Summary
La détection rapide et la quantification fiable des événements d’édition de l’ARN à l’échelle génomique restent difficiles et reposent actuellement sur des méthodes de séquençage direct de l’ARN. Le protocole décrit ici utilise l’électrophorèse sur gel à gradient de microtempérature (μTGGE) comme méthode simple, rapide et portable de détection de l’édition de l’ARN.
Abstract
L’édition de l’ARN est un processus qui conduit à des altérations de séquence posttranscriptionnelles dans les ARN. La détection et la quantification de l’édition de l’ARN reposent principalement sur les techniques de séquençage et de séquençage de l’ARN de Sanger. Cependant, ces méthodes peuvent être coûteuses et prendre beaucoup de temps. Dans ce protocole, un système portable d’électrophorèse sur gel à gradient de microtempérature (μTGGE) est utilisé comme approche non séquentielle pour la détection rapide de l’édition de l’ARN. Le processus est basé sur le principe de l’électrophorèse, qui utilise des températures élevées pour dénaturer les échantillons d’acides nucléiques lorsqu’ils se déplacent sur un gel de polyacrylamide. Sur une plage de températures, un fragment d’ADN forme un gradient d’ADN entièrement double brin vers des brins partiellement séparés, puis vers un ADN simple brin entièrement séparé. Les sites d’ARN avec des bases nucléotidiques distinctes produisent différents profils de fusion dans les analyses μTGGE. Nous avons utilisé l’approche basée sur μTGGE pour caractériser les différences entre les profils de fusion de quatre fragments d’ARN modifiés et leurs fragments non édités (de type sauvage) correspondants. Les scores de similitude des modèles (PaSS) ont été calculés en comparant les modèles de bande produits par les ARN édités et non édités et ont été utilisés pour évaluer la reproductibilité de la méthode. Dans l’ensemble, la plate-forme décrite ici permet de détecter même des mutations de base unique dans les ARN de manière directe, simple et rentable. On s’attend à ce que cet outil d’analyse aide à de nouvelles découvertes en biologie moléculaire.
Introduction
Les variantes mononucléotidiques (SNV) dans l’ARN génomique, y compris les variantes A-to-I, C-to-U et U-to-C, peuvent indiquer des événements d’édition de l’ARN. Cependant, la détection des SNV dans l’ARN reste une tâche techniquement difficile. Classiquement, le rapport entre l’ARN modifié et l’ARN non modifié est déterminé par séquençage direct, réaction en chaîne par polymérase (PCR) en temps réel spécifique à l’allèle ou par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) dénaturante 1,2,3,4,5,6. Cependant, ces approches ne sont pas particulièrement rapides ou rentables, et leur faible précision, causée par des niveaux élevés de bruit, pose des goulots d’étranglement technologiques pour la détection du SNV à base d’ARN 7,8. Ici, nous décrivons un protocole basé sur l’électrophorèse sur gel à gradient de température (TGGE) pour identifier les polymorphismes nucléotidiques uniques (SNP) comme une méthode alternative qui élimine le besoin d’approches de séquençage direct de l’ARN pour les analyses d’édition de l’ARN.
L’électrophorèse est une méthode privilégiée pour la séparation et l’analyse des biomolécules dans les laboratoires de sciences de la vie. TGGE permet la séparation de fragments d’ADN double brin de la même taille mais ayant des séquences différentes. La technique repose sur des différences liées à la séquence dans les températures de fusion des fragments d’ADN et les changements ultérieurs dans leurs mobilités dans les gels poreux avec un gradient de température linéairede 9,10. La fusion de fragments d’ADN génère des profils de fusion spécifiques. Une fois que le domaine avec la température de fusion la plus basse atteint la température correspondante à une position particulière dans le gel, la transition d’une structure hélicoïdale à une structure partiellement fondue se produit et la migration de la molécule s’arrêtera pratiquement. Par conséquent, TGGE utilise à la fois la mobilité (informations sur la taille) et les transitions structurelles induites par la température des fragments d’ADN (informations dépendantes de la séquence), ce qui en fait une approche puissante pour la caractérisation des fragments d’ADN. Les points caractéristiques d’un motif de fusion TGGE, qui correspondent à trois transitions structurelles de la molécule d’ADN, sont le point de dissociation initiale du brin, le point de dissociation intermédiaire du brin et le point de dissociation finale du brin (Figure 1). Les variations de séquence au sein des domaines, même les différences de base unique, affectent la température de fusion, par conséquent, les molécules avec des séquences différentes montreront des modèles de fusion discrets (dénaturation) dans les analyses TGGE. Par conséquent, TGGE peut être utilisé pour analyser les SNV dans l’ARN génomique et peut être une méthode inestimable à haut débit pour détecter l’édition de l’ARN. Ce gain à haut débit est perdu lorsque le TGGE traditionnel à base d’électrophorèse sur gel est utilisé. Cependant, une version miniaturisée de TGGE, nommée microTGGE (μTGGE), peut être utilisée pour raccourcir le temps électrophorétique du gel et accélérer l’analyse avec une augmentation de 100 fois de la productivité11. La simplicité et la compacité de la méthode μTGGE ont été améliorées par l’introduction de PalmPAGE12, un système d’électrophorèse sur gel applicable sur le terrain, portable et abordable.
Ici, un nouveau protocole basé sur TGGE est utilisé pour examiner trois types de sites d’édition d’ARN (A-to-I, C-to-U et U-to-C) dans quatre gènes, dont deux provenant de tissus d’Arabidopsis thaliana et deux exprimés dans des cellules HEK293 de mammifères (Figure 1A). Le protocole intègre l’utilisation de PalmPAGE (matériel), un système portable pour la détection rapide de l’édition d’ARN, et uMelt (logiciel)13. Avec une durée d’exécution moyenne de 15 à 30 minutes, ce protocole permet une identification rapide, fiable et facile de l’édition de l’ARN sans avoir besoin d’approches de séquençage direct de l’ARN.
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Protocol
1. Optimisation du fragment cible
NOTE: Quatre gènes modifiés ont été utilisés dans le développement de ce protocole, y compris deux gènes nucléaires (AT2G16586 et AT5G02670) d’A. thaliana, et les gènes codant pour la protéine fluorescente bleue (BFP) et la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) exprimée dans les cellules HEK293.
- Pour identifier les fragments de gènes avec différents profils de fusion, représentant des régions modifiées ou non éditées, générez des courbes de fusion prédites à l’aide de l’outil Web uMelt HETS, une extension du logiciel uMelt original13.
REMARQUE: Cet outil prédit les formes des courbes de fusion pour les produits hétéroduplex et homoduplex. - Pour chaque gène cible, concevez trois paires de fragments de gènes (300-324 bp de longueur). Chaque paire comprend un fragment avec un site édité et un fragment de type sauvage correspondant avec un site non édité, situé à l’extrémité 5'-terminal, à la position médiane ou à l’extrémité 3'-terminale.
- Sélectionnez la paire non modifiée/modifiée qui a montré la différence maximale entre les régions de fusion sur l’axe d’hélicité pour une analyse plus approfondie. Pour l’analyse μTGGE, synthétiser le fragment de gène sélectionné par amplification PCR, comme décrit à la rubrique 2 ci-dessous.
- Concevez les amorces avant et arrière à l’aide du logiciel DNADynamo (https://www.bluetractorsoftware.com/DynamoDemo.htm) et vérifiez à l’aide de l’outil NCBI Primer-BLAST.
- Diluer les amorces dans un tampon TE (10 mM de Tris-HCl contenant 1 mM d’EDTA· Na2) et les conserver à une concentration de 100 pmol/μL. Avant utilisation, diluer chaque apprêt à une concentration de 10 pmol/μL à l’aide d’eau distillée.
2. Extraction de l’ARN et amplification RT-PCR du fragment cible
- Extraction de l’ARN
- Extraire l’ARN total de la source des gènes modifiés et non édités à l’aide de méthodes standard, telles que l’extraction TRIzol14 ou des kits disponibles dans le commerce.
- Effectuer la synthèse de l’ADNc correspondant à l’aide d’un protocole RT-PCR standard tel que décrit à l’étape 2.2.
- Transcription inverse
- Ajouter 1 μL d’amorce oligo(dT), 1 μL de mélange de dNTP de 10 mM, 10 μL d’ARN total et 10 μL d’eau distillée stérile dans un tube de microcentrifugation sans nucléase.
- Chauffer le mélange à 65 °C pendant 5 min puis incuber sur de la glace pendant au moins 1 min.
- Recueillir le contenu du tube par centrifugation à la vitesse maximale (12 000 x g) pendant 2-3 s, et ajouter 4 μL de tampon ReverTra Ace 5x, 1 μL de 0,1 M TNT et 1 μL de transcriptase inverse M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) (200 U/μL, Table des matières).
- Mélanger en pipetant doucement vers le haut et vers le bas. Si vous utilisez des amorces aléatoires, incuber le tube à 25 °C pendant 5 min.
- Incuber le tube à 55 °C pendant 60 min, puis inactiver la réaction en chauffant à 70 °C pendant 15 min, dans un bain sec numérique/bloc chauffant.
- Mesurer la concentration d’ADNc à l’aide d’un spectrophotomètre et la stocker à -25 °C.
-
Amplification par PCR et séquençage de confirmation des produits
- Ajouter les réactifs suivants à un tube de microcentrifugation sans nucléase : 4 μL de 5x tampon de polymérase Taq, 2 μL de mélange dNTP de 2 mM, 2 μL de 25 mMMgCl2, 1,6 μL de l’ensemble d’amorce (avant et arrière; chacun 10 mM), 2 μL de gabarit d’ADNc, 0,1 μL de polymérase Taq (2,5 U/μL) et 8,3 μL d’eau distillée stérile (volume final, 20 μL).
- Effectuer la PCR dans les conditions de cycle suivantes : dénaturation initiale à 95 °C pendant 2 min ; 35 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 2 min, de recuit à une température appropriée (en fonction de l’ensemble d’apprêt spécifique utilisé) pendant 30 s et d’extension à 72 °C pendant 2 min; puis une dernière prolongation à 72 °C pendant 7 min.
- Pour purifier les produits de PCR, ajouter 2 U d’exonucléase I et 0,5 U de phosphatase alcaline de crevette (ExoSAP). Incuber le tube dans un cycleur thermique à 37 °C pendant 1 h, puis à 80 °C pendant 15 min, puis maintenir à 4 °C jusqu’à l’étape suivante.
- Pour le séquençage de confirmation, ajouter 11,5 μL d’eau distillée stérile, 2,5 μL d’apprêt avant ou arrière et 1 μL de produits PCR (avec ExoSAP) à un nouveau tube de microcentrifugation.
REMARQUE: Utilisez les services de séquençage de l’ADN (par exemple, Eurofins Genomics) pour l’analyse du séquençage. - Pour valider la spécificité des produits PCR, effectuez le séquençage avec des amorces avant et arrière. Les paires d’amorces utilisées dans l’analyse représentative sont données dans le tableau 1.
- Diluer les produits PCR purifiés à une concentration de 200 ng/μL avec de l’eau désionisée. Ensuite, mélangez 6 μL du produit purifié avec 3 μL de colorant à chargement de gel 6x dans un tube de 250 μL et augmentez le volume total à 12 μL avec de l’eau stérile. Conservez le produit PCR (à -25 °C) jusqu’à ce qu’il soit prêt à procéder avec μTGGE comme décrit ci-dessous.
3. Analyse μTGGE
REMARQUE: L’analyse μTGGE est effectuée à l’aide d’un système miniaturisé et économique. La figure 2 présente une vue d’ensemble du système complet, y compris les cassettes en gel, le support de cassette en gel, la plate-forme d’électrophorèse horizontale sur gel, l’alimentation et le système d’imagerie sur gel.
- Assemblage des cassettes de gel
- La cassette de gel utilisée pour l’analyse μTGGE est illustrée à la figure 2A. La conception se compose de trois plaques de gel de 1 pouce: une plaque de gel inférieure, une plaque de gel supérieure et une plaque de séparation. Sandwich la plaque de gel supérieure entre les deux autres plaques et assembler dans le support de cassette de gel pour la polymérisation du gel.
- Préparation de gel de polyacrylamide
- Ajouter 7,2 g d’urée dans un tube de 50 mL et dissoudre dans 10 mL d’eau stérile. Chauffer l’échantillon au micro-ondes pendant 20 à 30 s, puis le ramener à température ambiante (RT).
- Ajouter à la solution 3 mL de tampon 5x Tris/borate/EDTA (TBE) (Table des matériaux), 2,25 mL d’acrylamide/bis à 40 % (p/v) (19:1), 75 μL de persulfate d’ammonium 10x et 15 μL de tétraméthyléthylènediamine.
- Versez immédiatement la solution de gel dans le support de cassette de gel lentement, en évitant la formation de bulles d’air.
- Génération de profils de fusion à l’aide de l’unité μTGGE
- Utilisez la version miniaturisée et économique de l’appareil μTGGE illustré à la figure 2 avec un gradient de température (25-65 °C) fixé perpendiculairement à la direction de la migration de l’ADN.
- Faire tremper les tampons tampons d’électrophorèse supérieurs et inférieurs (0,5 cm x 2,5 cm) dans 2 mL de tampon 1x TBE.
- Placez la cassette de gel dans l’unité de la chambre d’électrophorèse horizontale et positionnez les tampons tampons supérieurs et inférieurs en conséquence, comme illustré à la figure 2.
- Ensuite, chargez 10 μL du produit PCR dans le puits central (plus long) et 1 μL du produit PCR dans chaque puits latéral.
- Après 1 min d’attente, branchez l’unité d’alimentation et alimentez 100 V pendant 12 min à un gradient de température linéaire de 25 à 65 °C.
- Une fois l’exécution terminée, retirez la cassette et retirez le couvercle supérieur en verre.
- Versez 300 μL de 10x SYBR Gold sur le gel. Visualisez les profils de fusion à l’aide de la lampe de poche LED bleue installée dans le dispositif électrophorétique de la taille d’une paume.
REMARQUE: Un fichier souple de l’image de gel doit être enregistré pour le calcul du score de similitude de modèle (PaSS). - Répétez chaque expérience électrophorétique 3x pour confirmer la reproductibilité des données.
4. Calculs PaSS
REMARQUE: Les calculs sont effectués à l’aide du logiciel μTGGE Analyzer.
- Téléchargez et ouvrez le logiciel.
- Ouvrez le fichier JPEG contenant l’image gel. Notez que le logiciel n’acceptera que les fichiers au format JPEG.
- Cliquez sur le bouton Cadre et sélectionnez la zone appropriée (cadre) de l’image gel.
- Cliquez sur le bouton Correction de coordonnées et ajoutez deux points de référence, comme illustré à la figure 1B.
- Cliquez sur le bouton Ajout de points d’entité et ajoutez des points d’échantillonnage comme illustré à la figure 1B. Enregistrez ensuite les données d’image de gel traitées au format μTGGE (*.tgg).
- Cliquez sur le bouton Exemple et sélectionnez l’option Rechercher des points simples pour comparer deux images ou plus.
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Representative Results
Utilisation de μTGGE pour identifier les changements de base nucléotidique unique dans les événements d’édition de l’ARN
Quatre gènes modifiés ont été utilisés pour ce protocole (tableau 1), y compris le gène BFP produit dans les cellules HEK293 (avec l’édition de l’ARN C à U par les enzymes désaminases du complexe enzymatique d’édition de l’ARNm apolipoprotéine B; APOBEC115), le gène EGFP contenant le codon stop ocre (TAA) produit dans les cellules HEK293 (avec l’édition de l’ARN A à I par l’adénosine désaminase agissant sur l’ARN 1; ADAR116), et les gènes nucléaires AT2G16586 et AT5G02670 chez A. thaliana17,18 (avec édition de l’ARN U-to-C). Les différences entre les échantillons modifiés et les échantillons non édités correspondants ont été confirmées par séquençage de l’ADN. Ensuite, une analyse μTGGE a été effectuée pour examiner les différences entre les courbes de fusion des échantillons (Figure 3).
Pour le type d’édition d’ARN C à U, l’échantillon non modifié avec la base C d’origine a montré un motif de fusion plus long au point de fusion final du brin que l’échantillon modifié avec la base U modifiée (Figure 3A). Pour le type d’édition d’ARN A à I(G), l’échantillon modifié avec la base I(G) modifiée présentait un motif de fusion plus long au point de fusion final du brin que l’échantillon non édité avec la base A d’origine (Figure 3B). Pour le type d’édition d’ARN U-to-C « inverse », deux gènes ont été analysés. Pour le gène AT2G16586, l’échantillon modifié avec la base C modifiée a montré un schéma de fusion plus long entre les points de fusion initiale du brin et l’extrémité du brin que l’échantillon non modifié avec la base U d’origine (Figure 3C). Cependant, une tendance similaire n’a pas été observée pour l’autre gène AT5G02670 (figure 3D). Néanmoins, il y avait une nette différence entre les types non édités et édités au point de fusion final. Cela montre que l’observation claire des profils de fusion est une étape importante dans la distinction entre les types non édités et modifiés.
Analyse quantitative des schémas de fusion μTGGE représentant les événements d’édition de l’ARN
Ensuite, nous avons calculé les valeurs PaSS11 pour évaluer la reproductibilité des profils de fusion basés sur μTGGE représentant les quatre événements d’édition d’ARN décrits ci-dessus. La valeur PaSS fournit une mesure de la proximité avec laquelle deux modèles de fusion peuvent être superposés, générant une valeur plus élevée (maximum: 1) pour des modèles de fusion très similaires. Ainsi, les valeurs PaSS pour les comparaisons d’échantillons non édités et modifiés devraient être inférieures à un. Comme le montre la figure 1B, les points caractéristiques des schémas de fusion qui correspondaient aux transitions structurelles de l’ADN double brin à l’ADN simple brin ont été utilisés pour calculer les valeurs PaSS. Pour éliminer les variables expérimentales, la normalisation assistée par ordinateur a été effectuée à l’aide de deux points de référence internes : le point de référence no 1, représentant la position de l’échantillon sous forme double brin (la voie la plus à gauche), et le point de référence no 2, représentant la position de l’échantillon sous forme simple brin (la voie la plus à droite). Les coordonnées des points d’entité ont été normalisées à celles des points de référence internes et ont ensuite été utilisées pour calculer les valeurs PaSS. Chaque expérience a été répétée trois fois et la valeur moyenne a été déterminée. Comme prévu, les valeurs PaSS des quatre échantillons modifiés étaient inférieures à un (figure 4). Les valeurs PaSS des types d’édition d’ARN C-to-you et A-to-I étaient inférieures à celles des deux types d’édition d’ARN U-to-C. Cette différence est probablement liée aux emplacements respectifs des sites d’édition. Plus précisément, les sites édités C-to-you et A-to-I étaient situés relativement près des extrémités terminales 5' (aux positions 48 et 59 des fragments ~300 bp, respectivement), tandis que les sites édités U-to-C étaient situés près du milieu des fragments (aux positions 152 et 169). Ces résultats suggèrent que les sites modifiés situés à des positions terminales peuvent être détectés à l’aide de μTGGE plus facilement que ceux situés vers le centre des fragments.
Optimisation des modèles de fusion TGGE pour identifier les événements d’édition d’ARN
Comme nos résultats précédents suggéraient que la valeur PaSS peut varier en fonction de la position spécifique du site d’édition de l’ARN, nous avons examiné les différences entre les modèles de fusion d’un fragment de 300 bp du gène BFP (exprimé dans les cellules HEK293T) dans lequel un site édité C-to-U était situé près de l’extrémité 5'-terminale, près de l’extrémité 3'-terminale, ou au centre du fragment (Figure 5A). Avant l’analyse μTGGE, les schémas de fusion du fragment non édité et de trois fragments modifiés ont été prédits à l’aide de l’outil Web uMelt HETS. Cette analyse a montré que la modification de C à U devrait déplacer la courbe de fusion vers la gauche le long de l’axe de température (figure 5B). Les valeurs PaSS calculées à partir des analyses μTGGE des fragments non édités et des trois fragments édités ont été ordonnées comme suit : 5'-terminal end RNA edit < 3'-terminal end RNA edit < centre de 5'- et 3'-terminal-terminal RNA edit (Figure 5C). Notamment, ces valeurs PaSS étaient cohérentes avec les résultats prédits en utilisant uMelt. Ces résultats indiquent que les différences de base nucléotidique situées à l’extrémité terminale 5'ou 3'entraînent des variations plus importantes entre les valeurs PaSS des gènes modifiés et non édités que les différences de base nucléotidiques situées plus centralement. En outre, ces résultats suggèrent que la connaissance préalable des différences entre les profils de fusion des gènes modifiés et non édités peut être utilisée comme guide pour optimiser les fragments de gènes pour l’édition de l’ARN.
Figure 1 : La procédure utilisée pour identifier l’édition de l’ARN par μTGGE. (A) Les types d’événements d’édition de l’ARN examinés. (B) Une illustration schématique des profils de fusion typiques des gènes modifiés et non édités. Dans μTGGE, un échantillon migre à travers un gel de gradient de température, produisant une courbure caractéristique. Les points d’entité du motif de fusion sont affectés, puis traités pour calculer une valeur PaSS (Pattern Similarity Score). Le calcul PaSS est effectué comme indiqué dans l’équation, où le vecteur P de chaque point d’entité est dans sa position correspondante et la fonction de température et de mobilité (c’est-à-dire le vecteur P = P (T, m)). Les exposants (1) et (2) représentent respectivement les gènes modifiés et non édités. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Illustrations et photographies du dispositif d’électrophorèse sur gel de la taille d’une paume. (A) Assemblage des trois cassettes 1 en gel. (B) Illustration du support de cassette en gel avec la plaque de gradient de température. La photographie montre les positions des tampons supérieurs et inférieurs, ainsi que celle de l’échantillon après le chargement initial. (C) Vue d’ensemble du système complet, y compris l’alimentation électrique, la plate-forme d’électrophorèse sur gel horizontale et le système d’imagerie sur gel. Ce système fournit une solution viable pour des analyses rapides sur site basées sur l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Analyses TGGE des changements d’un seul nucléotide dans les événements d’édition de l’ARN. Les profils de fusion de trois types d’édition d’ARN différents ont été examinés à l’aide de quatre gènes. (A) L’édition de l’ARN C-to-U dans la BFP exprimée dans les cellules HEK293T. (B) L’édition de l’ARN A à I(G) dans l’EGFP exprimé dans les cellules HEK293T. (C) Édition de l’ARN U-to-C dans le gène AT2G16586 de A. thaliana. (D) Modification de l’ARN U-to-C dans le gène AT5G02670 d’A. thaliana. Les emplacements des sites modifiés sont surlignés en jaune (avec une police rouge) et les positions de l’amorce sont soulignées. Les différences entre les motifs de fusion des échantillons édités et non édités sont indiquées par des cercles rouges. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Les valeurs PaSS moyennes pour les quatre gènes modifiés examinés ici. Les barres d’erreur représentent l’écart-type de trois répétitions. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Analyse PaSS spécifique à la position. (A) Le site d’édition de l’ARN de type C à U dans le gène BFP exprimé dans les cellules HEK293T a été déplacé vers l’extrémité terminale 5', l’extrémité terminale 3' ou le centre du fragment de gène. (B) Prédiction théorique des schémas de fusion des fragments non édités et des trois fragments édités présentés en (A). Les prédictions ont été effectuées à l’aide de uMelt. (C) Les valeurs PaSSmoyennes des gènes modifiés indiquées en (A). Les barres d’erreur représentent l’écart-type de trois répétitions. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| S.No | Édition de l’ARN | Source | Position | Identification du gène | Introduction à l’avant | Amorce inversée | Longueur de la séquence | ||
| 1 | C-à-U | Cellules HEK293T | 48e | L’EGFP | AAGCTGACCC TGAAGTTCATC |
GCTGTTGTAGT TGTACTCCAGC |
324 | ||
| 2 | A à I | Cellules HEK293T | 59ème | L’EGFP | AGGGCGATGC CACCTACGGCA |
CCGTCCTCCT TTAAGTCGA |
300 | ||
| 3 | U-to-C | Arabidopsis | 152e | AT2G16586 | GGGCGATGTT ACGCTCGATGA |
GTGAAGAGTAA CATGGCGTT |
301 | ||
| 4 | U-to-C | Arabidopsis | 169e | AT5G02670 | CCAGTTGGCAG AATCCAGTCA |
CTAGCTTCCAC TGTTGAGATTC |
300 | ||
Tableau 1 : Liste des gènes utilisés dans le protocole actuel
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Discussion
L’édition de l’ARN joue un rôle important en biologie; cependant, les méthodes actuelles de détection de l’édition de l’ARN, telles que la chromatographie et le séquençage, présentent plusieurs défis en raison de leur coût élevé, de leurs exigences de temps excessives et de leur complexité. Le protocole décrit ici est une méthode simple, rapide et rentable de détection de l’édition de l’ARN qui utilise un système portable, microdimensionnel et basé sur TGGE. Ce système peut être utilisé pour différencier les gènes modifiés et non édités avant le séquençage de Sanger. Plus précisément, les gènes modifiés et non édités avec des modifications de nucléotides à base unique peuvent être différenciés en fonction des changements dans les profils de fusion TGGE. Comme il incorpore 1 dans les gels, le système nécessite de très petites quantités d’échantillons et permet une détection rapide des différences entre les séquences. De plus, le protocole décrit ici est très facile à suivre pour les experts et les nouveaux venus dans le domaine. L’optimisation du fragment de gène cible est essentielle pour une différenciation claire entre les régions éditées et non éditées, et ce processus est simplifié dans le protocole actuel.
Ce protocole est compatible avec les analyses multiplex utilisant des amorces marquées par fluorescence. Pour les analyses quantitatives, les échantillons d’ARN inconnus (édités ou non édités) peuvent être marqués avec une fluorescence verte et comigrés avec un étalon de référence marqué par fluorescence rouge (édité ou non) lors de l’analyse TGGE.
En plus de démontrer la capacité de la méthode μTGGE à détecter des événements d’édition d’ARN nucléotidique unique, nous avons également validé la similitude entre le résultat expérimental obtenu à l’aide de μTGGE et un résultat théorique obtenu pour le même fragment de gène à l’aide d’uMELT. De plus, nous avons constaté que les différences de base nucléotidique situées aux bornes 5' et 3'des fragments de gènes produisent des différences plus importantes dans les profils de fusion μTGGE (c’est-à-dire des valeurs PaSS plus petites) que celles situées vers le centre des fragments. Bien que prometteur, le protocole actuel peut se limiter à l’analyse et à la détection de types spécifiques de modifications nucléotidiques lors de l’édition de l’ARN. D’autres optimisations et développements de ce protocole pour analyser d’autres types et/ ou emplacements d’édition d’ARN seront effectués dans nos prochaines recherches.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention pour la recherche scientifique de la Société japonaise pour la promotion de la science (17H02204 et 18K19288). Ruchika a été soutenu financièrement par le gouvernement japonais (bourse MEXT). Nous remercions Mme Radhika Biyani (Takagi Laboratory, JAIST) et le Dr Kirti Sharma (BioSeeds Corporation) pour leur aide dans les expériences liées à l’électrophorèse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2U ExoI | Takara | 2650A | Exonuclease I |
| 40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1) | Thermo fisher | AM9022 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Thermo Fisher | 17874 | |
| Centrifuge Mini spin | eppendorf | 5452000034 | |
| Digital dry bath/ block heater | Thermo fisher | NA | |
| Gold Taq Polymerase Master mixture | Promega | M7122 | |
| LATaq DNA polymerase | TAKARA | RR002A | Taq Polymerase |
| micro-TGGE cassette holder | BioSeeds Corp. | BS-GE-CH | |
| micro-TGGE apparatus | Lifetech Corp. | TG | |
| micro-TGGE gel cassette | BioSeeds Corp. | BS-TGGE-C | |
| NanoDrop 1000 | Thermo fisher | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Plant Rneasy Mini kit | Qiagen | 74904 | |
| ReverTra Ace Master Mix | TOYOBO | TRT101 | M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | Takara | 2660B | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Thermo fisher | S11494 | |
| TBE buffer | Thermo fisher | B52 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai tesque | 33401-72 | |
| Urea, Nuclease and protease tested | Nacalai tesque | 35940-65 |
References
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