Summary
Быстрое обнаружение и надежная количественная оценка событий редактирования РНК в геномном масштабе остаются сложными и в настоящее время полагаются на методы прямого секвенирования РНК. Протокол, описанный здесь, использует микротемпературный градиентный гель-электрофорез (μTGGE) в качестве простого, быстрого и портативного метода обнаружения редактирования РНК.
Abstract
Редактирование РНК — это процесс, который приводит к посттранскрипционным изменениям последовательности в РНК. Обнаружение и количественная оценка редактирования РНК в основном зависят от методов секвенирования Сэнгера и секвенирования РНК. Однако эти методы могут быть дорогостоящими и трудоемкими. В этом протоколе портативная система электрофореза геля с градиентной микротемпературой (μTGGE) используется в качестве несеквенирующего подхода для быстрого обнаружения редактирования РНК. Процесс основан на принципе электрофореза, который использует высокие температуры для денатурации образцов нуклеиновых кислот при их перемещении по полиакриламидному гелю. В диапазоне температур фрагмент ДНК образует градиент полностью двухцепочечной ДНК к частично разделенным нитям, а затем к полностью разделенной одноцепочечной ДНК. Отредактированные РНК участки с различными нуклеотидными основаниями производят различные профили плавления в анализах μTGGE. Мы использовали подход, основанный на μTGGE, для характеристики различий между профилями плавления четырех отредактированных фрагментов РНК и их соответствующими неотредактированными (дикого типа) фрагментами. Оценки сходства паттернов (PaSSs) рассчитывались путем сравнения полосовых паттернов, полученных отредактированными и неотредактированными РНК, и использовались для оценки воспроизводимости метода. В целом, платформа, описанная здесь, позволяет обнаруживать даже одноосновные мутации в РНК простым, простым и экономически эффективным способом. Ожидается, что этот инструмент анализа поможет новым выводам молекулярной биологии.
Introduction
Варианты одиночных нуклеотидов (SNV) в геномной РНК, включая варианты A-to-I, C-to-U и U-to-C, могут указывать на события редактирования РНК. Тем не менее, обнаружение SNV в РНК остается технически сложной задачей. Условно соотношение отредактированной и неотредактированной РНК определяется прямым секвенированием, аллель-специфической полимеразной цепной реакцией реального времени (ПЦР) или денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) приближается к 1,2,3,4,5,6. Однако эти подходы не являются особенно эффективными по времени или затратам, а их низкая точность, вызванная высоким уровнем шума, создает технологические узкие места для обнаружения SNV на основе РНК 7,8. Здесь мы описываем протокол, основанный на электрофорезе гель с температурным градиентом (TGGE) для идентификации однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в качестве альтернативного метода, который устраняет необходимость в подходах прямого секвенирования РНК к анализу редактирования РНК.
Электрофорез является предпочтительным методом разделения и анализа биомолекул в лабораториях наук о жизни. TGGE позволяет разделять двухцепочечные фрагменты ДНК, которые имеют одинаковый размер, но имеют разные последовательности. Метод опирается на связанные с последовательностями различия в температурах плавления фрагментов ДНК и последующие изменения их подвижности в пористых гелях с линейным градиентом температуры 9,10. Плавление фрагментов ДНК генерирует специфические профили плавления. Как только домен с наименьшей температурой плавления достигнет соответствующей температуры в определенном положении в геле, произойдет переход от спиральной структуры к частично расплавленной структуре, и миграция молекулы практически остановится. Таким образом, TGGE использует как мобильность (информация о размере), так и структурные переходы фрагментов ДНК, вызванные температурой (информация, зависящая от последовательности), что делает его мощным подходом к характеристике фрагментов ДНК. Точками признаков в паттерне плавления TGGE, которые соответствуют трем структурным переходам молекулы ДНК, являются точка начальной диссоциации цепи, точка средней диссоциации цепи и точка концевой диссоциации цепи (рисунок 1). Вариации последовательностей внутри доменов, даже одноосновные различия, влияют на температуру плавления, следовательно, молекулы с различными последовательностями будут демонстрировать дискретные модели плавления (денатурации) в анализах TGGE. Таким образом, TGGE может быть использован для анализа SNV в геномной РНК и может быть бесценным высокопроизводительным методом обнаружения редактирования РНК. Это увеличение высокой пропускной способности теряется при использовании традиционного TGGE на основе гелевого электрофореза. Однако миниатюрная версия TGGE, названная microTGGE (μTGGE), может быть использована для сокращения времени электрофоретики геля и ускорения анализа с 100-кратным увеличением производительности11. Простота и компактность метода μTGGE были улучшены благодаря внедрению PalmPAGE12, применимой в полевых условиях, портативной и доступной системы гелевого электрофореза.
Здесь новый протокол на основе TGGE используется для изучения трех типов сайтов редактирования РНК (A-to-I, C-to-U и U-to-C) в четырех генах, в том числе двух из тканей Arabidopsis thaliana и двух, экспрессируемых в клетках HEK293 млекопитающих (рисунок 1A). Протокол объединяет использование PalmPAGE (аппаратное обеспечение), портативной системы для быстрого обнаружения редактирования РНК, и uMelt (программное обеспечение)13. При среднем времени работы 15-30 мин этот протокол обеспечивает быструю, надежную и простую идентификацию редактирования РНК без необходимости применения подходов к прямому секвенированию РНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Оптимизация целевого фрагмента
ПРИМЕЧАНИЕ: При разработке этого протокола были использованы четыре отредактированных гена, в том числе два ядерных гена (AT2G16586 и AT5G02670) от A. thaliana, а также гены, кодирующие синий флуоресцентный белок (BFP) и улучшенный зеленый флуоресцентный белок (EGFP), экспрессируемый в клетках HEK293.
- Для идентификации фрагментов генов с различными профилями плавления, представляющих отредактированные и неотредактированные области, сгенерируйте прогнозируемые кривые плавления с помощью веб-инструмента uMelt HETS, расширения оригинального программного обеспечения uMelt13.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот инструмент предсказывает формы кривых плавления для гетеродуплексных и гомодуплексных продуктов. - Для каждого гена-мишени разработайте три пары фрагментов генов (300-324 bp в длину). Каждая пара состоит из фрагмента с отредактированным сайтом и соответствующего фрагмента дикого типа с неотредактированным сайтом, расположенного либо на 5'-концевом конце, в средней позиции, либо на 3'-концевом конце.
- Для дальнейшего анализа выберите неотредактированную/отредактированную пару, которая показала максимальную разницу между областями плавления на оси спиральности. Для анализа μTGGE синтезируют выбранный фрагмент гена путем амплификации ПЦР, как описано в разделе 2 ниже.
- Проектирование прямых и обратных праймеров с использованием программного обеспечения DNADynamo (https://www.bluetractorsoftware.com/DynamoDemo.htm) и проверка с помощью инструмента NCBI Primer-BLAST.
- Разбавить грунтовки в БУФЕРЕ ТЭ (10 мМ Tris-HCl, содержащем 1 мМ ЭДТА· Na2) и хранить их в концентрации 100 пмоль/мкл. Перед применением разбавляют каждую грунтовку, установленную до концентрации 10 пмоль/мкл, используя дистиллированную воду.
2. Экстракция РНК и Амплификация ОТ-ПЦР целевого фрагмента
- Экстракция РНК
- Извлекайте общую РНК из источника отредактированных и неотредактированных генов с использованием стандартных методов, таких как экстракция TRIzol14 или коммерчески доступных наборов.
- Выполняют синтез соответствующей кДНК с использованием стандартного протокола ОТ-ПЦР, как описано в шаге 2.2.
- Обратная транскрипция
- Добавьте 1 мкл олиго(dT) праймера, 1 мкл смеси dNTP 10 мМ, 10 мкл общей РНК и 10 мкл стерильной дистиллированной воды в микроцентрифужную трубку без нуклеазы.
- Нагревайте смесь при 65 °C в течение 5 мин, а затем инкубируйте на льду не менее 1 мин.
- Соберите содержимое трубки методом центрифугирования на максимальной скорости (12 000 х г) в течение 2-3 с и добавьте 4 мкл 5x буфера ReverTra Ace, 1 мкл 0,1 М DTT и 1 мкл M-MLV (вирус лейкемии мышей Молони) обратной транскриптазы (200 Ед/мкл, Таблица материалов).
- Аккуратно перемешайте, испешивая вверх и вниз. При использовании случайных грунтовок инкубируют трубку при 25 °C в течение 5 мин.
- Инкубируют трубку при 55 °C в течение 60 мин, а затем инактивируют реакцию нагреванием при 70 °C в течение 15 мин в цифровой сухой ванне/блочном нагревателе.
- Измерьте концентрацию кДНК с помощью спектрофотометра и храните ее при -25 °C.
-
Амплификация ПЦР и подтверждающее секвенирование продуктов
- Добавьте следующие реагенты в безнуклеазную микроцентрифужную трубку: 4 мкл 5x Taq Polymerase Buffer, 2 мкл смеси dNTP 2 мМ, 2 мкл 25 мМ MgCl2, 1,6 мкл праймерного набора (вперед и назад; каждые 10 мМ), 2 мкл шаблона кДНК, 0,1 мкл Taq полимеразы (2,5 ЕД/мкл) и 8,3 мкл стерильной дистиллированной воды (конечный объем, 20 мкл).
- Выполняют ПЦР при следующих условиях циклирования: начальная денатурация при 95 °C в течение 2 мин; 35 циклов денатурации при 95 °C в течение 2 мин, отжига при подходящей температуре (в зависимости от конкретного используемого набора грунтовки) в течение 30 с и удлинения при 72 °C в течение 2 мин; а затем окончательное расширение при 72 °C в течение 7 мин.
- Для очистки продуктов ПЦР добавляют 2 ЕД экзонуклеазы I и 0,5 ЕД щелочной фосфатазы креветок (ExoSAP). Инкубируют трубку в термоциклере при 37 °C в течение 1 ч, затем 80 °C в течение 15 мин, а затем выдерживают при 4 °C до следующей стадии.
- Для подтверждающего секвенирования добавьте 11,5 мкл стерильной дистиллированной воды, 2,5 мкл прямого или обратного праймера и 1 мкл продуктов ПЦР (с ExoSAP) в новую микроцентрифужную трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте услуги секвенирования ДНК (например, Eurofins Genomics) для анализа секвенирования. - Чтобы проверить специфичность продуктов ПЦР, выполните секвенирование как с прямыми, так и с обратными праймерами. Пары грунтовок, используемые в репрезентативном анализе, приведены в таблице 1.
- Очищенные продукты ПЦР разбавляют до концентрации 200 нг/мкл деионизированной водой. Затем смешайте 6 мкл очищенного продукта с 3 мкл 6-кратного гелевого нагрузочного красителя в пробирке объемом 250 мкл и увеличьте общий объем до 12 мкл стерильной водой. Хранить препарат ПЦР (при -25 °C) до готовности к приему μTGGE, как описано ниже.
3. Анализ μTGGE
ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ μTGGE выполняется с использованием миниатюрной и экономической системы. Обзор всей системы, включая гелевые кассеты, держатель для гелевых кассет, горизонтальную платформу для гелевого электрофореза, блок питания и систему визуализации геля, показан на рисунке 2.
- Сборка гелевых кассет
- Гелевая кассета, используемая для анализа μTGGE, показана на рисунке 2А. Конструкция состоит из трех 1-дюймовых гелевых пластин: нижней гелевой пластины, верхней гелевой пластины и пластины с полосовым оперением. Поместите верхнюю гелевую пластину между двумя другими пластинами и соберите в держатель для гелевой кассеты для полимеризации геля.
- Препарат полиакриламидного геля
- Добавить 7,2 г мочевины в пробирку объемом 50 мл и растворить в 10 мл стерильной воды. Нагрейте образец в микроволновой печи в течение 20-30 с, а затем доведите его до комнатной температуры (RT).
- Добавьте в раствор 3 мл 5x буфера Tris/borate/EDTA (TBE) (Таблица материалов), 2,25 мл 40% (мас./об.) акриламида/биса (19:1), 75 мкл 10x персульфата аммония и 15 мкл тетраметилэтилендиамина.
- Немедленно медленно налейте раствор геля в держатель для гелевой кассеты, избегая образования пузырьков воздуха.
- Генерация профилей плавления с помощью установки μTGGE
- Используйте миниатюрную, экономичную версию аппарата μTGGE, показанную на рисунке 2 , с градиентом температуры (25-65 °C), установленным перпендикулярно направлению миграции ДНК.
- Замочите верхнюю и нижнюю буферные прокладки электрофореза (0,5 см х 2,5 см) в 2 мл 1 буфера TBE.
- Поместите гелевую кассету в горизонтальный блок камеры электрофореза и расположите верхнюю и нижнюю буферные прокладки соответствующим образом, как показано на рисунке 2.
- Затем загрузите 10 мкл продукта ПЦР в среднюю (более длинную) лунку и 1 мкл продукта ПЦР в каждую боковую лунку.
- После 1 мин ожидания подключите блок питания и подайте напряжение 100 В в течение 12 мин при линейном температурном градиенте от 25-65 °C.
- После того, как пробег завершится, достаньте кассету и снимите верхнюю стеклянную крышку.
- Налейте на гель 300 мкл 10-кратного пятна SYBR Gold. Визуализируйте плавильные профили с помощью синего светодиодного фонарика, установленного в электрофоретическом устройстве размером с ладонь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мягкий файл изображения геля должен быть сохранен для расчета показателя сходства паттернов (PaSS). - Повторите каждый электрофоретический эксперимент 3 раза, чтобы подтвердить воспроизводимость данных.
4. Расчеты PaSS
ПРИМЕЧАНИЕ: Расчеты выполняются с помощью программного обеспечения μTGGE Analyzer.
- Загрузите и откройте программное обеспечение.
- Откройте файл JPEG, содержащий изображение геля. Обратите внимание, что программное обеспечение будет принимать только файлы формата JPEG.
- Нажмите на кнопку Frame (Рамка ) и выберите соответствующую область (рамку) гелевого изображения.
- Нажмите на кнопку Coordinate Correction (Коррекция координат ) и добавьте две опорные точки, как показано на рисунке 1B.
- Нажмите кнопку Добавление точек функций и добавьте точки выборки, как показано на рисунке 1B. Затем сохраните обработанные данные изображения геля в формате μTGGE (*.tgg).
- Нажмите кнопку «Образец» и выберите опцию «Поиск простых точек», чтобы сравнить два или более изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Использование μTGGE для идентификации изменений однонуклеотидного основания в событиях редактирования РНК
Для этого протокола использовались четыре отредактированных гена (таблица 1), включая ген BFP, продуцируемый в клетках HEK293 (с редактированием C-to-U РНК ферментами деаминазы аполипопротеина B мРНК, редактирующего ферментный комплекс; APOBEC115), ген EGFP, содержащий охристый стоп-кодон (TAA), продуцируемый в клетках HEK293 (с редактированием РНК A-to-I аденозиндеаминазой, действующей на РНК 1; ADAR116), а также ядерные гены AT2G16586 и AT5G02670 у A. thaliana17,18 (с редактированием РНК U-to-C). Однонуклеотидные различия между отредактированными и соответствующими неотредактированными образцами были подтверждены секвенированием ДНК. Затем был проведен анализ μTGGE для изучения различий между кривыми плавления образцов (рисунок 3).
Для типа редактирования РНК от C до U неотредактированный образец с исходным основанием C показал более длинную картину плавления в конечной температуре плавления нити, чем отредактированный образец с модифицированным основанием U (рисунок 3A). Для типа редактирования РНК от A до I(G) отредактированный образец с модифицированным основанием I(G) отображал более длинную картину плавления в конечной температуре плавления нити, чем неотредактированный образец с исходным основанием A (рисунок 3B). Для «обратного» типа редактирования U-to-C РНК были проанализированы два гена. Для гена AT2G16586 отредактированный образец с модифицированным основанием C показал более длинную картину плавления между начальным плавлением нити и конечной температурой плавления нити, чем неотредактированный образец с исходным основанием U (рисунок 3C). Однако аналогичная картина не наблюдалась для другого гена AT5G02670 (рисунок 3D). Тем не менее, существовала явная разница между неотредактированными и отредактированными типами в конечной температуре плавления. Это показывает, что четкое наблюдение за профилями плавления является важным шагом в разграничении между неотредактированными и отредактированными типами.
Количественный анализ паттернов плавления μTGGE, представляющих события редактирования РНК
Затем мы рассчитали значения PaSS11 для оценки воспроизводимости профилей плавления на основе μTGGE, представляющих четыре события редактирования РНК, описанные выше. Значение PaSS обеспечивает меру того, насколько близко могут быть наложены две модели плавления, генерируя более высокое значение (максимум: 1) для очень похожих моделей плавления. Таким образом, ожидается, что значения PaSS для сравнения неотредактированных и отредактированных образцов будут меньше единицы. Как показано на рисунке 1B, для расчета значений PaSS использовались точки признаков паттернов плавления, которые соответствовали структурным переходам от двухцепочечной к одноцепочечной ДНК. Для исключения экспериментальных переменных компьютерную нормализацию проводили с использованием двух внутренних опорных точек: опорной точки No1, представляющей положение образца в двухцепочечном виде (крайняя левая полоса), и опорной точки No2, представляющей положение образца в одноцепочечном виде (крайняя правая полоса). Координаты точек объектов были нормализованы по отношению к координатам внутренних опорных точек, а затем использовались для расчета значений PaSS. Каждый эксперимент повторяли три раза, и определяли среднее значение. Как и ожидалось, значения PaSS четырех отредактированных образцов были ниже единицы (рисунок 4). Значения PaSS типов редактирования РНК C-to-you и A-to-I были ниже, чем у двух типов редактирования РНК U-to-C. Это различие, вероятно, связано с соответствующими местоположениями сайтов редактирования. В частности, отредактированные сайты C-to-you и A-to-I были расположены относительно близко к 5'-концевым концам (на позициях 48 и 59 из ~300 фрагментов bp соответственно), тогда как отредактированные сайты U-to-C были расположены ближе к середине фрагментов (на позициях 152 и 169). Эти данные свидетельствуют о том, что отредактированные участки, расположенные в конечных позициях, могут быть обнаружены с помощью μTGGE легче, чем те, которые расположены к центру фрагментов.
Оптимизация паттернов плавления TGGE для выявления событий редактирования РНК
Поскольку наши предыдущие результаты предполагали, что значение PaSS может варьироваться в зависимости от конкретного положения сайта редактирования РНК, мы изучили различия между паттернами плавления 300 bp фрагмента гена BFP (экспрессируемого в клетках HEK293T), в котором отредактированный сайт C-to-U был расположен близко к 5'-концевому концу, близко к 3'-концевому концу, или в центре фрагмента (рисунок 5А). До анализа μTGGE модели плавления неотредактированного фрагмента и трех отредактированных фрагментов были предсказаны с помощью веб-инструмента uMelt HETS. Этот анализ показал, что модификация C-to-U, как ожидается, сместит кривую плавления влево вдоль оси температуры (рисунок 5B). Значения PaSS, рассчитанные на основе анализа μTGGE неотредактированного и трех отредактированных фрагментов, были упорядочены следующим образом: редактирование 5'-концевой РНК < редактирование 3'-концевой РНК < центре 5'- и 3'-концевых концов РНК редактирования (рисунок 5C). Примечательно, что эти значения PaSS соответствовали результатам, предсказанным с помощью uMelt. Эти результаты показывают, что различия нуклеотидных оснований, расположенные на 5'- или 3'-концевом конце, приводят к большим вариациям между значениями PaSS отредактированных и неотредактированных генов, чем различия нуклеотидных оснований, расположенных более централизованно. Кроме того, эти результаты свидетельствуют о том, что предварительное знание различий между профилями плавления отредактированных и неотредактированных генов может быть использовано в качестве руководства для оптимизации фрагментов генов для редактирования РНК.
Рисунок 1: Процедура, используемая для идентификации редактирования РНК с помощью μTGGE. (A) Рассмотрены типы событий редактирования РНК. (B) Схематическая иллюстрация типичных профилей плавления отредактированных и неотредактированных генов. В μTGGE образец мигрирует через гель с градиентом температуры, создавая характерную кривизну. Точки признаков шаблона плавления назначаются, а затем обрабатываются для вычисления значения показателя сходства шаблона (PaSS). Расчет PaSS выполняется так, как показано в уравнении, где вектор P каждой точки признака находится в соответствующем положении и функции температуры и подвижности (т.е. вектор P = P (T, m)). Надстрочные индексы (1) и (2) представляют отредактированные и неотредактированные гены соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Иллюстрации и фотографии устройства для электрофореза геля размером с ладонь. (A) Сборка трех 1 в гелевых кассетах. (B) Иллюстрация держателя для гелевых кассет с пластиной градиента температуры. На фотографии показаны положения верхней и нижней буферных прокладок, а также образец после первоначальной загрузки. (C) Обзор всей системы, включая источник питания, горизонтальную платформу для гелевого электрофореза и систему визуализации геля. Эта система обеспечивает жизнеспособное решение для быстрого анализа на основе электрофореза полиакриламидного геля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: TGGE-анализ однонуклеотидных изменений в событиях редактирования РНК. Профили плавления для трех различных типов редактирования РНК были изучены с использованием четырех генов. (A) Редактирование РНК C-to-U в BFP, экспрессируемом в клетках HEK293T. (B) Редактирование РНК от A-до I(G) в EGFP, экспрессируемом в клетках HEK293T. (C) Редактирование РНК U-to-C в гене AT2G16586 от A. thaliana. (D) Редактирование U-to-C РНК в гене AT5G02670 от A. thaliana. Места расположения редактируемых сайтов подсвечиваются желтым цветом (красным шрифтом), а позиции праймера подчеркиваются. Различия между моделями плавления отредактированных и неотредактированных образцов обозначены красными кружками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Средние значения PaSS для четырех отредактированных генов, рассмотренных здесь. Полосы ошибок представляют стандартное отклонение трех реплик. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Позиционно-специфический анализ PaSS. (A) Сайт редактирования РНК типа C-to-U в гене BFP, экспрессированном в клетках HEK293T, был смещен на 5'-концевой конец, 3'-концевой конец или центр фрагмента гена. (B) Теоретическое прогнозирование моделей плавления неотредактированных и трех отредактированных фрагментов, показанных в пункте (A). Прогнозы выполнялись с помощью uMelt. (C) Средние значения PaSSотредактированных генов, показанные в пункте (A). Полосы ошибок представляют стандартное отклонение трех реплик. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| S.No | Редактирование РНК | Источник | Позиция | Идентификатор гена | Букварь форварда | Обратная грунтовка | Длина последовательности | ||
| 1 | От С-до-У | Ячейки HEK293T | 48-й | ЭГФП | AAGCTGACCC TGAAGTTCATC |
ГКТГТТГТАГТ TGTACTCCAGC |
324 | ||
| 2 | А-до-И | Ячейки HEK293T | 59-й | ЭГФП | АГГГАГГАТГК КАКТАКГГКА |
ПГУКТКТ ТТААГТСГА |
300 | ||
| 3 | U-to-C | Арабидопсис | 152-й | АТ2Г16586 | ГГГКГАТГТТ ACGCTCGATGA |
ГТГААГТАА КАТГГГГТТ |
301 | ||
| 4 | U-to-C | Арабидопсис | 169-й | АТ5Г02670 | CCAGTTGGCAG ААТККАГТКА |
CTAGCTTCCAC ТГТТГАГАТТЦ |
300 | ||
Таблица 1: Список генов, используемых в текущем протоколе
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Редактирование РНК играет важную роль в биологии; однако современные методы обнаружения редактирования РНК, такие как хроматография и секвенирование, представляют собой несколько проблем из-за их высокой стоимости, чрезмерных временных требований и сложности. Протокол, описанный здесь, представляет собой простой, быстрый и экономически эффективный метод обнаружения редактирования РНК, который использует портативную, микроразмерную систему на основе TGGE. Эта система может быть использована для дифференциации отредактированных и неотредактированных генов до секвенирования Сэнгера. В частности, отредактированные и неотредактированные гены с одноосновными нуклеотидными модификациями могут быть дифференцированы на основе изменений в профилях плавления TGGE. Поскольку система включает в себя 1 в гелях, она требует очень небольшого количества образцов и позволяет быстро обнаруживать различия между последовательностями. Кроме того, описанному здесь протоколу очень легко следовать как экспертам, так и новичкам в этой области. Оптимизация фрагмента гена-мишени имеет решающее значение для четкой дифференциации между отредактированными и неотредактированными областями, и этот процесс упрощен в текущем протоколе.
Этот протокол совместим с мультиплексными анализами с использованием флуоресцентно помеченных праймеров. Для количественного анализа неизвестные образцы РНК (отредактированные или неотредактированные) могут быть помечены зеленой флуоресценцией и комигрированы красным эталонным стандартом с флуоресцентной меткой (отредактированным или неотредактированным) во время анализа TGGE.
В дополнение к демонстрации способности метода μTGGE обнаруживать события редактирования однонуклеотидной РНК, мы также подтвердили сходство между экспериментальным результатом, полученным с использованием μTGGE, и теоретическим результатом, полученным для того же фрагмента гена с использованием uMELT. Кроме того, мы обнаружили, что различия нуклеотидных оснований, расположенные на 5'- и 3'-терминалах фрагментов генов, вызывают большие различия в профилях плавления μTGGE (то есть меньшие значения PaSS), чем те, которые расположены к центру фрагментов. Хотя и многообещающий, текущий протокол может быть ограничен анализом и обнаружением конкретных типов нуклеотидных модификаций во время редактирования РНК. Дальнейшая оптимизация и развитие этого протокола для анализа других типов и /или мест редактирования РНК будут выполнены в нашем предстоящем исследовании.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом на научные исследования от Японского общества содействия науке (17H02204 и 18K19288). Ручика получил финансовую поддержку японского правительства (стипендия MEXT). Мы благодарим г-жу Радхику Бияни (Лаборатория Такаги, JAIST) и д-ра Кирти Шарму (Корпорация BioSeeds) за помощь в проведении экспериментов, связанных с электрофорезом.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2U ExoI | Takara | 2650A | Exonuclease I |
| 40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1) | Thermo fisher | AM9022 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Thermo Fisher | 17874 | |
| Centrifuge Mini spin | eppendorf | 5452000034 | |
| Digital dry bath/ block heater | Thermo fisher | NA | |
| Gold Taq Polymerase Master mixture | Promega | M7122 | |
| LATaq DNA polymerase | TAKARA | RR002A | Taq Polymerase |
| micro-TGGE cassette holder | BioSeeds Corp. | BS-GE-CH | |
| micro-TGGE apparatus | Lifetech Corp. | TG | |
| micro-TGGE gel cassette | BioSeeds Corp. | BS-TGGE-C | |
| NanoDrop 1000 | Thermo fisher | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Plant Rneasy Mini kit | Qiagen | 74904 | |
| ReverTra Ace Master Mix | TOYOBO | TRT101 | M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | Takara | 2660B | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Thermo fisher | S11494 | |
| TBE buffer | Thermo fisher | B52 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai tesque | 33401-72 | |
| Urea, Nuclease and protease tested | Nacalai tesque | 35940-65 |
References
- Chateigner-Boutin, A. L., Small, I. A rapid high-throughput method for the detection and quantification of RNA editing based on high-resolution melting of amplicons. Nucleic Acids Research. 35 (17), 114 (2007).
- Chen, Y. C., et al. A real-time PCR method for the quantitative analysis of RNA editing at specific sites. Analytical Biochemistry. 375 (1), 46-52 (2008).
- Barbon, A., Vallini, I., La Via, L., Marchina, E., Barlati, S. Glutamate receptor RNA editing: a molecular analysis of GluR2, GluR5 and GluR6 in human brain tissues and in NT2 cells following in vitro neural differentiation. Molecular Brain Research. 117 (2), 168-178 (2003).
- Gallo, A., Thomson, E., Brindle, J., O'Connell, M. A., Keegan, L. P. Micro-processing events in mRNAs identified by DHPLC analysis. Nucleic Acids Research. 30 (18), 3945-3953 (2002).
- Schiffer, H. H., Heinemann, S. F. A Quantitative method to detect RNA editing events. Analytical Biochemistry. 276 (2), 257-260 (1999).
- Burns, C. M., et al. Regulation of serotonin-2C receptor G-protein coupling by RNA editing. Nature. 387 (6630), 303-308 (1997).
- Marian, A. J.
- Bird, A. Genome biology: Not drowning but waving. Cell. 154 (5), 951-952 (2013).
- Jones, B. M., Knapp, L. A. Temporal temperature gradient electrophoresis for detection of single nucleotide polymorphisms. Methods in Molecular Biology. 578, Clifton, N.J. 153-165 (2009).
- Riesner, D., et al. Temperature-gradient gel electrophoresis of nucleic acids: analysis of conformational transitions, sequence variations, and protein-nucleic acid interactions. Electrophoresis. 10 (5-6), 377-389 (1989).
- Biyani, M., Nishigaki, K. Hundred-fold productivity of genome analysis by introduction of micro-temperature gradient gel electrophoresis. Electrophoresis. 22 (1), 23-28 (2001).
- Rathore, H., Biyani, R., Kato, H., Takamura, Y., Biyani, M. Palm-size and one-inch gel electrophoretic device for reliable and field-applicable analysis of recombinase polymerase amplification. Analytical Methods. 11 (39), 4969-4976 (2019).
- Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
- Bhakta, S., Sakari, M., Tsukahara, T. RNA editing of BFP, a point mutant of GFP, using artificial APOBEC1 deaminase to restore the genetic code. Scientific Reports. 10 (1), 17304 (2020).
- Azad, T. A., Qulsum, U., Tsukahara, T. Comparative activity of adenosine deaminase acting on RNA (ADARs) isoforms for correction of genetic code in gene therapy. Current Gene Therapy. 19 (1), 31-39 (2019).
- Ruchika, O. C., Sakari, M., Tsukahara, T. Genome-wide identification of U-To-C RNA editing events for nuclear genes in Arabidopsis thaliana. Cells. 10 (3), 635 (2021).
- Tsukahara, T. The U-to-C RNA editing affects the mRNA stability of nuclear genes in Arabidopsis thaliana. Biochemical and Biophysical Research Communications. 571, 110-117 (2021).
