר את יכולת השכפול של הנתונים.
4. חישובי PaSS
הערה: החישובים מבוצעים באמצעות תוכנת μTGGE Analyzer.
- הורד ופתח את התוכנה.
- פתח את קובץ JPEG המכיל את תמונת הג'ל. שים לב שהתוכנה תקבל רק קבצים בפורמט JPEG.
- לחץ על כפתור מסגרת ובחר את האזור (מסגרת) המתאים של תמונת הג'ל.
- לחצו על הלחצן 'תיקון קואורדינטות ' והוסיפו שתי נקודות הפניות, כפי שמוצג באיור 1B.
- לחץ על לחצן הוספת נקודות תכונה והוסף נקודות לדוגמה כפי שמוצג באיור 1B. לאחר מכן שמור את נתוני תמונת הג'ל המעובדים בתבנית μTGGE (*.tgg).
- לחץ על הלחצן לדוגמה ובחר באפשרות חפש נקודות פשוטות כדי להשוות בין שתי תמונות או יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שימוש ב- μTGGE לזיהוי שינויים בבסיס נוקלאוטידים בודדים באירועי עריכת RNA
ארבעה גנים ערוכים שימשו לפרוטוקול זה (טבלה 1), כולל הגן BFP המיוצר בתאי HEK293 (עם עריכת RNA C-to-U על ידי אנזימי הדאמינאז של קומפלקס אנזימי העריכה של אפוליפופרוטאין B mRNA; APOBEC115), הגן EGFP המכיל את קודון עצירת האוכרה (TAA) המיוצר בתאי HEK293 (עם עריכת RNA A-to-I על ידי אדנוזין דאמינאז הפועלת על רנ"א 1; ADAR116), והגנים הגרעיניים AT2G16586 ו-AT5G02670 ב-A. thaliana17,18 (עם עריכת RNA U-to-C). הבדלי נוקלאוטידים בודדים בין הדגימות הערוכות והלא ערוכות המתאימות אושרו על ידי ריצוף DNA. לאחר מכן בוצע ניתוח μTGGE כדי לבחון את ההבדלים בין עקומות ההיתוך של הדגימות (איור 3).
עבור סוג העריכה של C-to-U RNA, הדגימה הלא ערוכה עם בסיס C המקורי הראתה תבנית התכה ארוכה יותר בנקודת ההיתוך של קצה הגדיל מאשר הדגימה הערוכה עם בסיס U שהשתנה (איור 3A). עבור סוג עריכת הרנ"א A-to-I(G), הדגימה הערוכה עם בסיס I(G) שהשתנה הציגה תבנית התכה ארוכה יותר בנקודת ההיתוך של קצה הגדיל מאשר הדגימה הלא ערוכה עם בסיס A המקורי (איור 3B). עבור סוג עריכת ה-U-to-C RNA ה"הפוך", נותחו שני גנים. עבור הגן AT2G16586, הדגימה הערוכה עם בסיס C שהשתנה הראתה דפוס התכה ארוך יותר בין נקודות ההיתוך הראשוניות של הגדיל לבין נקודות ההיתוך הסופיות של הגדיל מאשר הדגימה הלא ערוכה עם בסיס U המקורי (איור 3C). עם זאת, דפוס דומה לא נצפה עבור הגן האחר AT5G02670 (איור 3D). עם זאת, היה הבדל מובהק בין הטיפוסים הלא ערוכים והטיפוסים הערוכים בנקודת ההיתוך הסופית. זה מראה שהתבוננות ברורה בפרופילי התכה היא שלב חשוב בהבחנה בין טיפוסים לא ערוכים לטיפוסים ערוכים.
ניתוח כמותי של דפוסי התכה μTGGE המייצגים אירועי עריכת RNA
לאחר מכן, חישבנו את ערכי PaSS11 כדי להעריך את יכולת השכפול של פרופילי ההיתוך מבוססי μTGGE המייצגים את ארבעת אירועי עריכת הרנ"א שתוארו לעיל. ערך PaSS מספק מדד למידת ההצמדה של שתי תבניות התכה, מה שיוצר ערך גבוה יותר (מקסימום: 1) עבור תבניות התכה דומות מאוד. לפיכך, ערכי PaSS להשוואות של דוגמאות לא ערוכות וערוכות צפויים להיות פחות מאחד. כפי שניתן לראות באיור 1B, נקודות התכונה של תבניות ההיתוך שהתאימו למעברים מבניים מדנ"א דו-גדילי לדנ"א חד-גדילי שימשו לחישוב ערכי PaSS. כדי למנוע משתנים ניסיוניים, בוצעה נורמליזציה בעזרת מחשב באמצעות שתי נקודות ייחוס פנימיות: נקודת ייחוס מס' 1, המייצגת את מיקום המדגם בצורה דו-גדילית (הנתיב השמאלי ביותר), ונקודת ייחוס מס' 2, המייצגת את מיקום המדגם בצורה חד-גדילית (הנתיב הימני ביותר). הקואורדינטות של נקודות התכונה נורמלו לאלה של נקודות הייחוס הפנימיות ולאחר מכן שימשו לחישוב ערכי PaSS. כל ניסוי חזר על עצמו שלוש פעמים, והערך הממוצע נקבע. כצפוי, ערכי ה-PaSS של ארבע הדגימות הערוכות היו נמוכים מאחד (איור 4). ערכי ה-PaSS של סוגי העריכה C-to-you ו-A-to-I RNA היו נמוכים יותר מאלו של שני סוגי העריכה של RNA U-to-C. הבדל זה קשור ככל הנראה למיקומים המתאימים של אתרי העריכה. באופן ספציפי, האתרים הערוכים C-to-you ו-A-to-I היו ממוקמים קרוב יחסית ל-5' קצוות הטרמינל (במיקומים 48 ו-59 מתוך מקטעי ~300 bp, בהתאמה), בעוד שהאתרים הערוכים U-to-C היו ממוקמים בסמוך לאמצע השברים (במיקומים 152 ו-169). ממצאים אלה מצביעים על כך שניתן לזהות בקלות רבה יותר אתרים ערוכים הממוקמים במיקומי מסוף באמצעות μTGGE באמצעות μTGGE בקלות רבה יותר מאשר אתרים הממוקמים במרכז השברים.
אופטימיזציה של דפוסי התכה של TGGE לזיהוי אירועי עריכת RNA
מכיוון שהתוצאות הקודמות שלנו הציעו כי ערך ה- PaSS עשוי להשתנות בהתאם למיקום הספציפי של אתר עריכת הרנ"א, בחנו את ההבדלים בין דפוסי ההיתוך של מקטע של 300 bp של הגן BFP (המבוטא בתאי HEK293T) שבו אתר ערוך C-to-U היה ממוקם קרוב לקצה 5'-terminal, קרוב לקצה 3'-terminal, או במרכז השבר (איור 5A). לפני ניתוח μTGGE, דפוסי ההיתוך של הקטע הלא ערוך ושלושה קטעים ערוכים נחזו באמצעות הכלי מבוסס האינטרנט uMelt HETS. ניתוח זה הראה כי השינוי מ-C-to-U צפוי להזיז את עקומת ההיתוך שמאלה לאורך ציר הטמפרטורה (איור 5B). ערכי PaSS שחושבו מניתוחי μTGGE של הלא-ערוכים ושלושת הקטעים הערוכים הוזמנו באופן הבא: עריכת RNA בסוף 5' < 3'-terminal end RNA edit < מרכז של 5' ו-3' קצוות מסוף עריכת RNA (איור 5C). יש לציין שערכי PaSS אלה עלו בקנה אחד עם התוצאות החזויות באמצעות uMelt. ממצאים אלה מצביעים על כך שהבדלי בסיס נוקלאוטידים הממוקמים בסוף 5' או 3' מסתיימים בשינויים גדולים יותר בין ערכי PaSS של גנים ערוכים ולא ערוכים מאשר הבדלי בסיס נוקלאוטידים הממוקמים באופן מרכזי יותר. בנוסף, תוצאות אלה מצביעות על כך שידע מוקדם על ההבדלים בין פרופילי ההיתוך של גנים ערוכים ולא ערוכים יכול לשמש כמדריך לאופטימיזציה של שברי גנים לעריכת RNA.
איור 1: ההליך המשמש לזיהוי עריכת RNA על ידי μTGGE. (A) סוגי אירועי עריכת הרנ"א שנבדקו. (B) המחשה סכמטית של פרופילי ההיתוך האופייניים של גנים ערוכים ולא ערוכים. ב- μTGGE, דגימה נודדת דרך ג'ל שיפוע טמפרטורה, ומייצרת עקמומיות אופיינית. נקודות התכונה של תבנית ההיתוך מוקצות ולאחר מכן מעובדות כדי לחשב ערך ציון דמיון תבנית (PaSS). חישוב PaSS מתבצע כפי שמוצג במשוואה, כאשר הווקטור P של כל נקודת תכונה נמצא במיקום המתאים לו ובפונקציה של טמפרטורה וניידות (כלומר, וקטור P = P (T, m)). הכתבים העיליים (1) ו-(2) מייצגים את הגנים הערוכים והלא-ערוכים, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: איורים ותצלומים של מכשיר האלקטרופורזה של ג'ל בגודל כף יד. (A) הרכבה של שלושת 1 בקלטות ג'ל. (B) איור של מחזיק קלטת הג'ל עם לוחית גרדיאנט הטמפרטורה. התצלום מציג את מיקומם של רפידות החיץ העליונות והתחתונות, כמו גם את אלה של הדגימה לאחר הטעינה הראשונית. (C) סקירה כללית של המערכת השלמה, כולל ספק הכוח, פלטפורמת אלקטרופורזה של ג'ל אופקי ומערכת הדמיית ג'ל. מערכת זו מספקת פתרון בר-קיימא לניתוחים מהירים מבוססי אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד באתר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: ניתוחי TGGE של שינויים נוקלאוטידים בודדים באירועי עריכת RNA. פרופילי התכה של שלושה סוגי עריכת RNA שונים נבדקו באמצעות ארבעה גנים. (A) עריכת RNA C-to-U ב-BFP המתבטאת בתאי HEK293T. (B) עריכת RNA A-to-I(G) ב-EGFP המתבטאת בתאי HEK293T. (C) עריכת RNA U-to-C בגן AT2G16586 מ-A. thaliana. (D) עריכת RNA U-to-C בגן AT5G02670 מ-A. thaliana. המיקומים של האתרים הערוכים מסומנים בצהוב (עם גופן אדום), ומיקומי הפריימר מסומנים בקו תחתון. ההבדלים בין דפוסי ההיתוך של הדגימות הערוכות והלא ערוכות מסומנים על ידי עיגולים אדומים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: ערכי ה-PaSS הממוצעים עבור ארבעת הגנים הערוכים שנבדקו כאן. פסי שגיאה מייצגים את סטיית התקן של שלושה משכפלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: ניתוח PaSS ספציפי למיקום. (A) אתר עריכת הרנ"א מסוג C-to-U בגן BFP המבוטא בתאי HEK293T הוזז לקצה 5'-terminal, הקצה 3' או המרכז של מקטע הגן. (B) ניבוי תיאורטי של דפוסי ההיתוך של הקטעים הלא ערוכים ושלושת הקטעים הערוכים המוצגים ב-(A). התחזיות בוצעו באמצעות uMelt. (C) ערכי ה-PaSSהממוצעים של הגנים הערוכים המוצגים ב-(A). פסי שגיאה מייצגים את סטיית התקן של שלושה משכפלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| S.No | עריכת רנ"א | מקור | מיקום | מזהה גן | פריימר קדמי | פריימר הפוך | אורך הרצף | ||
| 1 | C-to-U | תאי HEK293T | 48ה' | EGFP | AAGCTGACCC TGAAGTTCATC |
GCTGTTGTAGT TGTACTCCAGC |
324 | ||
| 2 | א-ל-י | תאי HEK293T | 59ה | EGFP | AGGGCGATGC CACCTACGGCA |
CCGTCCTCCT TTAAGTCGA |
300 | ||
| 3 | U-to-C | אראבידופסיס | 152ה | AT2G16586 | GGGCGATGTT ACGCTCGATGA |
GTGAAGAGTAA CATGGCGTT |
301 | ||
| 4 | U-to-C | אראבידופסיס | 169ה | AT5G02670 | CCAGTTGGCAG AATCCAGTCA |
CTAGCTTCCAC TGTTGAGATTC |
300 | ||
טבלה 1: רשימת הגנים המשמשים בפרוטוקול הנוכחי
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עריכת רנ"א ממלאת תפקיד חשוב בביולוגיה; עם זאת, השיטות הנוכחיות לאיתור עריכת RNA, כגון כרומטוגרפיה וריצוף, מציבות מספר אתגרים בשל עלותן הגבוהה, דרישות הזמן המופרזות ומורכבותן. הפרוטוקול המתואר כאן הוא שיטה פשוטה, מהירה וחסכונית לאיתור עריכת RNA המשתמשת במערכת ניידת, מיקרו-גדולה, מבוססת TGGE. ניתן להשתמש במערכת זו כדי להבדיל בין גנים ערוכים ולא ערוכים לפני ריצוף סנגר. באופן ספציפי, ניתן להבחין בין גנים ערוכים ולא ערוכים עם שינויים בנוקלאוטידים חד-בסיסיים על סמך שינויים בפרופילי ההיתוך של TGGE. מכיוון שהיא משלבת 1 בג'לים, המערכת דורשת כמויות קטנות מאוד של דגימות ומאפשרת זיהוי מהיר של הבדלים בין רצפים. בנוסף, קל מאוד לעקוב אחר הפרוטוקול המתואר כאן הן עבור מומחים והן עבור מצטרפים חדשים לתחום. אופטימיזציה של מקטע גן המטרה היא קריטית להבחנה ברורה בין אזורים ערוכים לאזורים שאינם ערוכים, ותהליך זה פשוט יותר בפרוטוקול הנוכחי.
פרוטוקול זה תואם לניתוחי מולטיפלקס באמצעות פריימרים המתויגים באופן פלואורסצנטי. עבור אנליזות כמותיות, ניתן לתייג דגימות RNA לא ידועות (ערוכות או לא ערוכות) עם פלואורסצנציה ירוקה ולהתאים אותן לתקן ייחוס אדום המתויג פלואורסצנטי (ערוך או לא ערוך) במהלך ניתוח TGGE.
בנוסף להדגמת היכולת של שיטת μTGGE לזהות אירועי עריכת RNA נוקלאוטידים בודדים, אימתנו גם את הדמיון בין התוצאה הניסיונית שהתקבלה באמצעות μTGGE לבין תוצאה תיאורטית שהתקבלה עבור אותו מקטע גן באמצעות uMELT. יתר על כן, מצאנו שהבדלי בסיסים של נוקלאוטידים הממוקמים ב-5' ו-3' של שברי גנים יוצרים הבדלים גדולים יותר בפרופילי ההיתוך של μTGGE (כלומר, ערכי PaSS קטנים יותר) מאשר אלה הממוקמים במרכז השברים. למרות שהוא מבטיח, הפרוטוקול הנוכחי עשוי להיות מוגבל לניתוח וזיהוי של סוגים ספציפיים של שינויים בנוקלאוטידים במהלך עריכת RNA. אופטימיזציה ופיתוח נוספים של פרוטוקול זה לניתוח סוגים ו/או מיקומים אחרים של עריכת RNA יבוצעו במחקר הקרוב שלנו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק סיוע למחקר מדעי מהחברה היפנית לקידום המדע (17H02204 ו- 18K19288). רוצ'יקה נתמכה כספית על ידי ממשלת יפן (מלגת MEXT). אנו מודים לגב' ראדהיקה ביאני (מעבדת טקאגי, JAIST) ולד"ר קירטי שארמה (תאגיד BioSeeds) על העזרה בניסויים הקשורים לאלקטרופורזה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2U ExoI | Takara | 2650A | Exonuclease I |
| 40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1) | Thermo fisher | AM9022 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Thermo Fisher | 17874 | |
| Centrifuge Mini spin | eppendorf | 5452000034 | |
| Digital dry bath/ block heater | Thermo fisher | NA | |
| Gold Taq Polymerase Master mixture | Promega | M7122 | |
| LATaq DNA polymerase | TAKARA | RR002A | Taq Polymerase |
| micro-TGGE cassette holder | BioSeeds Corp. | BS-GE-CH | |
| micro-TGGE apparatus | Lifetech Corp. | TG | |
| micro-TGGE gel cassette | BioSeeds Corp. | BS-TGGE-C | |
| NanoDrop 1000 | Thermo fisher | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Plant Rneasy Mini kit | Qiagen | 74904 | |
| ReverTra Ace Master Mix | TOYOBO | TRT101 | M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | Takara | 2660B | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Thermo fisher | S11494 | |
| TBE buffer | Thermo fisher | B52 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai tesque | 33401-72 | |
| Urea, Nuclease and protease tested | Nacalai tesque | 35940-65 |
References
- Chateigner-Boutin, A. L., Small, I. A rapid high-throughput method for the detection and quantification of RNA editing based on high-resolution melting of amplicons. Nucleic Acids Research. 35 (17), 114 (2007).
- Chen, Y. C., et al. A real-time PCR method for the quantitative analysis of RNA editing at specific sites. Analytical Biochemistry. 375 (1), 46-52 (2008).
- Barbon, A., Vallini, I., La Via, L., Marchina, E., Barlati, S. Glutamate receptor RNA editing: a molecular analysis of GluR2, GluR5 and GluR6 in human brain tissues and in NT2 cells following in vitro neural differentiation. Molecular Brain Research. 117 (2), 168-178 (2003).
- Gallo, A., Thomson, E., Brindle, J., O'Connell, M. A., Keegan, L. P. Micro-processing events in mRNAs identified by DHPLC analysis. Nucleic Acids Research. 30 (18), 3945-3953 (2002).
- Schiffer, H. H., Heinemann, S. F. A Quantitative method to detect RNA editing events. Analytical Biochemistry. 276 (2), 257-260 (1999).
- Burns, C. M., et al. Regulation of serotonin-2C receptor G-protein coupling by RNA editing. Nature. 387 (6630), 303-308 (1997).
- Marian, A. J.
- Bird, A. Genome biology: Not drowning but waving. Cell. 154 (5), 951-952 (2013).
- Jones, B. M., Knapp, L. A. Temporal temperature gradient electrophoresis for detection of single nucleotide polymorphisms. Methods in Molecular Biology. 578, Clifton, N.J. 153-165 (2009).
- Riesner, D., et al. Temperature-gradient gel electrophoresis of nucleic acids: analysis of conformational transitions, sequence variations, and protein-nucleic acid interactions. Electrophoresis. 10 (5-6), 377-389 (1989).
- Biyani, M., Nishigaki, K. Hundred-fold productivity of genome analysis by introduction of micro-temperature gradient gel electrophoresis. Electrophoresis. 22 (1), 23-28 (2001).
- Rathore, H., Biyani, R., Kato, H., Takamura, Y., Biyani, M. Palm-size and one-inch gel electrophoretic device for reliable and field-applicable analysis of recombinase polymerase amplification. Analytical Methods. 11 (39), 4969-4976 (2019).
- Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
- Bhakta, S., Sakari, M., Tsukahara, T. RNA editing of BFP, a point mutant of GFP, using artificial APOBEC1 deaminase to restore the genetic code. Scientific Reports. 10 (1), 17304 (2020).
- Azad, T. A., Qulsum, U., Tsukahara, T. Comparative activity of adenosine deaminase acting on RNA (ADARs) isoforms for correction of genetic code in gene therapy. Current Gene Therapy. 19 (1), 31-39 (2019).
- Ruchika, O. C., Sakari, M., Tsukahara, T. Genome-wide identification of U-To-C RNA editing events for nuclear genes in Arabidopsis thaliana. Cells. 10 (3), 635 (2021).
- Tsukahara, T. The U-to-C RNA editing affects the mRNA stability of nuclear genes in Arabidopsis thaliana. Biochemical and Biophysical Research Communications. 571, 110-117 (2021).
