Summary
Hurtig detektion og pålidelig kvantificering af RNA-redigeringshændelser i genomisk skala er fortsat udfordrende og er i øjeblikket afhængig af direkte RNA-sekventeringsmetoder. Protokollen beskrevet her bruger mikrotemperaturgradientgelelektroforese (μTGGE) som en enkel, hurtig og bærbar metode til påvisning af RNA-redigering.
Abstract
RNA-redigering er en proces, der fører til posttranskriptionelle sekvensændringer i RNA'er. Påvisning og kvantificering af RNA-redigering er hovedsageligt afhængig af Sanger-sekventerings- og RNA-sekventeringsteknikker. Disse metoder kan dog være dyre og tidskrævende. I denne protokol anvendes et bærbart mikrotemperaturgradientgelelektroforese (μTGGE) system som en ikke-sekventerende tilgang til hurtig påvisning af RNA-redigering. Processen er baseret på princippet om elektroforese, som bruger høje temperaturer til at denaturere nukleinsyreprøver, når de bevæger sig over en polyacrylamidgel. På tværs af en række temperaturer danner et DNA-fragment en gradient af fuldt dobbeltstrenget DNA til delvist adskilte tråde og derefter til helt adskilt enkeltstrenget DNA. RNA-redigerede steder med forskellige nukleotidbaser producerer forskellige smelteprofiler i μTGGE-analyser. Vi brugte den μTGGE-baserede tilgang til at karakterisere forskellene mellem smelteprofilerne for fire redigerede RNA-fragmenter og deres tilsvarende ikke-redigerede (vildtype) fragmenter. Pattern Similarity Scores (PaSS'er) blev beregnet ved at sammenligne båndmønstrene produceret af de redigerede og ikke-redigerede RNA'er og blev brugt til at vurdere metodens reproducerbarhed. Samlet set muliggør den platform, der er beskrevet her, påvisning af selv enkeltbasemutationer i RNA'er på en ligetil, enkel og omkostningseffektiv måde. Det forventes, at dette analyseværktøj vil hjælpe nye molekylærbiologiske fund.
Introduction
Enkeltnukleotidvarianter (SNV'er) i genomisk RNA, herunder A-til-I, C-til-U og U-til-C-varianter, kan indikere RNA-redigeringshændelser. Påvisning af SNV'er i RNA er dog fortsat en teknisk udfordrende opgave. Konventionelt bestemmes forholdet mellem redigeret og ikke-redigeret RNA ved direkte sekventering, allelspecifik realtidspolymerasekædereaktion (PCR) eller denaturering af højtydende væskekromatografi (HPLC) tilgange 1,2,3,4,5,6. Disse tilgange er imidlertid ikke særlig tids- eller omkostningseffektive, og deres lave nøjagtigheder, forårsaget af høje støjniveauer, udgør teknologiske flaskehalse for RNA-baseret SNV-detektion 7,8. Her beskriver vi en protokol baseret på temperaturgradientgelelektroforese (TGGE) til identifikation af enkeltnukleotidpolymorfier (SNP'er) som en alternativ metode, der eliminerer behovet for direkte RNA-sekventeringsmetoder til RNA-redigeringsanalyser.
Elektroforese er en foretrukken metode til adskillelse og analyse af biomolekyler i life science laboratorier. TGGE muliggør adskillelse af dobbeltstrengede DNA-fragmenter, der har samme størrelse, men har forskellige sekvenser. Teknikken er afhængig af sekvensrelaterede forskelle i SMELTETEMPERATURERNE FOR DNA-FRAGMENTER OG EFTERFØLGENDE ÆNDRINGER I DERES MOBILITETER I PORØSE GELER MED EN LINEÆR TEMPERATURGRADIENT 9,10. Smeltning af DNA-fragmenter genererer specifikke smelteprofiler. Når domænet med den laveste smeltetemperatur når den tilsvarende temperatur på en bestemt position i gelen, sker overgangen fra en spiralformet struktur til en delvist smeltet struktur, og migration af molekylet vil praktisk talt stoppe. Derfor anvender TGGE både mobilitet (størrelsesinformation) og temperaturinducerede strukturelle overgange af DNA-fragmenter (sekvensafhængig information), hvilket gør det til en stærk tilgang til karakterisering af DNA-fragmenter. Funktionspunkterne i et TGGE-smeltemønster, der svarer til tre strukturelle overgange af DNA-molekylet, er strengens initial-dissociationspunkt, strengens midt-dissociationspunkt og strengens ende-dissociationspunkt (figur 1). Sekvensvariationer inden for domæner, selv enkeltbaseforskelle, påvirker smeltetemperaturen, og molekyler med forskellige sekvenser vil derfor vise diskrete smeltemønstre (denaturering) i TGGE-analyser. Derfor kan TGGE bruges til at analysere SNV'er i genomisk RNA og kan være en uvurderlig metode med høj gennemstrømning til påvisning af RNA-redigering. Denne forstærkning med høj gennemstrømning går tabt, når traditionel gelelektroforesebaseret TGGE anvendes. Imidlertid kan en miniaturiseret version af TGGE, kaldet microTGGE (μTGGE), bruges til at forkorte gelelektroforetisk tid og fremskynde analysen med en 100 gange stigning iproduktiviteten 11. Enkelheden og kompaktiteten af μTGGE-metoden er blevet forbedret ved introduktionen af PalmPAGE12, et feltrelevendeligt, håndholdt og overkommeligt gelelektroforesesystem.
Her bruges en ny TGGE-baseret protokol til at undersøge tre typer RNA-redigeringssteder (A-til-I, C-til-U og U-til-C) i fire gener, herunder to fra Arabidopsis thaliana-væv og to udtrykt i pattedyrs HEK293-celler (figur 1A). Protokollen integrerer brugen af PalmPAGE (hardware), et bærbart system til hurtig detektion af RNA-redigering og uMelt (software)13. Med en gennemsnitlig driftstid på 15-30 minutter muliggør denne protokol hurtig, pålidelig og nem identifikation af RNA-redigering uden behov for direkte RNA-sekventeringsmetoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Optimering af målfragmentet
BEMÆRK: Fire redigerede gener blev anvendt i udviklingen af denne protokol, herunder to nukleare gener (AT2G16586 og AT5G02670) fra A. thaliana, og generne, der koder for blåt fluorescerende protein (BFP) og forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) udtrykt i HEK293-celler.
- For at identificere genfragmenter med forskellige smelteprofiler, der repræsenterer redigerede versus ikke-redigerede regioner, skal du generere forudsagte smeltekurver ved hjælp af det webbaserede værktøj uMelt HETS, en udvidelse af den originale uMelt-software13.
BEMÆRK: Dette værktøj forudsiger formerne af smeltekurver for heteroduplex- og homoduplex-produkter. - For hvert målgen skal du designe tre par genfragmenter (300-324 bp i længden). Hvert par består af et fragment med et redigeret sted og et tilsvarende vildtypefragment med et ikke-redigeret sted, der er placeret i enten 5'-terminalenden, midterpositionen eller 3'-terminalenden.
- Vælg det ikke-redigerede/redigerede par, der viste den maksimale forskel mellem smelteområderne på helicitetsaksen til yderligere analyse. Til μTGGE-analyse syntetiseres det valgte genfragment ved PCR-amplifikation som beskrevet i punkt 2 nedenfor.
- Design de fremadrettede og omvendte primere ved hjælp af DNADynamo-software (https://www.bluetractorsoftware.com/DynamoDemo.htm), og kontroller ved hjælp af NCBI Primer-BLAST-værktøjet.
- Fortynd primerne i TE-buffer (10 mM Tris-HCl indeholdende 1 mM EDTA· Na2) og opbevar dem i en koncentration på 100 pmol/μL. Før brug fortyndes hver primer, der er sat til en koncentration på 10 pmol/μL, ved hjælp af destilleret vand.
2. RNA-ekstraktion og RT-PCR-amplifikation af målfragmentet
- RNA-ekstraktion
- Uddrag total RNA fra kilden til redigerede og ikke-redigerede gener ved hjælp af standardmetoder, såsomTRIzol-ekstraktion 14 eller kommercielt tilgængelige kits.
- Udfør syntesen af det tilsvarende cDNA ved hjælp af en standard RT-PCR-protokol som beskrevet i trin 2.2.
- Omvendt transkription
- Der tilsættes 1 μL oligo(dT)-primer, 1 μL 10 mM dNTP-blanding, 10 μL totalt RNA og 10 μL sterilt destilleret vand til et nukleasefrit mikrocentrifugerør.
- Blandingen opvarmes ved 65 °C i 5 min., og inkuberes derefter på is i mindst 1 min.
- Opsaml indholdet af røret ved centrifugering ved maksimal hastighed (12.000 x g) i 2-3 s, og tilsæt 4 μL 5x ReverTra Ace buffer, 1 μL af 0,1 M DTT og 1 μL M-MLV (Moloney Murine Leukæmi Virus) omvendt transkriptase (200 U / μL, Materialetabel).
- Bland ved at pipettere forsigtigt op og ned. Hvis du bruger tilfældige primere, skal du inkubere røret ved 25 °C i 5 minutter.
- Inkuber røret ved 55 °C i 60 minutter, og deaktiver derefter reaktionen ved opvarmning ved 70 °C i 15 minutter i et digitalt tørbad/blokvarmer.
- Koncentrationen af cDNA måles ved hjælp af et spektrofotometer, og den opbevares ved -25 °C.
-
PCR-forstærkning og bekræftende sekventering af produkter
- Følgende reagenser tilsættes til et nukleasefrit mikrocentrifugerør: 4 μL 5x Taq Polymerase Buffer, 2 μL af 2 mM dNTP-blanding, 2 μL af 25 mM MgCl2, 1,6 μL af primersættet (frem og tilbage; hver 10 mM), 2 μL cDNA-skabelon, 0,1 μL Taq-polymerase (2,5 U/μL) og 8,3 μL sterilt destilleret vand (slutvolumen, 20 μL).
- Udfør PCR med følgende cykelbetingelser: indledende denaturering ved 95 °C i 2 minutter; 35 denatureringscyklusser ved 95 °C i 2 minutter, udglødning ved en passende temperatur (afhængigt af det specifikke primersæt, der anvendes) i 30 s og forlængelse ved 72 °C i 2 minutter og derefter en endelig forlængelse ved 72 °C i 7 min.
- For at rense PCR-produkterne tilsættes 2 U Exonuklease I og 0,5 U rejealkalisk phosphatase (ExoSAP). Inkubere røret i en termisk cyktur ved 37 °C i 1 time efterfulgt af 80 °C i 15 minutter og derefter holde sig ved 4 °C indtil næste trin.
- Til verifikationssekventering tilsættes 11,5 μL sterilt destilleret vand, 2,5 μL frem eller tilbage primer og 1 μL PCR-produkter (med ExoSAP) til et nyt mikrocentrifugerør.
BEMÆRK: Brug DNA-sekventeringstjenester (f.eks. Eurofins Genomics) til sekventeringsanalyse. - For at validere PCR-produkternes specificitet skal du udføre sekventering med både fremadgående og omvendte primere. De primerpar, der anvendes i den repræsentative analyse, er angivet i tabel 1.
- Fortynd de rensede PCR-produkter til en koncentration på 200 ng/μL med deioniseret vand. Derefter blandes 6 μL af det rensede produkt med 3 μL 6x gelbelastningsfarvestof i et 250 μL rør og hæver det samlede volumen til 12 μL med sterilt vand. PCR-produktet opbevares (ved -25 °C), indtil det er klar til at fortsætte med μTGGE som beskrevet nedenfor.
3. μTGGE analyse
BEMÆRK: μTGGE-analysen udføres ved hjælp af et miniaturiseret og økonomisk system. En oversigt over det komplette system, herunder gelkassetter, gelkassetteholder, vandret gelelektroforeseplatform, strømforsyning og gelbilleddannelsessystem, er vist i figur 2.
- Samling af gelkassetterne
- Gelkassetten, der anvendes til μTGGE-analyse, er vist i figur 2A. Designet består af tre 1 tommer gelplader: en bundgelplade, en topgelplade og en bane-tidligere plade. Sandwich den øverste gelplade mellem de to andre plader og saml i gelkassetteholderen til gelpolymerisation.
- Polyacrylamid gel præparat
- Tilsæt 7,2 g urinstof til et 50 ml rør og opløs i 10 ml sterilt vand. Opvarm prøven i en mikrobølgeovn i 20-30 s, og bring den derefter til stuetemperatur (RT).
- Der tilsættes 3 ml 5x Tris/borat/EDTA(TBE)-buffer (materialetabel), 2,25 ml 40 % acrylamid/bis (19:1), 75 μL 10x ammoniumpersulfat og 15 μL tetramethylethylendiamin til opløsningen.
- Hæld straks gelopløsningen langsomt i gelkassetteholderen, og undgå dannelse af luftbobler.
- Generering af smelteprofiler ved hjælp af μTGGE-enheden
- Brug den miniaturiserede, økonomiske version af μTGGE-apparatet vist i figur 2 med en temperaturgradient (25-65 °C) sat vinkelret på DNA-migrationsretningen.
- Blødgør de øvre og nedre elektroforesebufferpuder (0,5 cm x 2,5 cm) i 2 ml 1x TBE-buffer.
- Anbring gelkassetten i den vandrette elektroforesekammerenhed, og anbring de øvre og nedre bufferpuder i overensstemmelse hermed, som vist i figur 2.
- Læg derefter 10 μL af PCR-produktet i den midterste (længere) brønd og 1 μL af PCR-produktet i hver sidebrønde.
- Efter 1 minuts ventetid skal du tilslutte strømforsyningen og forsyne 100 V i 12 minutter ved en lineær temperaturgradient fra 25-65 °C.
- Når kørslen er afsluttet, skal du tage kassetten ud og fjerne det øverste glasdæksel.
- Hæld 300 μL 10x SYBR Guldplet på gelen. Visualiser smelteprofilerne ved hjælp af den blå LED-lommelygte, der er installeret i den elektroforetiske enhed i håndfladestørrelse.
BEMÆRK: En blød fil af gelbilledet skal gemmes til PaSS-beregning (Pattern Similarity Score). - Gentag hvert elektroforetisk eksperiment 3x for at bekræfte reproducerbarheden af dataene.
4. PaSS-beregninger
BEMÆRK: Beregningerne udføres ved hjælp af μTGGE Analyzer-software.
- Download og åbn softwaren.
- Åbn JPEG-filen, der indeholder gelbilledet. Bemærk, at softwaren kun accepterer JPEG-formatfiler.
- Klik på knappen Ramme , og vælg det relevante område (ramme) af gelbilledet.
- Klik på knappen Koordinatkorrektion , og tilføj to referencepunkter, som vist i figur 1B.
- Klik på knappen Tilføjelse af funktionspunkter , og tilføj eksempelpunkter som vist i figur 1B. Gem derefter de behandlede gelbilleddata i μTGGE-format (*.tgg).
- Klik på knappen Eksempel, og vælg indstillingen Søg efter enkle punkter for at sammenligne to eller flere billeder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anvendelse af μTGGE til at identificere ændringer i enkeltnukleotidbase i RNA-redigeringshændelser
Fire redigerede gener blev anvendt til denne protokol (tabel 1), herunder BFP-genet produceret i HEK293-celler (med C-til-U RNA-redigering af deaminaseenzymerne i apolipoprotein B mRNA-redigeringsenzymkomplekset; APOBEC115), EGFP-genet indeholdende okkerstopkodon (TAA) produceret i HEK293-celler (med A-til-I RNA-redigering ved adenosindeaminase, der virker på RNA 1; ADAR116) og AT2G16586 og AT5G02670 nukleare gener i A. thaliana17,18 (med U-til-C RNA-redigering). Enkeltnukleotidforskelle mellem de redigerede og tilsvarende ikke-redigerede prøver blev bekræftet ved DNA-sekventering. Derefter blev der udført en μTGGE-analyse for at undersøge forskellene mellem prøvernes smeltekurver (figur 3).
For C-til-U RNA-redigeringstypen viste den ikke-redigerede prøve med den oprindelige C-base et længere smeltemønster ved strengens endesmeltepunkt end den redigerede prøve med den modificerede U-base (figur 3A). For A-til-I (G) RNA-redigeringstypen viste den redigerede prøve med den modificerede I (G) base et længere smeltemønster ved strengens endesmeltepunkt end den ikke-redigerede prøve med den oprindelige A-base (figur 3B). For den "omvendte" U-til-C RNA-redigeringstype blev to gener analyseret. For AT2G16586-genet viste den redigerede prøve med den modificerede C-base et længere smeltemønster mellem strengens initial-smeltepunkter og streng-ende-smeltepunkter end den ikke-redigerede prøve med den oprindelige U-base (figur 3C). Et lignende mønster blev imidlertid ikke observeret for det andet AT5G02670-gen (figur 3D). Ikke desto mindre var der en tydelig forskel mellem de ikke-redigerede og redigerede typer ved slutsmeltepunktet. Dette viser, at observation af smelteprofiler klart er et vigtigt skridt i at skelne mellem ikke-redigerede og redigerede typer.
Kvantitativ analyse af μTGGE smeltemønstre, der repræsenterer RNA-redigeringshændelser
Dernæst beregnede vi PaSS-værdier11 for at evaluere reproducerbarheden af de μTGGE-baserede smelteprofiler, der repræsenterer de fire RNA-redigeringshændelser, der er beskrevet ovenfor. PaSS-værdien giver et mål for, hvor tæt to smeltemønstre kan overlejres, hvilket genererer en højere værdi (maksimum: 1) for meget ens smeltemønstre. PaSS-værdier for sammenligninger af ikke-redigerede og redigerede prøver forventes således at være mindre end én. Som vist i figur 1B blev funktionspunkterne i smeltemønstrene, der svarede til strukturelle overgange fra dobbeltstrenget til enkeltstrenget DNA, brugt til at beregne PaSS-værdier. For at eliminere eksperimentelle variabler blev computerstøttet normalisering udført ved hjælp af to interne referencepunkter: referencepunkt nr. 1, der repræsenterer prøvens position i dobbeltstrenget form (den venstre bane) og referencepunkt nr. 2, der repræsenterer prøvens position i enkeltstrenget form (den højre bane). Koordinaterne for funktionspunkterne blev normaliseret til de interne referencepunkter og blev derefter brugt til at beregne PaSS-værdierne. Hvert eksperiment blev gentaget tre gange, og gennemsnitsværdien blev bestemt. Som forventet var PaSS-værdierne for de fire redigerede prøver lavere end én (figur 4). PaSS-værdierne for C-to-you- og A-to-I-RNA-redigeringstyperne var lavere end for de to U-til-C RNA-redigeringstyper. Denne forskel er sandsynligvis relateret til de respektive placeringer af redigeringswebstederne. Specifikt var de C-to-you og A-to-I redigerede websteder placeret relativt tæt på 5'-terminalenderne (i henholdsvis position 48 og 59 af de ~ 300 bp fragmenter), mens de U-til-C redigerede steder var placeret nær midten af fragmenterne (på position 152 og 169). Disse resultater tyder på, at redigerede steder placeret på terminalpositioner lettere kan detekteres ved hjælp af μTGGE end dem, der er placeret mod midten af fragmenter.
Optimering af TGGE smeltemønstre til identifikation af RNA-redigeringshændelser
Da vores tidligere resultater antydede, at PaSS-værdien kan variere afhængigt af RNA-redigeringsstedets specifikke position, undersøgte vi forskellene mellem smeltemønstrene for et 300 bp-fragment af BFP-genet (udtrykt i HEK293T-celler), hvor et C-til-U-redigeret sted var placeret tæt på den 5'-terminale ende, tæt på 3'-terminalenden, eller i midten af fragmentet (figur 5A). Forud for μTGGE-analysen blev smeltemønstrene for det ikke-redigerede fragment og tre redigerede fragmenter forudsagt ved hjælp af det webbaserede værktøj uMelt HETS. Denne analyse viste, at C-til-U-modifikationen forventedes at flytte smeltekurven til venstre langs temperaturaksen (figur 5B). PaSS-værdierne beregnet ud fra μTGGE-analyser af de ikke-redigerede og de tre redigerede fragmenter blev ordnet som følger: 5'-terminal end RNA-redigering < 3'-terminal end RNA-redigering < centrum af 5'- og 3'-terminale ender RNA-redigering (figur 5C). Især var disse PaSS-værdier i overensstemmelse med de resultater, der blev forudsagt ved hjælp af uMelt. Disse resultater indikerer, at nukleotidbaseforskelle placeret ved den 5'- eller 3'-terminale ende resulterer i større variationer mellem PaSS-værdierne for redigerede og ikke-redigerede gener end nukleotidbaseforskelle placeret mere centralt. Derudover tyder disse resultater på, at forudgående viden om forskellene mellem smelteprofilerne for redigerede og ikke-redigerede gener kan bruges som en vejledning til optimering af genfragmenter til RNA-redigering.
Figur 1: Den procedure, der anvendes til at identificere RNA-redigering ved μTGGE. (A) De undersøgte typer af RNA-redigeringshændelser. B) En skematisk illustration af de typiske smelteprofiler for redigerede og ikke-redigerede gener. I μTGGE migrerer en prøve gennem en temperaturgradientgel, hvilket giver en karakteristisk krumning. Funktionspunkterne i smeltemønsteret tildeles og behandles derefter for at beregne en PaSS-værdi (Pattern Similarity Score). PaSS-beregningen udføres som vist i ligningen, hvor vektoren P for hvert funktionspunkt er i sin tilsvarende position og funktionen af temperatur og mobilitet (dvs. vektor P = P (T, m)). Overskrifterne (1) og (2) repræsenterer henholdsvis de redigerede og ikke-redigerede gener. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Illustrationer og fotografier af gelelektroforeseanordningen i håndfladestørrelse. (A) Samling af de tre 1 i gelkassetter. (B) Illustration af gelkassetteholderen med temperaturgradientpladen. Fotografiet viser positionerne for de øvre og nedre bufferpuder samt placeringen af prøven efter første indlæsning. (C) Oversigt over det komplette system, herunder strømforsyningen, vandret gelelektroforeseplatform og gelbilleddannelsessystem. Dette system giver en levedygtig løsning til hurtige polyacrylamidgelelektroforesebaserede analyser på stedet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: TGGE-analyser af enkeltnukleotidændringer i RNA-redigeringshændelser. Smelteprofiler for tre forskellige RNA-redigeringstyper blev undersøgt ved hjælp af fire gener. (A) C-til-U RNA-redigering i BFP udtrykt i HEK293T-celler. (B) A-til-I(G)RNA-redigering i EGFP udtrykt i HEK293T-celler. (C) U-til-C RNA-redigering i AT2G16586-genet fra A. thaliana. (D) U-til-C RNA-redigering i AT5G02670-genet fra A. thaliana. Placeringen af de redigerede websteder fremhæves med gul (med rød skrifttype), og grundpositionerne understreges. Forskellene mellem smeltemønstrene for de redigerede og ikke-redigerede prøver er angivet med røde cirkler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: De gennemsnitlige PaSS-værdier for de fire redigerede gener, der undersøges her. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelsen for tre replikater. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Positionsspecifik PaSS-analyse. (A) C-to-U-type RNA-redigeringsstedet i BFP-genet udtrykt i HEK293T-celler blev forskudt til 5'-terminalenden, 3'-terminalenden eller midten af genfragmentet. (B) Teoretisk forudsigelse af smeltemønstrene for de ikke-redigerede og tre redigerede fragmenter vist i (A). Forudsigelserne blev udført ved hjælp af uMelt. (C) De gennemsnitlige PaSS-værdierfor de redigerede gener, der er vist i (A). Fejllinjer repræsenterer standardafvigelsen for tre replikater. Klik her for at se en større version af denne figur.
| S.No | RNA-redigering | Kilde | Position | Gen-ID | Fremadrettet primer | Omvendt primer | Sekvens længde | ||
| 1 | C-til-U | HEK293T-celler | 48. plads | EGFP | AAGCTGACCC TGAAGTTCATC |
GCTGTTGTAGT TGTACTCCAGC |
324 | ||
| 2 | A-til-I | HEK293T-celler | 59. plads | EGFP | AGGGCGATGC CACCTACGGCA |
CCGTCCTCCT TTAAGTCGA |
300 | ||
| 3 | U-til-C | Arabidopsis | 152. plads | SVENDBORG, SVENDBORG | GGGCGATGTT ACGCTCGATGA |
GTGAAGAGTAA CATGGCGTT |
301 | ||
| 4 | U-til-C | Arabidopsis | 169. plads | 4 PENGE. | CCAGTTGGCAG AATCCAGTCA |
CTAGCTTCCAC TGTTGAGATTC |
300 | ||
Tabel 1: Liste over gener, der anvendes i den nuværende protokol
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RNA-redigering spiller en vigtig rolle i biologi; Nuværende metoder til påvisning af RNA-redigering, såsom kromatografi og sekventering, giver imidlertid flere udfordringer på grund af deres høje omkostninger, overdrevne tidskrav og kompleksitet. Protokollen beskrevet her er en enkel, hurtig og omkostningseffektiv metode til påvisning af RNA-redigering, der bruger et bærbart, mikrosized, TGGE-baseret system. Dette system kan bruges til at skelne mellem redigerede og ikke-redigerede gener før Sanger-sekventering. Specifikt kan redigerede og ikke-redigerede gener med enkeltbasenukleotidmodifikationer differentieres baseret på ændringer i TGGE-smelteprofilerne. Da det indeholder 1 i geler, kræver systemet meget små mængder prøver og muliggør hurtig påvisning af forskelle mellem sekvenser. Derudover er protokollen beskrevet her meget let at følge for både eksperter og nybegyndere på området. Optimering af målgenfragmentet er afgørende for klar differentiering mellem redigerede og ikke-redigerede regioner, og denne proces forenkles i den nuværende protokol.
Denne protokol er kompatibel med multipleksanalyser ved hjælp af fluorescerende mærkede primere. Til kvantitative analyser kan ukendte RNA-prøver (redigerede eller ikke-redigerede) mærkes med grøn fluorescens og comigreres med en rød fluorescensmærket referencestandard (redigeret eller ikke-redigeret) under TGGE-analyse.
Ud over at demonstrere μTGGE-metodens evne til at detektere enkeltnukleotid-RNA-redigeringshændelser validerede vi også ligheden mellem det eksperimentelle resultat opnået ved anvendelse af μTGGE og et teoretisk resultat opnået for det samme genfragment ved anvendelse af uMELT. Desuden fandt vi, at nukleotidbaseforskelle placeret ved 5'- og 3'-terminalerne af genfragmenter producerer større forskelle i μTGGE-smelteprofiler (dvs. mindre PaSS-værdier) end dem, der er placeret mod midten af fragmenterne. Selvom den nuværende protokol er lovende, kan den være begrænset til analyse og påvisning af specifikke typer nukleotidmodifikationer under RNA-redigering. Yderligere optimering og udvikling af denne protokol til analyse af andre typer og / eller placeringer af RNA-redigering vil blive udført i vores kommende forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en Grant-in-Aid for Scientific Research fra Japan Society for the Promotion of Science (17H02204 og 18K19288). Ruchika blev økonomisk støttet af den japanske regering (MEXT-stipendium). Vi takker fru Radhika Biyani (Takagi Laboratory, JAIST) og Dr. Kirti Sharma (BioSeeds Corporation) for hjælp med elektroforeserelaterede eksperimenter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2U ExoI | Takara | 2650A | Exonuclease I |
| 40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1) | Thermo fisher | AM9022 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Thermo Fisher | 17874 | |
| Centrifuge Mini spin | eppendorf | 5452000034 | |
| Digital dry bath/ block heater | Thermo fisher | NA | |
| Gold Taq Polymerase Master mixture | Promega | M7122 | |
| LATaq DNA polymerase | TAKARA | RR002A | Taq Polymerase |
| micro-TGGE cassette holder | BioSeeds Corp. | BS-GE-CH | |
| micro-TGGE apparatus | Lifetech Corp. | TG | |
| micro-TGGE gel cassette | BioSeeds Corp. | BS-TGGE-C | |
| NanoDrop 1000 | Thermo fisher | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Plant Rneasy Mini kit | Qiagen | 74904 | |
| ReverTra Ace Master Mix | TOYOBO | TRT101 | M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | Takara | 2660B | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Thermo fisher | S11494 | |
| TBE buffer | Thermo fisher | B52 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai tesque | 33401-72 | |
| Urea, Nuclease and protease tested | Nacalai tesque | 35940-65 |
References
- Chateigner-Boutin, A. L., Small, I. A rapid high-throughput method for the detection and quantification of RNA editing based on high-resolution melting of amplicons. Nucleic Acids Research. 35 (17), 114 (2007).
- Chen, Y. C., et al. A real-time PCR method for the quantitative analysis of RNA editing at specific sites. Analytical Biochemistry. 375 (1), 46-52 (2008).
- Barbon, A., Vallini, I., La Via, L., Marchina, E., Barlati, S. Glutamate receptor RNA editing: a molecular analysis of GluR2, GluR5 and GluR6 in human brain tissues and in NT2 cells following in vitro neural differentiation. Molecular Brain Research. 117 (2), 168-178 (2003).
- Gallo, A., Thomson, E., Brindle, J., O'Connell, M. A., Keegan, L. P. Micro-processing events in mRNAs identified by DHPLC analysis. Nucleic Acids Research. 30 (18), 3945-3953 (2002).
- Schiffer, H. H., Heinemann, S. F. A Quantitative method to detect RNA editing events. Analytical Biochemistry. 276 (2), 257-260 (1999).
- Burns, C. M., et al. Regulation of serotonin-2C receptor G-protein coupling by RNA editing. Nature. 387 (6630), 303-308 (1997).
- Marian, A. J.
- Bird, A. Genome biology: Not drowning but waving. Cell. 154 (5), 951-952 (2013).
- Jones, B. M., Knapp, L. A. Temporal temperature gradient electrophoresis for detection of single nucleotide polymorphisms. Methods in Molecular Biology. 578, Clifton, N.J. 153-165 (2009).
- Riesner, D., et al. Temperature-gradient gel electrophoresis of nucleic acids: analysis of conformational transitions, sequence variations, and protein-nucleic acid interactions. Electrophoresis. 10 (5-6), 377-389 (1989).
- Biyani, M., Nishigaki, K. Hundred-fold productivity of genome analysis by introduction of micro-temperature gradient gel electrophoresis. Electrophoresis. 22 (1), 23-28 (2001).
- Rathore, H., Biyani, R., Kato, H., Takamura, Y., Biyani, M. Palm-size and one-inch gel electrophoretic device for reliable and field-applicable analysis of recombinase polymerase amplification. Analytical Methods. 11 (39), 4969-4976 (2019).
- Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
- Bhakta, S., Sakari, M., Tsukahara, T. RNA editing of BFP, a point mutant of GFP, using artificial APOBEC1 deaminase to restore the genetic code. Scientific Reports. 10 (1), 17304 (2020).
- Azad, T. A., Qulsum, U., Tsukahara, T. Comparative activity of adenosine deaminase acting on RNA (ADARs) isoforms for correction of genetic code in gene therapy. Current Gene Therapy. 19 (1), 31-39 (2019).
- Ruchika, O. C., Sakari, M., Tsukahara, T. Genome-wide identification of U-To-C RNA editing events for nuclear genes in Arabidopsis thaliana. Cells. 10 (3), 635 (2021).
- Tsukahara, T. The U-to-C RNA editing affects the mRNA stability of nuclear genes in Arabidopsis thaliana. Biochemical and Biophysical Research Communications. 571, 110-117 (2021).
