Summary
RNA düzenleme olaylarının genomik ölçekte hızlı tespiti ve güvenilir bir şekilde ölçülmesi zorlu olmaya devam etmektedir ve şu anda doğrudan RNA dizileme yöntemlerine dayanmaktadır. Burada açıklanan protokol, RNA düzenlemesini tespit etmek için basit, hızlı ve taşınabilir bir yöntem olarak mikrosıcaklık gradyan jel elektroforezi (μTGGE) kullanır.
Abstract
RNA düzenleme, RNA'larda posttranskripsiyonel dizi değişikliklerine yol açan bir süreçtir. RNA düzenlemenin tespiti ve nicelleştirilmesi esas olarak Sanger dizileme ve RNA dizileme tekniklerine dayanır. Ancak, bu yöntemler maliyetli ve zaman alıcı olabilir. Bu protokolde, RNA düzenlemenin hızlı tespiti için sıralanmamış bir yaklaşım olarak taşınabilir bir mikrosıcaklık gradyan jel elektroforezi (μTGGE) sistemi kullanılmaktadır. Proses, bir poliakrilamid jel üzerinde hareket ederken nükleik asit numunelerini denatüre etmek için yüksek sıcaklıklar kullanan elektroforez prensibine dayanmaktadır. Bir dizi sıcaklık boyunca, bir DNA fragmanı, kısmen ayrılmış iplikçiklere ve daha sonra tamamen ayrılmış tek sarmallı DNA'ya tamamen çift sarmallı DNA'nın bir gradyanını oluşturur. Farklı nükleotid bazlarına sahip RNA tarafından düzenlenmiş bölgeler, μTGGE analizlerinde farklı erime profilleri üretir. Dört düzenlenmiş RNA fragmanının erime profilleri ile bunlara karşılık gelen düzenlenmemiş (vahşi tip) fragmanlar arasındaki farkları karakterize etmek için μTGGE tabanlı yaklaşımı kullandık. Örüntü Benzerlik Puanları (PaSS'ler), düzenlenmiş ve düzenlenmemiş RNA'lar tarafından üretilen bant desenleri karşılaştırılarak hesaplandı ve yöntemin tekrarlanabilirliğini değerlendirmek için kullanıldı. Genel olarak, burada açıklanan platform, RNA'lardaki tek baz mutasyonlarının bile basit, basit ve uygun maliyetli bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Bu analiz aracının yeni moleküler biyoloji bulgularına yardımcı olacağı öngörülmektedir.
Introduction
A-to-I, C-to-U ve U-to-C varyantları dahil olmak üzere genomik RNA'daki tek nükleotid varyantları (SNV'ler), RNA düzenleme olaylarını gösterebilir. Bununla birlikte, RNA'daki SNV'lerin tespiti teknik olarak zorlu bir görev olmaya devam etmektedir. Geleneksel olarak, düzenlenmiş RNA'nın düzenlenmemiş RNA'ya oranı, doğrudan dizileme, alele özgü gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) veya denatüre edici yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) yaklaşımları 1,2,3,4,5,6 ile belirlenir. Bununla birlikte, bu yaklaşımlar özellikle zaman veya maliyet açısından etkili değildir ve yüksek gürültü seviyelerinin neden olduğu düşük doğrulukları, RNA tabanlı SNV tespiti 7,8 için teknolojik darboğazlar oluşturmaktadır. Burada, RNA düzenleme analizlerine doğrudan RNA dizileme yaklaşımlarına olan ihtiyacı ortadan kaldıran alternatif bir yöntem olarak tek nükleotid polimorfizmlerini (SNP'ler) tanımlamak için sıcaklık gradyanı jel elektroforezine (TGGE) dayanan bir protokol tanımlamaktayız.
Elektroforez, yaşam bilimleri laboratuvarlarında biyomoleküllerin ayrılması ve analizi için tercih edilen bir yöntemdir. TGGE, aynı boyutta ancak farklı dizilere sahip çift sarmallı DNA parçalarının ayrılmasını sağlar. Teknik, DNA fragmanlarının erime sıcaklıklarındaki diziye bağlı farklılıklara ve doğrusal sıcaklık gradyanı 9,10 olan gözenekli jellerdeki hareketliliklerindeki müteakip değişikliklere dayanır. DNA fragmanlarının erimesi, spesifik erime profilleri oluşturur. En düşük erime sıcaklığına sahip alan, jeldeki belirli bir konumda karşılık gelen sıcaklığa ulaştığında, sarmal bir yapıdan kısmen erimiş bir yapıya geçiş gerçekleşir ve molekülün göçü pratik olarak durur. Bu nedenle, TGGE, DNA fragmanlarının (diziye bağlı bilgi) hem hareketliliğini (boyut bilgisi) hem de sıcaklık kaynaklı yapısal geçişlerini kullanır ve bu da onu DNA parçalarının karakterizasyonuna güçlü bir yaklaşım haline getirir. DNA molekülünün üç yapısal geçişine karşılık gelen TGGE erime modelindeki özellik noktaları, iplik başlangıç-ayrışma noktası, iplik orta-ayrışma noktası ve iplik sonu ayrışma noktasıdır (Şekil 1). Etki alanları içindeki dizi değişimleri, hatta tek baz farklılıkları bile, erime sıcaklığını etkiler, bu nedenle, farklı dizilere sahip moleküller, TGGE analizlerinde ayrık erime (denatürasyon) kalıpları gösterecektir. Bu nedenle, TGGE, genomik RNA'daki SNV'leri analiz etmek için kullanılabilir ve RNA düzenlemesini tespit etmek için paha biçilmez bir yüksek verimli yöntem olabilir. Bu yüksek verimli kazanç, geleneksel jel elektroforez bazlı TGGE kullanıldığında kaybolur. Bununla birlikte, TGGE'nin microTGGE (μTGGE) adı verilen minyatür bir versiyonu, jel elektroforetik süresini kısaltmak ve verimlilikte 100 kat artışla analizi hızlandırmak için kullanılabilir11. μTGGE yönteminin basitliği ve kompaktlığı, sahaya uygun, elde taşınabilen ve uygun fiyatlı bir jel elektroforez sistemi olan PalmPAGE12'nin piyasaya sürülmesiyle geliştirilmiştir.
Burada, ikisi Arabidopsis thaliana dokularından ve ikisi memeli HEK293 hücrelerinde eksprese edilen dört gende üç tip RNA düzenleme bölgesini (A-to-I, C-to-U ve U-to-C) incelemek için yeni bir TGGE tabanlı protokol kullanılmaktadır (Şekil 1A). Protokol, RNA düzenlemenin hızlı tespiti için taşınabilir bir sistem olan PalmPAGE (donanım) ve uMelt (yazılım)13 kullanımını entegre eder. Ortalama 15-30 dakikalık çalışma süresine sahip olan bu protokol, doğrudan RNA dizileme yaklaşımlarına gerek kalmadan RNA düzenlemenin hızlı, güvenilir ve kolay bir şekilde tanımlanmasını sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hedef parçanın optimizasyonu
NOT: Bu protokolün geliştirilmesinde, A. thaliana'dan iki nükleer gen (AT2G16586 ve AT5G02670) ve HEK293 hücrelerinde eksprese edilen mavi floresan proteini (BFP) ve gelişmiş yeşil floresan proteini (EGFP) kodlayan genler dahil olmak üzere dört düzenlenmiş gen kullanılmıştır.
- Düzenlenmiş ve düzenlenmemiş bölgeleri temsil eden farklı erime profillerine sahip gen parçalarını tanımlamak için, orijinal uMelt yazılımı13'ün bir uzantısı olan uMelt HETS web tabanlı aracını kullanarak tahmini erime eğrileri oluşturun.
NOT: Bu araç, heteroduplex ve homoduplex ürünler için erime eğrilerinin şekillerini tahmin eder. - Her hedef gen için, üç çift gen parçası tasarlayın (300-324 bp uzunluğunda). Her çift, düzenlenmiş bir siteye sahip bir parçadan ve 5' terminal ucunda, orta konumda veya 3' terminal ucunda bulunan, düzenlenmemiş bir siteye sahip karşılık gelen vahşi tip bir parçadan oluşur.
- Daha fazla analiz için helisite eksenindeki erime bölgeleri arasındaki maksimum farkı gösteren düzenlenmemiş/düzenlenmiş çifti seçin. μTGGE analizi için, seçilen gen fragmanını aşağıdaki bölüm 2'de açıklandığı gibi PCR amplifikasyonu ile sentezleyin.
- DNADynamo yazılımını (https://www.bluetractorsoftware.com/DynamoDemo.htm) kullanarak ileri ve geri primerleri tasarlayın ve NCBI Primer-BLAST aracını kullanarak doğrulayın.
- Astarları TE tamponunda seyreltin (1 mM EDTA· içeren 10 mM Tris-HCl Na2) ve bunları 100 pmol / μL'lik bir konsantrasyonda saklayın. Kullanmadan önce, damıtılmış su kullanarak 10 pmol / μL'lik bir konsantrasyona ayarlanmış her astarı seyreltin.
2. RNA ekstraksiyonu ve hedef parçanın RT-PCR amplifikasyonu
- RNA ekstraksiyonu
- TRIzol ekstraksiyonu 14 veya ticari olarak temin edilebilen kitler gibi standart yöntemleri kullanarak düzenlenmiş ve düzenlenmemiş genlerin kaynağından toplamRNA'yı çıkarın.
- Adım 2.2'de açıklandığı gibi standart bir RT-PCR protokolü kullanarak karşılık gelen cDNA'nın sentezini gerçekleştirin.
- Ters transkripsiyon
- Nükleaz içermeyen bir mikrosantrifüj tüpüne 1 μL oligo (dT) primer, 1 μL 10 mM dNTP karışımı, 10 μL toplam RNA ve 10 μL steril damıtılmış su ekleyin.
- Karışımı 65 ° C'de 5 dakika ısıtın ve ardından en az 1 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
- Tüpün içeriğini 2-3 s için maksimum hızda (12.000 x g) santrifüjleme ile toplayın ve 4 μL 5x ReverTra Ace tamponu, 1 μL 0.1 M DTT ve 1 μL M-MLV (Moloney Murine Lösemi Virüsü) ters transkriptaz (200 U / μL, Malzeme Tablosu) ekleyin.
- Yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek, karıştırın. Rastgele astarlar kullanıyorsanız, tüpü 5 dakika boyunca 25 ° C'de inkübe edin.
- Tüpü 60 dakika boyunca 55 °C'de inkübe edin ve ardından dijital kuru banyo/blok ısıtıcıda 15 dakika boyunca 70 °C'de ısıtarak reaksiyonu etkisiz hale getirin.
- Bir spektrofotometre kullanarak cDNA konsantrasyonunu ölçün ve -25 ° C'de saklayın.
-
PCR amplifikasyonu ve ürünlerin doğrulayıcı dizilimi
- Aşağıdaki reaktifleri nükleaz içermeyen bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin: 4 μL 5x Taq Polimeraz Tamponu, 2 μL 2 mM dNTP karışımı, 2 μL 25 mM MgCl 2, primer setinin 1.6 μL (ileri ve geri; her biri 10 mM), 2 μL cDNA şablonu, 0.1 μL Taq polimeraz (2.5 U / μL) ve 8.3 μL steril damıtılmış su (son hacim, 20 μL).
- Aşağıdaki döngü koşullarıyla PCR yapın: 2 dakika boyunca 95 ° C'de ilk denatürasyon; 2 dakika boyunca 95 °C'de 35 döngü denatürasyon, 30 s için uygun bir sıcaklıkta tavlama (kullanılan spesifik astar setine bağlı olarak) ve 2 dakika boyunca 72 °C'de uzatma; ve daha sonra 7 dakika boyunca 72 ° C'de son bir uzatma.
- PCR ürünlerini saflaştırmak için, 2 U Ekzonükleaz I ve 0.5 U karides alkali fosfataz (ExoSAP) ekleyin. Tüpü 1 saat boyunca 37 ° C'de bir termal döngücüde, ardından 15 dakika boyunca 80 ° C'de inkübe edin ve ardından bir sonraki adıma kadar 4 ° C'de tutun.
- Doğrulayıcı dizileme için, yeni bir mikrosantrifüj tüpüne 11,5 μL steril damıtılmış su, 2,5 μL ileri veya geri astar ve 1 μL PCR ürünü (ExoSAP ile) ekleyin.
NOT: Dizileme analizi için DNA dizileme hizmetlerini (örneğin, Eurofins Genomics) kullanın. - PCR ürünlerinin özgüllüğünü doğrulamak için, hem ileri hem de geri astarlarla sıralama yapın. Temsili analizde kullanılan astar çiftleri Tablo 1'de verilmiştir.
- Saflaştırılmış PCR ürünlerini deiyonize su ile 200 ng / μL konsantrasyona kadar seyreltin. Daha sonra, arıtılmış ürünün 6 μL'sini 250 μL'lik bir tüpte 3 μL 6x jel yükleme boyası ile karıştırın ve toplam hacmi steril suyla 12 μL'ye yükseltin. PCR ürününü (-25 °C'de) aşağıda açıklandığı gibi μTGGE ile devam etmeye hazır olana kadar saklayın.
3. μTGGE analizi
NOT: μTGGE analizi, minyatür ve ekonomik bir sistem kullanılarak gerçekleştirilir. Jel kasetler, jel kaset tutucu, yatay jel elektroforez platformu, güç kaynağı ve jel görüntüleme sistemi dahil olmak üzere tüm sisteme genel bir bakış Şekil 2'de gösterilmiştir.
- Jel kasetlerin montajı
- μTGGE analizi için kullanılan jel kaset Şekil 2A'da gösterilmiştir. Tasarım üç adet 1 inçlik jel plakadan oluşur: bir alt jel plaka, bir üst jel plaka ve bir şerit eski plaka. Üst jel plakayı diğer iki plaka arasında sandviç yapın ve jel polimerizasyonu için jel kaset tutucuya monte edin.
- Poliakrilamid jel preparatı
- 50 mL'lik bir tüpe 7.2 g üre ekleyin ve 10 mL steril suda çözün. Numuneyi bir mikrodalgada 20-30 s ısıtın ve ardından oda sıcaklığına (RT) getirin.
- Çözeltiye 3 mL 5x Tris/borat/EDTA (TBE) tamponu (Malzeme Tablosu), 2,25 mL %40 (w/v) akrilamid/bis (19:1), 75 μL 10x amonyum persülfat ve 15 μL tetrametilenidiamin ekleyin.
- Jel çözeltisini derhal jel kaset tutucuya yavaşça dökün ve hava kabarcıkları oluşumunu önleyin.
- μTGGE ünitesi kullanılarak eritme profillerinin oluşturulması
- Şekil 2'de gösterilen μTGGE cihazının minyatürleştirilmiş, ekonomik versiyonunu, DNA migrasyon yönüne dik olarak ayarlanmış bir sıcaklık gradyanı (25-65 °C) ile kullanın.
- Üst ve alt elektroforez tampon pedlerini (0,5 cm x 2,5 cm) 2 mL 1x TBE tamponunda ıslatın.
- Jel kaseti yatay elektroforez haznesi ünitesine yerleştirin ve üst ve alt tampon pedlerini Şekil 2'de gösterildiği gibi buna göre konumlandırın.
- Daha sonra, PCR ürününün 10 μL'sini orta (daha uzun) kuyuya ve PCR ürününün 1 μL'sini her iki taraftaki kuyuya yükleyin.
- 1 dakika bekledikten sonra, güç ünitesini bağlayın ve 25-65 ° C arasındaki doğrusal bir sıcaklık gradyanında 12 dakika boyunca 100 V besleme yapın.
- Çalıştırma tamamlandıktan sonra kaseti çıkarın ve üst cam kapağı çıkarın.
- Jel üzerine 300 μL 10x SYBR Gold lekesi dökün. Avuç içi boyutundaki elektroforetik cihaza takılı mavi LED el fenerini kullanarak eriyen profilleri görselleştirin.
NOT: Jel görüntüsünün yumuşak bir dosyası, Desen Benzerlik Puanı (PaSS) hesaplaması için kaydedilmelidir. - Verilerin tekrarlanabilirliğini doğrulamak için her elektroforetik deneyi 3 kat tekrarlayın.
4. PaSS hesaplamaları
NOT: Hesaplamalar μTGGE Analyzer yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir.
- Yazılımı indirin ve açın.
- Jel görüntüsünü içeren JPEG dosyasını açın. Yazılımın yalnızca JPEG formatındaki dosyaları kabul edeceğini unutmayın.
- Çerçeve düğmesine tıklayın ve jel görüntüsünün uygun alanını (çerçeve) seçin.
- Koordinat Düzeltme düğmesine tıklayın ve Şekil 1B'de gösterildiği gibi iki referans noktası ekleyin.
- Özellik Noktalarının Eklenmesi düğmesine tıklayın ve Şekil 1B'de gösterildiği gibi örnek noktalar ekleyin. Ardından işlenen jel görüntü verilerini μTGGE (*.tgg) formatında kaydedin.
- Örnek düğmesine tıklayın ve iki veya daha fazla görüntüyü karşılaştırmak için Basit Noktaları Ara seçeneğini belirleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
RNA düzenleme olaylarındaki tek nükleotid baz değişikliklerini tanımlamak için μTGGE kullanımı
Bu protokol için HEK293 hücrelerinde üretilen BFP geni de dahil olmak üzere dört düzenlenmiş gen kullanılmıştır (apolipoprotein B mRNA düzenleme enzim kompleksinin deaminaz enzimleri tarafından C-to-U RNA düzenlemesi ile; APOBEC115), HEK293 hücrelerinde üretilen aşı boyası durdurma kodonu (TAA) içeren EGFP geni (RNA 1 üzerinde etkili adenozin deaminaz ile A-to-I RNA düzenlemesi ile; ADAR116) ve AT2G16586 ve AT5G02670 nükleer genleri A. thaliana17,18'de (U-to-C RNA düzenlemesi ile). Düzenlenmiş ve karşılık gelen düzenlenmemiş örnekler arasındaki tek nükleotid farklılıkları DNA dizilimi ile doğrulandı. Daha sonra numunelerin erime eğrileri arasındaki farkları incelemek için bir μTGGE analizi yapıldı (Şekil 3).
C-to-U RNA düzenleme tipi için, orijinal C bazına sahip düzenlenmemiş numune, iplik ucu erime noktasında, modifiye edilmiş U bazına sahip düzenlenmiş numuneden daha uzun bir erime paterni göstermiştir (Şekil 3A). A-to-I(G) RNA düzenleme türü için, değiştirilmiş I(G) tabanına sahip düzenlenmiş numune, iplik ucu erime noktasında, orijinal A tabanına sahip düzenlenmemiş numuneden daha uzun bir erime paterni göstermiştir (Şekil 3B). "Tersi" U-to-C RNA düzenleme tipi için iki gen analiz edildi. AT2G16586 geni için, modifiye C tabanına sahip düzenlenmiş numune, orijinal U bazına sahip düzenlenmemiş numuneye göre iplik ilk erime ve iplik sonu erime noktaları arasında daha uzun bir erime paterni göstermiştir (Şekil 3C). Bununla birlikte, diğer AT5G02670 geni için benzer bir model gözlenmemiştir (Şekil 3D). Bununla birlikte, son erime noktasında düzenlenmemiş ve düzenlenmiş türler arasında belirgin bir fark vardı. Bu, erime profillerini açıkça gözlemlemenin, düzenlenmemiş ve düzenlenmiş türler arasında ayrım yapmada önemli bir adım olduğunu göstermektedir.
RNA düzenleme olaylarını temsil eden μTGGE erime modellerinin kantitatif analizi
Daha sonra, yukarıda açıklanan dört RNA düzenleme olayını temsil eden μTGGE tabanlı erime profillerinin tekrarlanabilirliğini değerlendirmek için PaSS değerleri11'i hesapladık. PaSS değeri, iki erime modelinin ne kadar yakından üst üste bindirilebileceğinin bir ölçüsünü sağlar ve oldukça benzer erime desenleri için daha yüksek bir değer (maksimum: 1) üretir. Bu nedenle, düzenlenmemiş ve düzenlenmiş örneklerin karşılaştırılması için PaSS değerlerinin birden az olması beklenir. Şekil 1B'de gösterildiği gibi, PaSS değerlerini hesaplamak için çift sarmallı DNA'dan tek sarmallı DNA'ya yapısal geçişlere karşılık gelen erime modellerinin özellik noktaları kullanılmıştır. Deneysel değişkenleri ortadan kaldırmak için, bilgisayar destekli normalleştirme iki dahili referans noktası kullanılarak gerçekleştirildi: numunenin konumunu çift sarmallı formda (en soldaki şerit) temsil eden referans noktası #1 ve numunenin konumunu tek sarmallı formda (en sağ şerit) temsil eden referans noktası #2. Unsur noktalarının koordinatları dahili referans noktalarınınkine normalleştirildi ve daha sonra PaSS değerlerini hesaplamak için kullanıldı. Her deney üç kez tekrarlandı ve ortalama değer belirlendi. Beklendiği gibi, düzenlenen dört örneğin PaSS değerleri birden düşüktü (Şekil 4). C-to-you ve A-to-I RNA düzenleme tiplerinin PaSS değerleri, iki U-to-C RNA düzenleme tipininkinden daha düşüktü. Bu fark büyük olasılıkla düzenleme sitelerinin ilgili konumlarıyla ilgilidir. Spesifik olarak, C-to-you ve A-to-I düzenlenmiş siteler 5'-terminal uçlarına nispeten yakın bir yerde bulunuyordu (sırasıyla ~ 300 bp parçalarının 48 ve 59 konumlarında), U-to-C düzenlenmiş siteler ise parçaların ortasına yakın bir yerde bulunuyordu (152 ve 169 konumlarında). Bu bulgular, terminal konumlarında bulunan düzenlenmiş bölgelerin, μTGGE kullanılarak parçaların merkezine doğru yerleştirilenlerden daha kolay tespit edilebileceğini göstermektedir.
RNA düzenleme olaylarını tanımlamak için TGGE eritme modellerinin optimizasyonu
Önceki sonuçlarımız, PaSS değerinin RNA düzenleme bölgesinin spesifik konumuna bağlı olarak değişebileceğini öne sürdüğü için, BFP geninin 300 bp'lik bir parçasının (HEK293T hücrelerinde ifade edilen) erime kalıpları arasındaki farkları inceledik; burada C-to-U düzenlenmiş bir bölge 5'-terminal ucuna yakın, 3'-terminal ucuna yakın, veya parçanın merkezinde (Şekil 5A). μTGGE analizinden önce, düzenlenmemiş parçanın ve üç düzenlenmiş parçanın erime kalıpları, uMelt HETS web tabanlı aracı kullanılarak tahmin edildi. Bu analiz, C-to-U modifikasyonunun erime eğrisini sıcaklık ekseni boyunca sola kaydırmasının bekleneceğini göstermiştir (Şekil 5B). Düzenlenmemiş ve üç düzenlenmiş parçanın μTGGE analizlerinden hesaplanan PaSS değerleri aşağıdaki gibi sıralanmıştır: 5'-terminal uç RNA düzenleme < 3'-terminal uç RNA düzenleme 5' ve 3' terminal uçları RNA düzenleme merkezi < (Şekil 5C). Özellikle, bu PaSS değerleri uMelt kullanılarak tahmin edilen sonuçlarla tutarlıydı. Bu bulgular, 5' veya 3' terminalinde bulunan nükleotid baz farklılıklarının, düzenlenmiş ve düzenlenmemiş genlerin PaSS değerleri arasında, daha merkezi olarak bulunan nükleotid baz farklılıklarından daha büyük varyasyonlara neden olduğunu göstermektedir. Ek olarak, bu sonuçlar, düzenlenmiş ve düzenlenmemiş genlerin erime profilleri arasındaki farkların önceden bilinmesinin, RNA düzenlemesi için gen parçalarını optimize etmek için bir rehber olarak kullanılabileceğini göstermektedir.
Şekil 1: μTGGE tarafından RNA düzenlemesini tanımlamak için kullanılan prosedür . (A) İncelenen RNA düzenleme olaylarının türleri. (B) Düzenlenmiş ve düzenlenmemiş genlerin tipik erime profillerinin şematik bir gösterimi. μTGGE'de, bir numune bir sıcaklık gradyanı jelinden geçerek karakteristik bir eğrilik oluşturur. Erime deseninin unsur noktaları atanır ve ardından bir Desen Benzerlik Puanı (PaSS) değeri hesaplamak için işlenir. PaSS hesaplaması, her bir özellik noktasının P vektörünün karşılık gelen konumunda ve sıcaklık ve hareketlilik fonksiyonunda (yani, vektör P = P (T, m)) olduğu denklemde gösterildiği gibi gerçekleştirilir. Üst simgeler (1) ve (2) sırasıyla düzenlenmiş ve düzenlenmemiş genleri temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Avuç içi büyüklüğünde jel elektroforez cihazının çizimleri ve fotoğrafları. (A) Üç 1'in jel kasetlerde montajı. (B) Jel kaset tutucunun sıcaklık gradyan plakası ile birlikte gösterilmesi. Fotoğraf, üst ve alt tampon pedlerinin konumlarını ve ilk yüklemeden sonra numunenin konumlarını göstermektedir. (C) Güç kaynağı, yatay jel elektroforez platformu ve jel görüntüleme sistemi dahil olmak üzere tüm sisteme genel bakış. Bu sistem, hızlı, yerinde poliakrilamid jel elektroforez bazlı analizler için uygun bir çözüm sunar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: RNA düzenleme olaylarındaki tek nükleotid değişikliklerinin TGGE analizleri. Üç farklı RNA düzenleme tipi için erime profilleri dört gen kullanılarak incelendi. (A) HEK293T hücrelerinde eksprese edilen BFP'de C-to-U RNA düzenlemesi. (B) HEK293T hücrelerinde eksprese edilen EGFP'de A-to-I(G) RNA düzenlemesi. (C) A. thaliana'dan AT2G16586 geninde U-to-C RNA düzenlemesi. (D) A. THALIANA'dan AT5G02670 geninde U-to-C RNA düzenlemesi. Düzenlenen sitelerin konumları sarı renkle (kırmızı yazı tipiyle) vurgulanır ve astar konumlarının altı çizilir. Düzenlenmiş ve düzenlenmemiş örneklerin erime desenleri arasındaki farklar kırmızı dairelerle gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Burada incelenen dört düzenlenmiş gen için ortalama PaSS değerleri. Hata çubukları, üç çoğaltmanın standart sapmasını temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Pozisyona özgü PaSS analizi. (A) HEK293T hücrelerinde eksprese edilen BFP genindeki C-to-U tipi RNA düzenleme bölgesi, gen fragmanının 5'-terminal ucuna, 3'-terminal ucuna veya merkezine kaydırıldı. (B) (A)'da gösterilen düzenlenmemiş ve üç düzenlenmiş parçanın erime modellerinin teorik tahmini. Tahminler uMelt kullanılarak gerçekleştirildi. (C) (A)'da gösterilen düzenlenmiş genlerin ortalama PaSS değerleri. Hata çubukları, üç çoğaltmanın standart sapmasını temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| S.No | RNA düzenleme | Kaynak | Konum | Gen Kimliği | İleri Astar | Ters Astar | Dizi uzunluğu | ||
| 1 | C-to-U | HEK293T hücreleri | 48. | EGFP | AAGCTGACCC TGAAGTTCATC |
GCTGTTGTAGT TGTACTCCAGC |
324 | ||
| 2 | A-to-I | HEK293T hücreleri | 59. | EGFP | AGGGCGATGC CACCTACGGCA |
CCGTCCTCCT TTAAGTCGA |
300 | ||
| 3 | U-to-C | Arabidopsis | 152inci | AT2G16586 göster | GGGCGATGTT ACGCTCGATGA |
GTGAAGAGTAA CATGGCGTT |
301 | ||
| 4 | U-to-C | Arabidopsis | 169inci | AT5G02670 | CCAGTTGGCAG AATCCAGTCA |
CTAGCTTCCAC TGTTGAGATTC |
300 | ||
Tablo 1: Mevcut protokolde kullanılan genlerin listesi
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RNA düzenleme biyolojide önemli bir rol oynar; Bununla birlikte, kromatografi ve dizileme gibi RNA düzenlemesini tespit etmenin mevcut yöntemleri, yüksek maliyetleri, aşırı zaman gereksinimleri ve karmaşıklıkları nedeniyle çeşitli zorluklar ortaya koymaktadır. Burada açıklanan protokol, taşınabilir, mikrosifik, TGGE tabanlı bir sistem kullanan RNA düzenlemesini tespit etmek için basit, hızlı ve uygun maliyetli bir yöntemdir. Bu sistem, Sanger diziliminden önce düzenlenmiş ve düzenlenmemiş genleri ayırt etmek için kullanılabilir. Spesifik olarak, tek bazlı nükleotid modifikasyonlarına sahip düzenlenmiş ve düzenlenmemiş genler, TGGE erime profillerindeki değişikliklere dayanarak ayırt edilebilir. Jellerde 1 içerdiğinden, sistem çok az miktarda numune gerektirir ve diziler arasındaki farkların hızlı bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Ek olarak, burada açıklanan protokolün hem uzmanlar hem de alana yeni gelenler için takip edilmesi çok kolaydır. Hedef gen parçasının optimizasyonu, düzenlenmiş ve düzenlenmemiş bölgeler arasında net bir ayrım için kritik öneme sahiptir ve bu işlem mevcut protokolde basitleştirilmiştir.
Bu protokol, floresan etiketli astarlar kullanılarak yapılan multipleks analizlerle uyumludur. Kantitatif analizler için, bilinmeyen RNA örnekleri (düzenlenmiş veya düzenlenmemiş) yeşil floresan ile etiketlenebilir ve TGGE analizi sırasında kırmızı floresan etiketli bir referans standardı (düzenlenmiş veya düzenlenmemiş) ile birleştirilebilir.
μTGGE yönteminin tek nükleotid RNA düzenleme olaylarını tespit etme yeteneğini göstermenin yanı sıra, μTGGE kullanılarak elde edilen deneysel sonuç ile uMELT kullanılarak aynı gen parçası için elde edilen teorik bir sonuç arasındaki benzerliği de doğruladık. Ayrıca, gen fragmanlarının 5'- ve 3'-terminallerinde bulunan nükleotid baz farklılıklarının, μTGGE erime profillerinde (yani, daha küçük PaSS değerleri), fragmanların merkezine doğru bulunanlardan daha büyük farklılıklar ürettiğini bulduk. Umut verici olmasına rağmen, mevcut protokol, RNA düzenlemesi sırasında spesifik nükleotid modifikasyonlarının analizi ve tespiti ile sınırlı olabilir. RNA düzenlemenin diğer türlerini ve / veya yerlerini analiz etmek için bu protokolün daha fazla optimizasyonu ve geliştirilmesi, yaklaşmakta olan araştırmamızda gerçekleştirilecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Japonya Bilimi Geliştirme Derneği'nden (17H02204 ve 18K19288) Bilimsel Araştırma için Hibe-in-Aid tarafından desteklenmiştir. Ruchika, Japon hükümeti tarafından finansal olarak desteklendi (MEXT bursu). Bayan Radhika Biyani'ye (Takagi Laboratuvarı, JAIST) ve Dr. Kirti Sharma'ya (BioSeeds Corporation) elektroforezle ilgili deneylerdeki yardımları için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2U ExoI | Takara | 2650A | Exonuclease I |
| 40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1) | Thermo fisher | AM9022 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Thermo Fisher | 17874 | |
| Centrifuge Mini spin | eppendorf | 5452000034 | |
| Digital dry bath/ block heater | Thermo fisher | NA | |
| Gold Taq Polymerase Master mixture | Promega | M7122 | |
| LATaq DNA polymerase | TAKARA | RR002A | Taq Polymerase |
| micro-TGGE cassette holder | BioSeeds Corp. | BS-GE-CH | |
| micro-TGGE apparatus | Lifetech Corp. | TG | |
| micro-TGGE gel cassette | BioSeeds Corp. | BS-TGGE-C | |
| NanoDrop 1000 | Thermo fisher | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Plant Rneasy Mini kit | Qiagen | 74904 | |
| ReverTra Ace Master Mix | TOYOBO | TRT101 | M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | Takara | 2660B | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Thermo fisher | S11494 | |
| TBE buffer | Thermo fisher | B52 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai tesque | 33401-72 | |
| Urea, Nuclease and protease tested | Nacalai tesque | 35940-65 |
References
- Chateigner-Boutin, A. L., Small, I. A rapid high-throughput method for the detection and quantification of RNA editing based on high-resolution melting of amplicons. Nucleic Acids Research. 35 (17), 114 (2007).
- Chen, Y. C., et al. A real-time PCR method for the quantitative analysis of RNA editing at specific sites. Analytical Biochemistry. 375 (1), 46-52 (2008).
- Barbon, A., Vallini, I., La Via, L., Marchina, E., Barlati, S. Glutamate receptor RNA editing: a molecular analysis of GluR2, GluR5 and GluR6 in human brain tissues and in NT2 cells following in vitro neural differentiation. Molecular Brain Research. 117 (2), 168-178 (2003).
- Gallo, A., Thomson, E., Brindle, J., O'Connell, M. A., Keegan, L. P. Micro-processing events in mRNAs identified by DHPLC analysis. Nucleic Acids Research. 30 (18), 3945-3953 (2002).
- Schiffer, H. H., Heinemann, S. F. A Quantitative method to detect RNA editing events. Analytical Biochemistry. 276 (2), 257-260 (1999).
- Burns, C. M., et al. Regulation of serotonin-2C receptor G-protein coupling by RNA editing. Nature. 387 (6630), 303-308 (1997).
- Marian, A. J.
- Bird, A. Genome biology: Not drowning but waving. Cell. 154 (5), 951-952 (2013).
- Jones, B. M., Knapp, L. A. Temporal temperature gradient electrophoresis for detection of single nucleotide polymorphisms. Methods in Molecular Biology. 578, Clifton, N.J. 153-165 (2009).
- Riesner, D., et al. Temperature-gradient gel electrophoresis of nucleic acids: analysis of conformational transitions, sequence variations, and protein-nucleic acid interactions. Electrophoresis. 10 (5-6), 377-389 (1989).
- Biyani, M., Nishigaki, K. Hundred-fold productivity of genome analysis by introduction of micro-temperature gradient gel electrophoresis. Electrophoresis. 22 (1), 23-28 (2001).
- Rathore, H., Biyani, R., Kato, H., Takamura, Y., Biyani, M. Palm-size and one-inch gel electrophoretic device for reliable and field-applicable analysis of recombinase polymerase amplification. Analytical Methods. 11 (39), 4969-4976 (2019).
- Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
- Bhakta, S., Sakari, M., Tsukahara, T. RNA editing of BFP, a point mutant of GFP, using artificial APOBEC1 deaminase to restore the genetic code. Scientific Reports. 10 (1), 17304 (2020).
- Azad, T. A., Qulsum, U., Tsukahara, T. Comparative activity of adenosine deaminase acting on RNA (ADARs) isoforms for correction of genetic code in gene therapy. Current Gene Therapy. 19 (1), 31-39 (2019).
- Ruchika, O. C., Sakari, M., Tsukahara, T. Genome-wide identification of U-To-C RNA editing events for nuclear genes in Arabidopsis thaliana. Cells. 10 (3), 635 (2021).
- Tsukahara, T. The U-to-C RNA editing affects the mRNA stability of nuclear genes in Arabidopsis thaliana. Biochemical and Biophysical Research Communications. 571, 110-117 (2021).
