Summary
Der schnelle Nachweis und die zuverlässige Quantifizierung von RNA-Editing-Ereignissen auf genomischer Ebene bleiben eine Herausforderung und basieren derzeit auf direkten RNA-Sequenzierungsmethoden. Das hier beschriebene Protokoll verwendet die Mikrotemperaturgradientengelelektrophorese (μTGGE) als einfache, schnelle und tragbare Methode zum Nachweis der RNA-Bearbeitung.
Abstract
RNA-Editing ist ein Prozess, der zu posttranskriptionellen Sequenzveränderungen in RNAs führt. Der Nachweis und die Quantifizierung der RNA-Editierung beruhen hauptsächlich auf Sanger-Sequenzierungs- und RNA-Sequenzierungstechniken. Diese Methoden können jedoch kostspielig und zeitaufwendig sein. In diesem Protokoll wird ein tragbares Mikrotemperatur-Gradienten-Gelelektrophorese-System (μTGGE) als Nicht-Sequenzierungsansatz für den schnellen Nachweis der RNA-Editierung verwendet. Das Verfahren basiert auf dem Prinzip der Elektrophorese, bei der bei hohen Temperaturen Nukleinsäureproben denaturiert werden, während sie sich über ein Polyacrylamidgel bewegen. Über einen Temperaturbereich hinweg bildet ein DNA-Fragment einen Gradienten von vollständig doppelsträngiger DNA zu teilweise getrennten Strängen und dann zu vollständig getrennter einzelsträngiger DNA. RNA-editierte Stellen mit unterschiedlichen Nukleotidbasen erzeugen unterschiedliche Schmelzprofile in μTGGE-Analysen. Wir verwendeten den μTGGE-basierten Ansatz, um die Unterschiede zwischen den Schmelzprofilen von vier editierten RNA-Fragmenten und ihren entsprechenden nicht editierten (Wildtyp-) Fragmenten zu charakterisieren. Pattern Similarity Scores (PaSSs) wurden durch den Vergleich der von den editierten und nicht editierten RNAs erzeugten Bandmuster berechnet und zur Beurteilung der Reproduzierbarkeit der Methode verwendet. Insgesamt ermöglicht die hier beschriebene Plattform den unkomplizierten, einfachen und kostengünstigen Nachweis auch einzelner Basenmutationen in RNAs. Es wird erwartet, dass dieses Analysewerkzeug neue molekularbiologische Erkenntnisse unterstützen wird.
Introduction
Einzelne Nukleotidvarianten (SNVs) in genomischer RNA, einschließlich A-zu-I-, C-zu-U- und U-zu-C-Varianten, können auf RNA-Editierereignisse hinweisen. Der Nachweis von SNVs in RNA bleibt jedoch eine technisch anspruchsvolle Aufgabe. Herkömmlicherweise wird das Verhältnis von editierter zu nicht editierter RNA durch direkte Sequenzierung, allelspezifische Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder denaturierende Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) bestimmt, diesich 1,2,3,4,5,6 nähert. Diese Ansätze sind jedoch nicht besonders zeit- oder kosteneffizient, und ihre geringen Genauigkeiten, die durch hohe Geräuschpegel verursacht werden, stellen technologische Engpässe für den RNA-basierten SNV-Nachweis dar 7,8. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das auf der Temperaturgradientengelelektrophorese (TGGE) basiert, um einzelne Nukleotidpolymorphismen (SNPs) als alternative Methode zu identifizieren, die die Notwendigkeit direkter RNA-Sequenzierungsansätze für RNA-Editing-Analysen eliminiert.
Die Elektrophorese ist eine bevorzugte Methode zur Trennung und Analyse von Biomolekülen in Life-Science-Labors. TGGE ermöglicht die Trennung von doppelsträngigen DNA-Fragmenten, die gleich groß sind, aber unterschiedliche Sequenzen haben. Die Technik beruht auf sequenzbezogenen Unterschieden in den Schmelztemperaturen von DNA-Fragmenten und nachfolgenden Veränderungen ihrer Beweglichkeiten in porösen Gelen mit einem linearen Temperaturgradienten 9,10. Durch das Schmelzen von DNA-Fragmenten entstehen spezifische Schmelzprofile. Sobald die Domäne mit der niedrigsten Schmelztemperatur die entsprechende Temperatur an einer bestimmten Position im Gel erreicht, erfolgt der Übergang von einer helikalen Struktur zu einer teilweise geschmolzenen Struktur, und die Migration des Moleküls wird praktisch gestoppt. Daher nutzt TGGE sowohl Mobilität (Größeninformation) als auch temperaturinduzierte strukturelle Übergänge von DNA-Fragmenten (sequenzabhängige Information) und ist damit ein leistungsfähiger Ansatz zur Charakterisierung von DNA-Fragmenten. Die Merkmalspunkte in einem TGGE-Schmelzmuster, die drei strukturellen Übergängen des DNA-Moleküls entsprechen, sind der Stranginitialdissoziationspunkt, der Strangmitteldissoziationspunkt und der Strangenddissoziationspunkt (Abbildung 1). Sequenzvariationen innerhalb von Domänen, sogar Unterschiede bei Einzelbasen, beeinflussen die Schmelztemperatur, daher zeigen Moleküle mit unterschiedlichen Sequenzen diskrete Schmelzmuster (Denaturierungsmuster) in TGGE-Analysen. Daher kann TGGE zur Analyse von SNVs in genomischer RNA verwendet werden und kann eine unschätzbare Hochdurchsatzmethode zum Nachweis der RNA-Editierung sein. Dieser hohe Durchsatzgewinn geht verloren, wenn herkömmliches TGGE auf Gelelektrophoresebasis verwendet wird. Eine miniaturisierte Version von TGGE, genannt microTGGE (μTGGE), kann jedoch verwendet werden, um die gelelektrophoretische Zeit zu verkürzen und die Analyse mit einer 100-fachen Produktivitätssteigerungzu beschleunigen 11. Die Einfachheit und Kompaktheit der μTGGE-Methode wurde durch die Einführung von PalmPAGE12, einem praxistauglichen, tragbaren und erschwinglichen Gelelektrophoresesystem, verbessert.
Hier wird ein neues TGGE-basiertes Protokoll verwendet, um drei Arten von RNA-Editierstellen (A-zu-I, C-zu-U und U-zu-C) in vier Genen zu untersuchen, darunter zwei aus Arabidopsis thaliana-Geweben und zwei in HEK293-Zellen von Säugetieren exprimiert (Abbildung 1A). Das Protokoll integriert die Verwendung von PalmPAGE (Hardware), einem tragbaren System zur schnellen Detektion von RNA-Editierung, und uMelt (Software)13. Mit einer durchschnittlichen Laufzeit von 15-30 min ermöglicht dieses Protokoll eine schnelle, zuverlässige und einfache Identifizierung der RNA-Bearbeitung, ohne dass direkte RNA-Sequenzierungsansätze erforderlich sind.
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Protocol
1. Optimierung des Zielfragments
HINWEIS: Vier editierte Gene wurden bei der Entwicklung dieses Protokolls verwendet, darunter zwei Kerngene (AT2G16586 und AT5G02670) von A. thaliana und die Gene, die für blau fluoreszierendes Protein (BFP) und Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) kodieren, die in HEK293-Zellen exprimiert werden.
- Um Genfragmente mit unterschiedlichen Schmelzprofilen zu identifizieren, die bearbeitete und nicht bearbeitete Bereiche darstellen, generieren Sie vorhergesagte Schmelzkurven mit dem webbasierten Tool uMelt HETS, einer Erweiterung der ursprünglichen uMelt-Software13.
HINWEIS: Dieses Tool sagt die Formen von Schmelzkurven für Heteroduplex- und Homoduplex-Produkte voraus. - Entwerfen Sie für jedes Zielgen drei Paare von Genfragmenten (300-324 bp lang). Jedes Paar besteht aus einem Fragment mit einer bearbeiteten Stelle und einem entsprechenden Wildtypfragment mit einer nicht bearbeiteten Stelle, die sich entweder am 5'-terminalen, mittleren oder 3'-terminalen Ende befindet.
- Wählen Sie das nicht bearbeitete/bearbeitete Paar aus, das die maximale Differenz zwischen den Schmelzbereichen auf der Helizitätsachse für weitere Analysen zeigte. Für die μTGGE-Analyse wird das ausgewählte Genfragment durch PCR-Amplifikation synthetisiert, wie in Abschnitt 2 unten beschrieben.
- Entwerfen Sie die Vorwärts- und Rückwärtsprimer mit der DNADynamo-Software (https://www.bluetractorsoftware.com/DynamoDemo.htm) und verifizieren Sie sie mit dem NCBI Primer-BLAST-Tool.
- Verdünnen Sie die Primer in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl mit 1 mM EDTA· Na2) und lagern Sie sie in einer Konzentration von 100 pmol/μL. Vor der Verwendung verdünnen Sie jeden Primer mit destilliertem Wasser auf eine Konzentration von 10 pmol/μL.
2. RNA-Extraktion und RT-PCR-Amplifikation des Zielfragments
- RNA-Extraktion
- Extrahieren Sie die Gesamt-RNA aus der Quelle der editierten und nicht editierten Gene mit Standardmethoden wie TRIzol-Extraktion14 oder kommerziell erhältlichen Kits.
- Führen Sie die Synthese der entsprechenden cDNA unter Verwendung eines Standard-RT-PCR-Protokolls durch, wie in Schritt 2.2 beschrieben.
- Reverse Transkription
- Fügen Sie 1 μL Oligo(dT)-Primer, 1 μL 10 mM dNTP-Mischung, 10 μL Gesamt-RNA und 10 μL steriles destilliertes Wasser zu einem nukleasefreien Mikrozentrifugenröhrchen hinzu.
- Die Mischung 5 min bei 65 °C erhitzen und dann mindestens 1 min auf Eis inkubieren.
- Sammeln Sie den Inhalt des Röhrchens durch Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit (12.000 x g) für 2-3 s und fügen Sie 4 μL 5x ReverTra Ace-Puffer, 1 μL 0,1 M DTT und 1 μL M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) Reverse Transkriptase (200 U/μL, Materialverzeichnis) hinzu.
- Mischen Sie, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren. Wenn Sie zufällige Primer verwenden, inkubieren Sie das Rohr bei 25 ° C für 5 min.
- Inkubieren Sie das Rohr bei 55 °C für 60 min und inaktivieren Sie dann die Reaktion, indem Sie es 15 min lang bei 70 °C in einem digitalen Trockenbad/Blockheizgerät erhitzen.
- Messen Sie die Konzentration von cDNA mit einem Spektralphotometer und speichern Sie sie bei -25 °C.
-
PCR-Amplifikation und bestätigende Sequenzierung von Produkten
- Fügen Sie die folgenden Reagenzien zu einem nukleasefreien Mikrozentrifugenröhrchen hinzu: 4 μL 5x Taq-Polymerase-Puffer, 2 μL 2 mM dNTP-Mix, 2 μL 25 mMMgCl2, 1,6 μL des Primersatzes (vorwärts und rückwärts; jeweils 10 mM), 2 μL cDNA-Vorlage, 0,1 μL Taq-Polymerase (2,5 U/μL) und 8,3 μL steriles destilliertes Wasser (Endvolumen, 20 μL).
- Führen Sie eine PCR unter folgenden zyklischen Bedingungen durch: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 2 min; 35 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 2 min, Glühen bei einer geeigneten Temperatur (abhängig vom verwendeten spezifischen Primersatz) für 30 s und Verlängerung bei 72 °C für 2 min; und dann eine letzte Verlängerung bei 72 °C für 7 min.
- Um die PCR-Produkte zu reinigen, fügen Sie 2 U Exonuklease I und 0,5 HE Garnelen-alkalische Phosphatase (ExoSAP) hinzu. Inkubieren Sie das Rohr in einem Thermocycler bei 37 °C für 1 h, gefolgt von 80 °C für 15 min, und halten Sie es dann bis zum nächsten Schritt bei 4 °C.
- Zur bestätigenden Sequenzierung fügen Sie 11,5 μl steriles destilliertes Wasser, 2,5 μL Vorwärts- oder Rückwärtsprimer und 1 μL PCR-Produkte (mit ExoSAP) zu einem neuen Mikrozentrifugenröhrchen hinzu.
HINWEIS: Verwenden Sie DNA-Sequenzierungsdienste (z. B. Eurofins Genomics) für die Sequenzierungsanalyse. - Um die Spezifität der PCR-Produkte zu validieren, führen Sie eine Sequenzierung mit Vorwärts- und Rückwärtsprimern durch. Die in der repräsentativen Analyse verwendeten Primerpaare sind in Tabelle 1 aufgeführt.
- Die gereinigten PCR-Produkte mit entionisiertem Wasser auf eine Konzentration von 200 ng/μL verdünnen. Als nächstes mischen Sie 6 μL des gereinigten Produkts mit 3 μL 6x Gel-Belastungsfarbstoff in einem 250-μL-Röhrchen und erhöhen das Gesamtvolumen mit sterilem Wasser auf 12 μL. Lagern Sie das PCR-Produkt (bei -25 °C), bis es wie unten beschrieben mit μTGGE fortfahren kann.
3. μTGGE-Analyse
HINWEIS: Die μTGGE-Analyse wird unter Verwendung eines miniaturisierten und wirtschaftlichen Systems durchgeführt. Eine Übersicht über das gesamte System, einschließlich der Gelkassetten, des Gelkassettenhalters, der horizontalen Gelelektrophoreseplattform, des Netzteils und des Gelbildgebungssystems, ist in Abbildung 2 dargestellt.
- Montage der Gelkassetten
- Die für die μTGGE-Analyse verwendete Gelkassette ist in Abbildung 2A dargestellt. Das Design besteht aus drei 1-Zoll-Gelplatten: einer unteren Gelplatte, einer oberen Gelplatte und einer Lane-Former-Platte. Sandwichen Sie die obere Gelplatte zwischen die anderen beiden Platten und montieren Sie sie im Gelkassettenhalter für die Gelpolymerisation.
- Polyacrylamid-Gel-Zubereitung
- 7,2 g Harnstoff in ein 50-ml-Röhrchen geben und in 10 ml sterilem Wasser auflösen. Erhitzen Sie die Probe in einer Mikrowelle für 20-30 s und bringen Sie sie dann auf Raumtemperatur (RT).
- Zugabe von 3 ml 5x Tris/Borat/EDTA (TBE)-Puffer (Tabelle der Materialien), 2,25 ml 40% (w/v) Acrylamid/bis (19:1), 75 μL 10x Ammoniumpersulfat und 15 μL Tetramethylethylendiamin zur Lösung.
- Gießen Sie die Gellösung sofort langsam in den Gelkassettenhalter, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.
- Generierung von Schmelzprofilen mit der μTGGE-Einheit
- Verwenden Sie die miniaturisierte, wirtschaftliche Version der in Abbildung 2 gezeigten μTGGE-Apparatur mit einem Temperaturgradienten (25-65 °C), der senkrecht zur Richtung der DNA-Migration eingestellt ist.
- Weichen Sie die oberen und unteren Elektrophorese-Pufferpads (0,5 cm x 2,5 cm) in 2 ml 1x TBE-Puffer ein.
- Setzen Sie die Gelkassette in die horizontale Elektrophoresekammereinheit ein und positionieren Sie die oberen und unteren Pufferpads entsprechend, wie in Abbildung 2 dargestellt.
- Als nächstes laden Sie 10 μL des PCR-Produkts in die mittlere (längere) Vertiefung und 1 μL des PCR-Produkts in jede Seitenvertiefung.
- Schließen Sie nach einer 1-minütigen Wartezeit das Netzteil an und versorgen Sie 100 V für 12 Minuten bei einem linearen Temperaturgradienten von 25-65 °C.
- Nachdem der Lauf beendet ist, nehmen Sie die Kassette heraus und entfernen Sie die obere Glasabdeckung.
- Gießen Sie 300 μL 10x SYBR Gold Fleck auf das Gel. Visualisieren Sie die Schmelzprofile mit der blauen LED-Taschenlampe, die in dem handtellergroßen elektrophoretischen Gerät installiert ist.
HINWEIS: Eine Soft-Datei des Gelbildes sollte für die Berechnung des Pattern Similarity Score (PaSS) gespeichert werden. - Wiederholen Sie jedes elektrophoretische Experiment 3x, um die Reproduzierbarkeit der Daten zu bestätigen.
4. PaSS-Berechnungen
HINWEIS: Die Berechnungen werden mit der Software μTGGE Analyzer durchgeführt.
- Laden Sie die Software herunter und öffnen Sie sie.
- Öffnen Sie die JPEG-Datei, die das Gelbild enthält. Beachten Sie, dass die Software nur Dateien im JPEG-Format akzeptiert.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Rahmen und wählen Sie den entsprechenden Bereich ( Rahmen ) des Gelbildes aus.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Koordinatenkorrektur , und fügen Sie zwei Referenzpunkte hinzu, wie in Abbildung 1B dargestellt.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Feature Points hinzufügen , und fügen Sie Beispielpunkte hinzu, wie in Abbildung 1B dargestellt. Speichern Sie anschließend die verarbeiteten Gelbilddaten im μTGGE (*.tgg)-Format.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Beispiel und wählen Sie die Option Nach einfachen Punkten suchen aus, um zwei oder mehr Bilder zu vergleichen.
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Representative Results
Verwendung von μTGGE zur Identifizierung einzelner Nukleotidbasenänderungen in RNA-Editierungsereignissen
Für dieses Protokoll wurden vier editierte Gene verwendet (Tabelle 1), darunter das BFP-Gen, das in HEK293-Zellen produziert wird (mit C-zu-U-RNA-Editierung durch die Deaminase-Enzyme des Apolipoproteins B mRNA-Editierenzymkomplexes; APOBEC115), das EGFP-Gen, das das ockerfarbene Stop Codon (TAA) enthält, das in HEK293-Zellen produziert wird (mit A-zu-I-RNA-Editierung durch Adenosin-Deaminase, die auf RNA 1 wirkt; ADAR116) und die Kerngene AT2G16586 und AT5G02670 in A. thaliana17,18 (mit U-zu-C-RNA-Editing). Einzelne Nukleotidunterschiede zwischen den editierten und entsprechenden nicht editierten Proben wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Anschließend wurde eine μTGGE-Analyse durchgeführt, um die Unterschiede zwischen den Schmelzkurven der Proben zu untersuchen (Abbildung 3).
Für den C-zu-U-RNA-Editiertyp zeigte die nicht bearbeitete Probe mit der ursprünglichen C-Base ein längeres Schmelzmuster am Schmelzpunkt des Strangendes als die bearbeitete Probe mit der modifizierten U-Base (Abbildung 3A). Für den A-bis-I(G)-RNA-Bearbeitungstyp zeigte die bearbeitete Probe mit der modifizierten I(G)-Basis ein längeres Schmelzmuster am Schmelzpunkt des Strangendes als die nicht bearbeitete Probe mit der ursprünglichen A-Basis (Abbildung 3B). Für den "umgekehrten" U-zu-C-RNA-Editing-Typ wurden zwei Gene analysiert. Für das AT2G16586-Gen zeigte die bearbeitete Probe mit der modifizierten C-Base ein längeres Schmelzmuster zwischen den Strang-Anfangsschmelz- und Strangend-Schmelzpunkten als die nicht bearbeitete Probe mit der ursprünglichen U-Base (Abbildung 3C). Ein ähnliches Muster wurde jedoch für das andere AT5G02670-Gen nicht beobachtet (Abbildung 3D). Nichtsdestotrotz gab es einen deutlichen Unterschied zwischen den nicht bearbeiteten und bearbeiteten Typen am Endschmelzpunkt. Dies zeigt, dass die klare Beobachtung von Schmelzprofilen ein wichtiger Schritt ist, um zwischen nicht bearbeiteten und bearbeiteten Typen zu unterscheiden.
Quantitative Analyse von μTGGE-Schmelzmustern, die RNA-Editierungsereignisse darstellen
Als nächstes berechneten wir die PaSS-Werte11 , um die Reproduzierbarkeit der μTGGE-basierten Schmelzprofile zu bewerten, die die vier oben beschriebenen RNA-Editierereignisse darstellen. Der PaSS-Wert liefert ein Maß dafür, wie eng zwei Schmelzmuster überlagert werden können, wodurch ein höherer Wert (Maximum: 1) für sehr ähnliche Schmelzmuster erzeugt wird. Daher wird erwartet, dass die PaSS-Werte für Vergleiche von nicht bearbeiteten und bearbeiteten Stichproben weniger als eins betragen. Wie in Abbildung 1B gezeigt, wurden die Merkmalspunkte der Schmelzmuster, die strukturellen Übergängen von doppelsträngiger zu einzelsträngiger DNA entsprachen, zur Berechnung von PaSS-Werten verwendet. Um experimentelle Variablen zu eliminieren, wurde eine computergestützte Normalisierung unter Verwendung von zwei internen Referenzpunkten durchgeführt: Referenzpunkt #1, der die Position der Probe in doppelsträngiger Form darstellt (die linke Spur), und Referenzpunkt #2, der die Position der Probe in einsträngiger Form darstellt (die rechte Spur). Die Koordinaten der Feature-Punkte wurden auf die der internen Referenzpunkte normalisiert und dann zur Berechnung der PaSS-Werte verwendet. Jedes Experiment wurde dreimal wiederholt und der Durchschnittswert bestimmt. Wie erwartet, waren die PaSS-Werte der vier bearbeiteten Stichproben niedriger als eine (Abbildung 4). Die PaSS-Werte der C-zu-U- und A-zu-I-RNA-Editing-Typen waren niedriger als die der beiden U-zu-C-RNA-Editing-Typen. Dieser Unterschied hängt wahrscheinlich mit den jeweiligen Standorten der Bearbeitungsseiten zusammen. Insbesondere befanden sich die C-to-U- und A-to-I-bearbeiteten Stellen relativ nahe an den 5'-terminalen Enden (an den Positionen 48 bzw. 59 der ~ 300 bp-Fragmente), während sich die U-to-C-bearbeiteten Stellen in der Nähe der Mitte der Fragmente befanden (an den Positionen 152 und 169). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass bearbeitete Stellen an Terminalpositionen mit μTGGE leichter nachgewiesen werden können als solche, die sich in der Mitte von Fragmenten befinden.
Optimierung von TGGE-Schmelzmustern zur Identifizierung von RNA-Editing-Ereignissen
Da unsere bisherigen Ergebnisse darauf hindeuteten, dass der PaSS-Wert je nach spezifischer Position der RNA-Editierstelle variieren kann, untersuchten wir die Unterschiede zwischen den Schmelzmustern eines 300-bp-Fragments des BFP-Gens (exprimiert in HEK293T-Zellen), in dem sich eine C-zu-U-editierte Stelle in der Nähe des 5'-terminalen Endes, nahe dem 3'-terminalen Ende, befand. oder in der Mitte des Fragments (Abbildung 5A). Vor der μTGGE-Analyse wurden die Schmelzmuster des nicht bearbeiteten Fragments und drei bearbeiteten Fragmente mit dem webbasierten Tool uMelt HETS vorhergesagt. Diese Analyse zeigte, dass die C-zu-U-Modifikation die Schmelzkurve entlang der Temperaturachse nach links verschieben würde (Abbildung 5B). Die aus μTGGE-Analysen der nicht editierten und der drei editierten Fragmente berechneten PaSS-Werte wurden wie folgt geordnet: 5'-terminale End-RNA-Bearbeitung < 3'-terminale End-RNA-Bearbeitung < Zentrum von 5'- und 3'-terminalen End-RNA-Bearbeitung (Abbildung 5C). Insbesondere stimmten diese PaSS-Werte mit den mit uMelt vorhergesagten Ergebnissen überein. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Nukleotid-Basenunterschiede am 5'- oder 3'-terminalen Ende zu größeren Variationen zwischen den PaSS-Werten von editierten und nicht editierten Genen führen als Nukleotid-Basendifferenzen, die zentraler liegen. Darüber hinaus legen diese Ergebnisse nahe, dass Vorkenntnisse über die Unterschiede zwischen den Schmelzprofilen von editierten und nicht editierten Genen als Leitfaden zur Optimierung von Genfragmenten für die RNA-Editierung verwendet werden können.
Abbildung 1: Das Verfahren zur Identifizierung der RNA-Editierung durch μTGGE. (A) Die untersuchten Arten von RNA-Editing-Ereignissen. (B) Eine schematische Darstellung der typischen Schmelzprofile von bearbeiteten und nicht bearbeiteten Genen. In μTGGE wandert eine Probe durch ein Temperaturgradientengel, wodurch eine charakteristische Krümmung entsteht. Die Feature-Punkte des Schmelzmusters werden zugewiesen und dann verarbeitet, um einen PaSS-Wert (Pattern Similarity Score) zu berechnen. Die PaSS-Berechnung wird wie in der Gleichung gezeigt durchgeführt, wobei sich der Vektor P jedes Merkmalspunkts in seiner entsprechenden Position und die Funktion von Temperatur und Mobilität befindet (d. h. Vektor P = P (T, m)). Die hochgestellten Zeichen (1) und (2) stellen die bearbeiteten bzw. nicht bearbeiteten Gene dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Illustrationen und Fotos des handtellergroßen Gelelektrophoresegeräts. (A) Montage der drei 1 in Gelkassetten. (B) Abbildung des Gelkassettenhalters mit der Temperaturverlaufsplatte. Das Foto zeigt die Positionen der oberen und unteren Pufferpads sowie die der Probe nach dem ersten Beladen. (C) Überblick über das komplette System, einschließlich der Stromversorgung, der horizontalen Gelelektrophorese-Plattform und des Gel-Imaging-Systems. Dieses System bietet eine praktikable Lösung für schnelle, auf Polyacrylamid Gelelektrophorese basierende Analysen vor Ort. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: TGGE-Analysen von Einzelnukleotidveränderungen in RNA-Editing-Ereignissen. Schmelzprofile für drei verschiedene RNA-Editing-Typen wurden mit vier Genen untersucht. (A) C-zu-U-RNA-Editierung in BFP, exprimiert in HEK293T-Zellen. (B) A-zu-I(G) RNA-Bearbeitung in EGFP, ausgedrückt in HEK293T-Zellen. (C) U-zu-C-RNA-Editierung im AT2G16586-Gen von A. thaliana. (D) U-zu-C-RNA-Editierung im AT5G02670-Gen von A. thaliana. Die Positionen der bearbeiteten Websites werden gelb (mit roter Schrift) hervorgehoben und die Primerpositionen sind unterstrichen. Die Unterschiede zwischen den Schmelzmustern der bearbeiteten und nicht bearbeiteten Proben werden durch rote Kreise angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Die hier untersuchten durchschnittlichen PaSS-Werte für die vier editierten Gene. Fehlerindikatoren stellen die Standardabweichung von drei Replikaten dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Positionsspezifische PaSS-Analyse. (A) Die C-zu-U-Typ-RNA-Editierstelle im BFP-Gen, die in HEK293T-Zellen exprimiert wird, wurde in das 5'-terminale Ende, das 3'-terminale Ende oder das Zentrum des Genfragments verschoben. (B) Theoretische Vorhersage der Schmelzmuster der in (A) gezeigten nicht bearbeiteten und drei bearbeiteten Fragmente. Die Vorhersagen wurden mit uMelt durchgeführt. (C) Die in (A) angegebenen durchschnittlichen PaSS-Werteder bearbeiteten Gene. Fehlerindikatoren stellen die Standardabweichung von drei Replikaten dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| S.No | RNA-Editierung | Quelle | Position | Gen-ID | Vorwärts-Primer | Rückwärts-Primer | Sequenzlänge | ||
| 1 | C-bis-U | HEK293T Zellen | 48. | EGFP | AAGCTGACCC TGAAGTTCATC |
GCTGTTGTAGT TGTACTCCAGC |
324 | ||
| 2 | A-bis-I | HEK293T Zellen | 59. | EGFP | AGGGCGATGC CACCTACGGCA |
CCGTCCTCCT TTAAGTCGA |
300 | ||
| 3 | U-bis-C | Arabidopsis | 152. | AT2G16586 | GGGCGATGTT ACGCTCGATGA |
GTGAAGAGTAA CATGGCGTT |
301 | ||
| 4 | U-bis-C | Arabidopsis | 169. | AT5G02670 | CCAGTTGGCAG AATCCAGTCA |
CTAGCTTCCAC TGTTGAGATTC |
300 | ||
Tabelle 1: Liste der im aktuellen Protokoll verwendeten Gene
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Discussion
RNA-Editieren spielt eine wichtige Rolle in der Biologie; Aktuelle Methoden zum Nachweis der RNA-Editierung, wie Chromatographie und Sequenzierung, stellen jedoch aufgrund ihrer hohen Kosten, ihres übermäßigen Zeitaufwands und ihrer Komplexität mehrere Herausforderungen dar. Das hier beschriebene Protokoll ist eine einfache, schnelle und kostengünstige Methode zum Nachweis der RNA-Bearbeitung, die ein tragbares, mikroskaliertes, TGGE-basiertes System verwendet. Dieses System kann verwendet werden, um vor der Sanger-Sequenzierung zwischen bearbeiteten und nicht bearbeiteten Genen zu unterscheiden. Insbesondere können editierte und nicht editierte Gene mit Einzelbasen-Nukleotidmodifikationen anhand von Veränderungen in den TGGE-Schmelzprofilen unterschieden werden. Da es 1 in Gele enthält, benötigt das System sehr kleine Mengen an Proben und ermöglicht eine schnelle Erkennung von Unterschieden zwischen den Sequenzen. Darüber hinaus ist das hier beschriebene Protokoll sowohl für Experten als auch für Neulinge auf diesem Gebiet sehr einfach zu befolgen. Die Optimierung des Zielgenfragments ist entscheidend für eine klare Unterscheidung zwischen editierten und nicht editierten Regionen, und dieser Prozess wird im aktuellen Protokoll vereinfacht.
Dieses Protokoll ist kompatibel mit Multiplex-Analysen mit fluoreszierend markierten Primern. Für quantitative Analysen können unbekannte RNA-Proben (editiert oder nicht editiert) während der TGGE-Analyse mit grüner Fluoreszenz markiert und mit einem roten fluoreszenzmarkierten Referenzstandard (bearbeitet oder nicht editiert) migriert werden.
Neben dem Nachweis der Fähigkeit der μTGGE-Methode, Einzelnukleotid-RNA-Editierereignisse nachzuweisen, validierten wir auch die Ähnlichkeit zwischen dem experimentellen Ergebnis, das mit μTGGE erhalten wurde, und einem theoretischen Ergebnis, das für dasselbe Genfragment mit uMALL erhalten wurde. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass Nukleotidbasenunterschiede an den 5'- und 3'-Terminals von Genfragmenten größere Unterschiede in μTGGE-Schmelzprofilen (d.h. kleinere PaSS-Werte) erzeugen als solche, die sich in der Mitte der Fragmente befinden. Obwohl vielversprechend, kann sich das derzeitige Protokoll auf die Analyse und den Nachweis bestimmter Arten von Nukleotidmodifikationen während der RNA-Editierung beschränken. Die weitere Optimierung und Entwicklung dieses Protokolls zur Analyse anderer Arten und / oder Orte der RNA-Editierung wird in unserer bevorstehenden Forschung durchgeführt.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch einen Grant-in-Aid for Scientific Research der Japan Society for the Promotion of Science (17H02204 und 18K19288) unterstützt. Ruchika wurde von der japanischen Regierung finanziell unterstützt (MEXT-Stipendium). Wir danken Frau Radhika Biyani (Takagi Laboratory, JAIST) und Dr. Kirti Sharma (BioSeeds Corporation) für ihre Hilfe bei elektrophoresebezogenen Experimenten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2U ExoI | Takara | 2650A | Exonuclease I |
| 40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1) | Thermo fisher | AM9022 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Thermo Fisher | 17874 | |
| Centrifuge Mini spin | eppendorf | 5452000034 | |
| Digital dry bath/ block heater | Thermo fisher | NA | |
| Gold Taq Polymerase Master mixture | Promega | M7122 | |
| LATaq DNA polymerase | TAKARA | RR002A | Taq Polymerase |
| micro-TGGE cassette holder | BioSeeds Corp. | BS-GE-CH | |
| micro-TGGE apparatus | Lifetech Corp. | TG | |
| micro-TGGE gel cassette | BioSeeds Corp. | BS-TGGE-C | |
| NanoDrop 1000 | Thermo fisher | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Plant Rneasy Mini kit | Qiagen | 74904 | |
| ReverTra Ace Master Mix | TOYOBO | TRT101 | M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | Takara | 2660B | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Thermo fisher | S11494 | |
| TBE buffer | Thermo fisher | B52 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai tesque | 33401-72 | |
| Urea, Nuclease and protease tested | Nacalai tesque | 35940-65 |
References
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