Summary
Il rilevamento rapido e la quantificazione affidabile degli eventi di modifica dell'RNA su scala genomica rimangono impegnativi e attualmente si basano su metodi di sequenziamento diretto dell'RNA. Il protocollo qui descritto utilizza l'elettroforesi su gel a gradiente di microtemperatura (μTGGE) come metodo semplice, rapido e portatile per rilevare l'editing dell'RNA.
Abstract
L'editing dell'RNA è un processo che porta ad alterazioni della sequenza posttrascrittiva negli RNA. Il rilevamento e la quantificazione dell'editing dell'RNA si basano principalmente sulle tecniche di sequenziamento Sanger e di sequenziamento dell'RNA. Tuttavia, questi metodi possono essere costosi e dispendiosi in termini di tempo. In questo protocollo, un sistema portatile di elettroforesi su gel a gradiente di microtemperatura (μTGGE) viene utilizzato come approccio non sequenziale per il rilevamento rapido dell'editing dell'RNA. Il processo si basa sul principio dell'elettroforesi, che utilizza alte temperature per denaturare i campioni di acido nucleico mentre si muovono attraverso un gel di poliacrilammide. Attraverso una gamma di temperature, un frammento di DNA forma un gradiente di DNA completamente a doppio filamento in filamenti parzialmente separati e quindi in DNA a singolo filamento completamente separato. I siti modificati con RNA con basi nucleotidiche distinte producono diversi profili di fusione nelle analisi μTGGE. Abbiamo usato l'approccio basato su μTGGE per caratterizzare le differenze tra i profili di fusione di quattro frammenti di RNA modificati e i loro corrispondenti frammenti non modificati (wild-type). I Pattern Similarity Score (PaSS) sono stati calcolati confrontando i pattern di banda prodotti dagli RNA modificati e non modificati e sono stati utilizzati per valutare la riproducibilità del metodo. Nel complesso, la piattaforma qui descritta consente il rilevamento anche di singole mutazioni di base negli RNA in modo diretto, semplice ed economico. Si prevede che questo strumento di analisi aiuterà i nuovi risultati della biologia molecolare.
Introduction
Le varianti a singolo nucleotide (SNV) nell'RNA genomico, comprese le varianti A-to-I, C-to-U e U-to-C, possono indicare eventi di modifica dell'RNA. Tuttavia, il rilevamento di SNV nell'RNA rimane un compito tecnicamente impegnativo. Convenzionalmente, il rapporto tra RNA modificato e non modificato è determinato dal sequenziamento diretto, dalla reazione a catena della polimerasi in tempo reale (PCR) specifica per l'allele o dalla cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) che si avvicinaa 1,2,3,4,5,6. Tuttavia, questi approcci non sono particolarmente efficaci in termini di tempo o di costi e le loro basse precisioni, causate da alti livelli di rumore, pongono colli di bottiglia tecnologici per il rilevamento SNV basato su RNA 7,8. Qui, descriviamo un protocollo basato sull'elettroforesi su gel a gradiente di temperatura (TGGE) per identificare i polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) come metodo alternativo che elimina la necessità di approcci diretti di sequenziamento dell'RNA alle analisi di editing dell'RNA.
L'elettroforesi è un metodo preferito per la separazione e l'analisi delle biomolecole nei laboratori di scienze della vita. TGGE consente la separazione di frammenti di DNA a doppio filamento che hanno le stesse dimensioni ma hanno sequenze diverse. La tecnica si basa sulle differenze legate alla sequenza nelle temperature di fusione dei frammenti di DNA e sui successivi cambiamenti nella loro mobilità in gel porosi con un gradiente di temperatura lineare 9,10. La fusione di frammenti di DNA genera specifici profili di fusione. Una volta che il dominio con la temperatura di fusione più bassa raggiunge la temperatura corrispondente in una particolare posizione nel gel, si verifica la transizione da una struttura elicoidale a una struttura parzialmente fusa e la migrazione della molecola si fermerà praticamente. Pertanto, TGGE utilizza sia la mobilità (informazioni sulle dimensioni) che le transizioni strutturali indotte dalla temperatura dei frammenti di DNA (informazioni dipendenti dalla sequenza), rendendolo un potente approccio alla caratterizzazione dei frammenti di DNA. I punti caratteristici in un modello di fusione TGGE, che corrispondono a tre transizioni strutturali della molecola di DNA, sono il punto di dissociazione iniziale del filamento, il punto di dissociazione medio del filamento e il punto di dissociazione finale del filamento (Figura 1). Le variazioni di sequenza all'interno dei domini, anche le differenze a base singola, influenzano la temperatura di fusione, quindi le molecole con sequenze diverse mostreranno modelli di fusione discreti (denaturazione) nelle analisi TGGE. Pertanto, TGGE può essere utilizzato per analizzare gli SNV nell'RNA genomico e può essere un metodo inestimabile ad alto rendimento per rilevare l'editing dell'RNA. Questo guadagno ad alta produttività viene perso quando si utilizza il tradizionale TGGE basato sull'elettroforesi su gel. Tuttavia, una versione miniaturizzata di TGGE, denominata microTGGE (μTGGE), può essere utilizzata per abbreviare il tempo elettroforetico del gel e accelerare l'analisi con un aumento di 100 volte della produttività11. La semplicità e la compattezza del metodo μTGGE sono state migliorate dall'introduzione di PalmPAGE12, un sistema di elettroforesi su gel applicabile sul campo, portatile e conveniente.
Qui, un nuovo protocollo basato su TGGE viene utilizzato per esaminare tre tipi di siti di editing dell'RNA (A-to-I, C-to-U e U-to-C) in quattro geni, tra cui due da tessuti Arabidopsis thaliana e due espressi in cellule HEK293 di mammiferi (Figura 1A). Il protocollo integra l'uso di PalmPAGE (hardware), un sistema portatile per il rilevamento rapido dell'editing dell'RNA, e uMelt (software)13. Con un tempo di esecuzione medio di 15-30 minuti, questo protocollo consente un'identificazione rapida, affidabile e facile dell'editing dell'RNA senza la necessità di approcci diretti di sequenziamento dell'RNA.
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Protocol
1. Ottimizzazione del frammento target
NOTA: Quattro geni modificati sono stati utilizzati nello sviluppo di questo protocollo, tra cui due geni nucleari (AT2G16586 e AT5G02670) di A. thaliana e i geni che codificano per la proteina fluorescente blu (BFP) e la proteina fluorescente verde potenziata (EGFP) espressa nelle cellule HEK293.
- Per identificare frammenti di geni con diversi profili di fusione, che rappresentano regioni modificate rispetto a quelle non modificate, generare curve di fusione previste utilizzando lo strumento basato sul web uMelt HETS, un'estensione del software uMeltoriginale 13.
NOTA: questo strumento prevede le forme delle curve di fusione per i prodotti heteroduplex e homoduplex. - Per ogni gene bersaglio, progettare tre coppie di frammenti genici (300-324 bp di lunghezza). Ogni coppia comprende un frammento con un sito modificato e un corrispondente frammento wild-type con un sito non modificato, situato all'estremità 5'-terminale, posizione centrale o 3'-terminale.
- Selezionate la coppia non modificata/modificata che ha mostrato la differenza massima tra le regioni di fusione sull'asse dell'elicità per un'ulteriore analisi. Per l'analisi μTGGE, sintetizzare il frammento genetico selezionato mediante amplificazione PCR, come descritto nella sezione 2 di seguito.
- Progettare i primer avanti e indietro utilizzando il software DNADynamo (https://www.bluetractorsoftware.com/DynamoDemo.htm) e verificare utilizzando lo strumento NCBI Primer-BLAST.
- Diluire i primer in tampone TE (10 mM Tris-HCl contenente 1 mM EDTA· Na2) e conservarli ad una concentrazione di 100 pmol/μL. Prima dell'uso, diluire ogni primer impostato ad una concentrazione di 10 pmol/μL utilizzando acqua distillata.
2. Estrazione dell'RNA e amplificazione RT-PCR del frammento bersaglio
- Estrazione dell'RNA
- Estrarre l'RNA totale dalla fonte di geni modificati e non modificati utilizzando metodi standard, come l'estrazione di TRIzol14 o kit disponibili in commercio.
- Eseguire la sintesi del cDNA corrispondente utilizzando un protocollo RT-PCR standard come descritto nel passaggio 2.2.
- Trascrizione inversa
- Aggiungere 1 μL di primer oligo(dT), 1 μL di miscela dNTP da 10 mM, 10 μL di RNA totale e 10 μL di acqua distillata sterile in un tubo microcentrifugato privo di nucleasi.
- Riscaldare la miscela a 65 °C per 5 minuti e poi incubare sul ghiaccio per almeno 1 minuto.
- Raccogliere il contenuto del tubo mediante centrifugazione alla massima velocità (12.000 x g) per 2-3 s e aggiungere 4 μL di 5x tampone ReverTra Ace, 1 μL di 0,1 M DTT e 1 μL di M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) trascrittasi inversa (200 U/μL, Tabella dei materiali).
- Mescolare pipettando su e giù delicatamente. Se si utilizzano primer casuali, incubare il tubo a 25 °C per 5 minuti.
- Incubare il tubo a 55 °C per 60 minuti e quindi inattivare la reazione riscaldando a 70 °C per 15 minuti, in un bagno secco digitale/riscaldatore a blocchi.
- Misurare la concentrazione di cDNA utilizzando uno spettrofotometro e memorizzarla a -25 °C.
-
Amplificazione PCR e sequenziamento confermativo dei prodotti
- Aggiungere i seguenti reagenti a un tubo di microcentrifuga senza nucleasi: 4 μL di 5x Taq Polymerase Buffer, 2 μL di 2 mM dNTP mix, 2 μL di 25 mM MgCl2, 1,6 μL del set di primer (avanti e indietro; ciascuno 10 mM), 2 μL di modello di cDNA, 0,1 μL di Taq polimerasi (2,5 U/μL) e 8,3 μL di acqua distillata sterile (volume finale, 20 μL).
- Eseguire pcr con le seguenti condizioni di ciclo: denaturazione iniziale a 95 °C per 2 min; 35 cicli di denaturazione a 95 °C per 2 min, ricottura ad una temperatura adeguata (a seconda del set di primer specifico utilizzato) per 30 s, ed estensione a 72 °C per 2 min; e poi un'estensione finale a 72 °C per 7 min.
- Per purificare i prodotti PCR, aggiungere 2 U di esonucleasi I e 0,5 U di fosfatasi alcalina di gamberetti (ExoSAP). Incubare il tubo in un termociclatore a 37 °C per 1 ora, seguito da 80 °C per 15 minuti, quindi mantenere a 4 °C fino alla fase successiva.
- Per il sequenziamento di conferma, aggiungere 11,5 μL di acqua distillata sterile, 2,5 μL di primer avanti o indietro e 1 μL di prodotti PCR (con ExoSAP) a un nuovo tubo microcentrifuga.
NOTA: Utilizzare i servizi di sequenziamento del DNA (ad esempio, Eurofins Genomics) per l'analisi del sequenziamento. - Per convalidare la specificità dei prodotti PCR, eseguire il sequenziamento con primer sia in avanti che in retromarcia. Le coppie di primer utilizzate nell'analisi rappresentativa sono riportate nella Tabella 1.
- Diluire i prodotti PCR purificati ad una concentrazione di 200 ng/μL con acqua deionizzata. Quindi, mescolare 6 μL del prodotto purificato con 3 μL di colorante di carico gel 6x in un tubo da 250 μL e aumentare il volume totale a 12 μL con acqua sterile. Conservare il prodotto PCR (a -25 °C) fino al momento di procedere con μTGGE come descritto di seguito.
3. Analisi μTGGE
NOTA: L'analisi μTGGE viene eseguita utilizzando un sistema miniaturizzato ed economico. Una panoramica del sistema completo, comprese le cassette in gel, il supporto per cassette in gel, la piattaforma orizzontale per elettroforesi in gel, l'alimentatore e il sistema di imaging in gel, è mostrata nella Figura 2.
- Assemblaggio delle cassette di gel
- La cassetta di gel utilizzata per l'analisi μTGGE è mostrata nella Figura 2A. Il design è costituito da tre piastre di gel da 1 pollice: una piastra gel inferiore, una piastra gel superiore e una piastra lane-former. Inserire la piastra di gel superiore tra le altre due piastre e assemblare nel supporto della cassetta di gel per la polimerizzazione del gel.
- Preparazione del gel di poliacrilammide
- Aggiungere 7,2 g di urea in un tubo da 50 ml e sciogliere in 10 ml di acqua sterile. Riscaldare il campione in un forno a microonde per 20-30 s e poi portarlo a temperatura ambiente (RT).
- Aggiungere alla soluzione 3 mL di tampone Tris/borato/EDTA (TBE) (Tabella dei materiali), 2,25 mL di acrilammide/bis al 40% (p/v) (19:1), 75 μL di 10x persolfato di ammonio e 15 μL di tetrametiletilendiammina.
- Versare immediatamente la soluzione gel nel supporto della cassetta di gel lentamente, evitando la formazione di bolle d'aria.
- Generazione di profili di fusione utilizzando l'unità μTGGE
- Utilizzare la versione miniaturizzata ed economica dell'apparato μTGGE mostrata in Figura 2 con un gradiente di temperatura (25-65 °C) impostato perpendicolarmente alla direzione di migrazione del DNA.
- Immergere i tamponi per elettroforesi superiore e inferiore (0,5 cm x 2,5 cm) in 2 mL di 1x tampone TBE.
- Posizionare la cassetta di gel nell'unità della camera di elettroforesi orizzontale e posizionare di conseguenza i tamponi superiore e inferiore, come mostrato nella Figura 2.
- Quindi, caricare 10 μL del prodotto PCR nel pozzetto centrale (più lungo) e 1 μL del prodotto PCR in ciascun pozzetto laterale.
- Dopo un'attesa di 1 minuto, collegare l'unità di alimentazione e fornire 100 V per 12 minuti a un gradiente di temperatura lineare da 25-65 °C.
- Al termine della corsa, estrarre la cassetta e rimuovere il coperchio superiore in vetro.
- Versare 300 μL di 10x SYBR Gold macchia sul gel. Visualizza i profili di fusione utilizzando la torcia a LED blu installata nel dispositivo elettroforetico delle dimensioni di un palmo.
NOTA: è necessario salvare un file soft dell'immagine gel per il calcolo del punteggio di somiglianza del modello (PaSS). - Ripeti ogni esperimento elettroforetico 3 volte per confermare la riproducibilità dei dati.
4. Calcoli PaSS
NOTA: i calcoli vengono eseguiti utilizzando il software μTGGE Analyzer.
- Scarica e apri il software.
- Aprire il file JPEG contenente l'immagine gel. Si noti che il software accetta solo file in formato JPEG.
- Fare clic sul pulsante Frame e selezionare l'area appropriata (frame) dell'immagine gel.
- Fate clic sul pulsante Correzione coordinate (Coordinate Correction ) e aggiungete due punti di riferimento, come illustrato nella Figura 1B.
- Fate clic sul pulsante Aggiunta punti feature (Addition of Feature Points ) e aggiungete punti campione come illustrato nella Figura 1B. Quindi salvare i dati dell'immagine gel elaborati in formato μTGGE (*.tgg).
- Fare clic sul pulsante Campione e selezionare l'opzione Cerca punti semplici per confrontare due o più immagini.
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Representative Results
Uso di μTGGE per identificare i cambiamenti della base a singolo nucleotide negli eventi di modifica dell'RNA
Quattro geni modificati sono stati utilizzati per questo protocollo (Tabella 1), incluso il gene BFP prodotto in cellule HEK293 (con editing C-to-U RNA da parte degli enzimi deaminasi del complesso enzimatico di editing dell'mRNA apolipoproteina B; APOBEC115), il gene EGFP contenente il codone di arresto ocra (TAA) prodotto in cellule HEK293 (con editing dell'RNA A-to-I mediante adenosina deaminasi che agisce sull'RNA 1; ADAR116) e i geni nucleari AT2G16586 e AT5G02670 in A. thaliana17,18 (con editing dell'RNA U-to-C). Le differenze di singolo nucleotide tra i campioni modificati e corrispondenti non modificati sono state confermate dal sequenziamento del DNA. Quindi è stata eseguita un'analisi μTGGE per esaminare le differenze tra le curve di fusione dei campioni (Figura 3).
Per il tipo di modifica dell'RNA da C a U, il campione non modificato con la base C originale ha mostrato un modello di fusione più lungo al punto di fusione finale del filamento rispetto al campione modificato con la base U modificata (Figura 3A). Per il tipo di modifica dell'RNA da A a I(G), il campione modificato con la base I(G) modificata mostrava un modello di fusione più lungo al punto di fusione finale del filamento rispetto al campione non modificato con la base A originale (Figura 3B). Per il tipo di editing dell'RNA U-to-C "inverso", sono stati analizzati due geni. Per il gene AT2G16586, il campione modificato con la base C modificata ha mostrato un modello di fusione più lungo tra i punti di fusione iniziale del filamento e i punti di fusione finale del filamento rispetto al campione non modificato con la base U originale (Figura 3C). Tuttavia, un modello simile non è stato osservato per l'altro gene AT5G02670 (Figura 3D). Tuttavia, c'era una netta differenza tra i tipi non modificati e modificati al punto di fusione finale. Ciò dimostra che l'osservazione chiara dei profili di fusione è un passo importante nella distinzione tra tipi non modificati e modificati.
Analisi quantitativa dei modelli di fusione μTGGE che rappresentano eventi di editing dell'RNA
Successivamente, abbiamo calcolato i valori PaSS11 per valutare la riproducibilità dei profili di fusione basati su μTGGE che rappresentano i quattro eventi di modifica dell'RNA sopra descritti. Il valore PaSS fornisce una misura di quanto strettamente due modelli di fusione possono essere sovrapposti, generando un valore più alto (massimo: 1) per modelli di fusione altamente simili. Pertanto, i valori PaSS per i confronti di campioni non modificati e modificati dovrebbero essere inferiori a uno. Come mostrato nella Figura 1B, i punti caratteristici dei modelli di fusione che corrispondevano alle transizioni strutturali dal DNA a doppio filamento al DNA a singolo filamento sono stati utilizzati per calcolare i valori paSS. Per eliminare le variabili sperimentali, la normalizzazione assistita da computer è stata eseguita utilizzando due punti di riferimento interni: il punto di riferimento #1, che rappresenta la posizione del campione in forma a doppio filamento (la corsia più a sinistra), e il punto di riferimento #2, che rappresenta la posizione del campione in forma a singolo filamento (la corsia più a destra). Le coordinate dei feature point sono state normalizzate a quelle dei punti di riferimento interni e sono state quindi utilizzate per calcolare i valori PaSS. Ogni esperimento è stato ripetuto tre volte ed è stato determinato il valore medio. Come previsto, i valori PaSS dei quattro campioni modificati erano inferiori a uno (Figura 4). I valori PaSS dei tipi di editing dell'RNA C-to-you e A-to-I erano inferiori a quelli dei due tipi di editing dell'RNA U-to-C. Questa differenza è probabilmente correlata alle rispettive posizioni dei siti di modifica. In particolare, i siti modificati da C-to-you e A-to-I si trovavano relativamente vicino alle estremità terminali 5' (rispettivamente alle posizioni 48 e 59 dei frammenti da ~ 300 bp), mentre i siti modificati da U a C si trovavano vicino al centro dei frammenti (alle posizioni 152 e 169). Questi risultati suggeriscono che i siti modificati situati nelle posizioni terminali possono essere rilevati utilizzando μTGGE più facilmente di quelli situati verso il centro dei frammenti.
Ottimizzazione dei modelli di fusione TGGE per identificare gli eventi di modifica dell'RNA
Poiché i nostri risultati precedenti suggerivano che il valore paSS può variare a seconda della posizione specifica del sito di editing dell'RNA, abbiamo esaminato le differenze tra i modelli di fusione di un frammento di 300 bp del gene BFP (espresso in cellule HEK293T) in cui un sito modificato da C a U si trovava vicino all'estremità terminale 5', vicino all'estremità terminale 3', o al centro del frammento (Figura 5A). Prima dell'analisi μTGGE, i modelli di fusione del frammento non modificato e di tre frammenti modificati sono stati previsti utilizzando lo strumento basato sul web uMelt HETS. Questa analisi ha mostrato che la modifica da C a U dovrebbe spostare la curva di fusione a sinistra lungo l'asse della temperatura (Figura 5B). I valori PaSS calcolati dalle analisi μTGGE dei frammenti non modificati e dei tre modificati sono stati ordinati come segue: 5'-terminal end RNA edit < 3'-terminal end RNA edit < center of 5'- and 3'-terminal ends RNA edit (Figura 5C). In particolare, questi valori PaSS erano coerenti con i risultati previsti utilizzando uMelt. Questi risultati indicano che le differenze di base nucleotidica situate all'estremità terminale di 5' o 3' si traducono in variazioni maggiori tra i valori PaSS di geni modificati e non modificati rispetto alle differenze di base nucleotidica localizzate più centralmente. Inoltre, questi risultati suggeriscono che la conoscenza preliminare delle differenze tra i profili di fusione di geni modificati e non modificati può essere utilizzata come guida per ottimizzare i frammenti genici per l'editing dell'RNA.
Figura 1: La procedura utilizzata per identificare l'editing dell'RNA mediante μTGGE. (A) I tipi di eventi di modifica dell'RNA esaminati. (B) Un'illustrazione schematica dei tipici profili di fusione di geni modificati e non modificati. In μTGGE, un campione migra attraverso un gel con gradiente di temperatura, producendo una curvatura caratteristica. I punti feature del modello di fusione vengono assegnati e quindi elaborati per calcolare un valore PaSS (Pattern Similarity Score). Il calcolo PaSS viene eseguito come mostrato nell'equazione, dove il vettore P di ciascun punto caratteristica si trova nella sua posizione corrispondente e la funzione di temperatura e mobilità (cioè vettore P = P (T, m)). Gli apici (1) e (2) rappresentano rispettivamente i geni modificati e non modificati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Illustrazioni e fotografie del dispositivo di elettroforesi su gel delle dimensioni di un palmo. (A) Assemblaggio delle tre cassette in gel 1. (B) Illustrazione del portacassette in gel con la piastra del gradiente di temperatura. La fotografia mostra le posizioni dei tamponi superiore e inferiore, nonché quella del campione dopo il caricamento iniziale. (C) Panoramica del sistema completo, compreso l'alimentatore, la piattaforma orizzontale di elettroforesi su gel e il sistema di imaging su gel. Questo sistema fornisce una soluzione praticabile per analisi rapide in loco basate sull'elettroforesi su gel di poliacrilammide. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi TGGE dei cambiamenti del singolo nucleotide negli eventi di editing dell'RNA. I profili di fusione per tre diversi tipi di editing dell'RNA sono stati esaminati utilizzando quattro geni. (A) Editing dell'RNA C-to-U in BFP espresso in cellule HEK293T. (B) Editing dell'RNA da A a I(G) in EGFP espresso in cellule HEK293T. (C) Modifica dell'RNA U-to-C nel gene AT2G16586 da A. thaliana. (D) Modifica dell'RNA U-to-C nel gene AT5G02670 di A. thaliana. Le posizioni dei siti modificati sono evidenziate in giallo (con carattere rosso) e le posizioni di base sono sottolineate. Le differenze tra i modelli di fusione dei campioni modificati e non modificati sono indicate da cerchi rossi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: I valori medi di PaSS per i quattro geni modificati esaminati qui. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard di tre repliche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Analisi PaSS specifica della posizione. (A) Il sito di editing dell'RNA di tipo C-U nel gene BFP espresso nelle cellule HEK293T è stato spostato all'estremità 5'-terminale, all'estremità 3'-terminale o al centro del frammento genico. (B) Previsione teorica dei modelli di fusione dei frammenti non modificati e dei tre frammenti modificati mostrati in (A). Le previsioni sono state eseguite utilizzando uMelt. (C) I valori medi di PaSSdei geni modificati mostrati in (A). Le barre di errore rappresentano la deviazione standard di tre repliche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| S.No | Modifica dell'RNA | Fonte | Posizione | Gene ID | Primer in avanti | Primer inverso | Lunghezza della sequenza | ||
| 1 | C-a-U | Celle HEK293T | 48° | EGFP | AAGCTGACCC TGAAGTTCATC |
GCTGTTGTAGT TGTACTCCAGC |
324 | ||
| 2 | Dalla A alla I | Celle HEK293T | 59° | EGFP | AGGGCGATGC CACCTACGGCA |
CCGTCCTCCT TTAAGTCGA |
300 | ||
| 3 | U-to-C | Arabidopsis | 152° | AT2G16586 | GGGCGATGTT ACGCTCGATGA |
GTGAAGAGTAA CATGGCGTT |
301 | ||
| 4 | U-to-C | Arabidopsis | 169y | AT5G02670 | CCAGTTGGCAG AATCCAGTCA |
CTAGCTTCCAC TGTTGAGATTC |
300 | ||
Tabella 1: Elenco dei geni utilizzati nel protocollo corrente
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Discussion
L'editing dell'RNA svolge un ruolo importante in biologia; tuttavia, gli attuali metodi di rilevamento dell'editing dell'RNA, come la cromatografia e il sequenziamento, presentano diverse sfide a causa del loro costo elevato, dei requisiti di tempo eccessivi e della complessità. Il protocollo qui descritto è un metodo semplice, rapido ed economico per rilevare l'editing dell'RNA che utilizza un sistema portatile, microdimensionato, basato su TGGE. Questo sistema può essere utilizzato per distinguere tra geni modificati e non modificati prima del sequenziamento Sanger. In particolare, i geni modificati e non modificati con modificazioni nucleotidiche a base singola possono essere differenziati in base ai cambiamenti nei profili di fusione TGGE. Poiché incorpora 1 nei gel, il sistema richiede quantità molto piccole di campioni e consente un rapido rilevamento delle differenze tra le sequenze. Inoltre, il protocollo qui descritto è molto facile da seguire sia per gli esperti che per i nuovi arrivati nel campo. L'ottimizzazione del frammento del gene bersaglio è fondamentale per una chiara differenziazione tra regioni modificate e non modificate, e questo processo è semplificato nel protocollo attuale.
Questo protocollo è compatibile con le analisi multiplex che utilizzano primer con tag fluorescenti. Per le analisi quantitative, i campioni di RNA sconosciuti (modificati o non modificati) possono essere contrassegnati con fluorescenza verde e mescolati con uno standard di riferimento con fluorescenza rossa (modificato o non modificato) durante l'analisi TGGE.
Oltre a dimostrare la capacità del metodo μTGGE di rilevare eventi di modifica dell'RNA a singolo nucleotide, abbiamo anche convalidato la somiglianza tra il risultato sperimentale ottenuto utilizzando μTGGE e un risultato teorico ottenuto per lo stesso frammento genico utilizzando uMELT. Inoltre, abbiamo scoperto che le differenze di base nucleotidica situate ai terminali 5'- e 3'- dei frammenti genici producono differenze maggiori nei profili di fusione μTGGE (cioè valori PaSS più piccoli) rispetto a quelli situati verso il centro dei frammenti. Sebbene promettente, l'attuale protocollo può essere limitato all'analisi e al rilevamento di specifici tipi di modificazioni nucleotidiche durante l'editing dell'RNA. Un'ulteriore ottimizzazione e sviluppo di questo protocollo per analizzare altri tipi e / o posizioni di editing dell'RNA sarà eseguita nella nostra prossima ricerca.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione per la ricerca scientifica della Japan Society for the Promotion of Science (17H02204 e 18K19288). Ruchika è stato sostenuto finanziariamente dal governo giapponese (borsa di studio MEXT). Ringraziamo la signora Radhika Biyani (Takagi Laboratory, JAIST) e la dottoressa Kirti Sharma (BioSeeds Corporation) per l'aiuto con esperimenti relativi all'elettroforesi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2U ExoI | Takara | 2650A | Exonuclease I |
| 40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1) | Thermo fisher | AM9022 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Thermo Fisher | 17874 | |
| Centrifuge Mini spin | eppendorf | 5452000034 | |
| Digital dry bath/ block heater | Thermo fisher | NA | |
| Gold Taq Polymerase Master mixture | Promega | M7122 | |
| LATaq DNA polymerase | TAKARA | RR002A | Taq Polymerase |
| micro-TGGE cassette holder | BioSeeds Corp. | BS-GE-CH | |
| micro-TGGE apparatus | Lifetech Corp. | TG | |
| micro-TGGE gel cassette | BioSeeds Corp. | BS-TGGE-C | |
| NanoDrop 1000 | Thermo fisher | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Plant Rneasy Mini kit | Qiagen | 74904 | |
| ReverTra Ace Master Mix | TOYOBO | TRT101 | M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | Takara | 2660B | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Thermo fisher | S11494 | |
| TBE buffer | Thermo fisher | B52 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai tesque | 33401-72 | |
| Urea, Nuclease and protease tested | Nacalai tesque | 35940-65 |
References
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