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Bioengineering

आरएनए संपादन की तेजी से पहचान के लिए एक nonsequencing दृष्टिकोण

Published: April 21, 2022 doi: 10.3791/63591
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Bioscience and Biotechnology, Japan Advanced Institute of Science and Technology, 2BioSeeds Corporation, JAIST Venture Business Laboratory, Ishikawa Create Labo

Summary

एक जीनोमिक पैमाने पर आरएनए संपादन घटनाओं का तेजी से पता लगाना और विश्वसनीय परिमाणीकरण चुनौतीपूर्ण बना हुआ है और वर्तमान में प्रत्यक्ष आरएनए अनुक्रमण विधियों पर भरोसा करता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल आरएनए संपादन का पता लगाने की एक सरल, त्वरित और पोर्टेबल विधि के रूप में माइक्रोटेंपेरचर ग्रेडिएंट जेल वैद्युतकणसंचलन (μTGGE) का उपयोग करता है।

Abstract

आरएनए संपादन एक ऐसी प्रक्रिया है जो आरएनए में पोस्टट्रांसक्रिप्शनल अनुक्रम परिवर्तन की ओर ले जाती है। आरएनए संपादन का पता लगाना और परिमाणीकरण मुख्य रूप से सेंगर अनुक्रमण और आरएनए अनुक्रमण तकनीकों पर निर्भर करता है। हालांकि, ये तरीके महंगे और समय लेने वाले हो सकते हैं। इस प्रोटोकॉल में, एक पोर्टेबल माइक्रोटेम्पेचर ग्रेडिएंट जेल वैद्युतकणसंचलन (μTGGE) प्रणाली का उपयोग आरएनए संपादन का तेजी से पता लगाने के लिए एक गैर-अनुक्रमण दृष्टिकोण के रूप में किया जाता है। यह प्रक्रिया वैद्युतकणसंचलन के सिद्धांत पर आधारित है, जो न्यूक्लिक एसिड के नमूनों को डीनेचर करने के लिए उच्च तापमान का उपयोग करता है क्योंकि वे पॉलीएक्रिलामाइड जेल में जाते हैं। तापमान की एक श्रृंखला में, एक डीएनए टुकड़ा आंशिक रूप से अलग स्ट्रैंड के लिए पूरी तरह से डबल-फंसे डीएनए का एक ढाल बनाता है और फिर पूरी तरह से अलग किए गए एकल-फंसे हुए डीएनए के लिए। अलग-अलग न्यूक्लियोटाइड आधारों के साथ आरएनए-संपादित साइटें μTGGE विश्लेषण में विभिन्न पिघलने प्रोफाइल का उत्पादन करती हैं। हमने चार संपादित आरएनए टुकड़ों के पिघलने वाले प्रोफाइल और उनके संबंधित गैर-संपादित (जंगली-प्रकार) टुकड़ों के बीच अंतर को चिह्नित करने के लिए μTGGE-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग किया। पैटर्न समानता स्कोर (पीएएस) की गणना संपादित और गैर-संपादित आरएनए द्वारा उत्पादित बैंड पैटर्न की तुलना करके की गई थी और इसका उपयोग विधि की पुनरुत्पादकता का आकलन करने के लिए किया गया था। कुल मिलाकर, यहां वर्णित प्लेटफ़ॉर्म एक सरल, सरल और लागत प्रभावी तरीके से आरएनए में एकल आधार उत्परिवर्तन का पता लगाने में सक्षम बनाता है। यह अनुमान लगाया जाता है कि यह विश्लेषण उपकरण नए आणविक जीव विज्ञान निष्कर्षों की सहायता करेगा।

Introduction

जीनोमिक आरएनए में एकल न्यूक्लियोटाइड वेरिएंट (एसएनवी), जिसमें ए-टू-आई, सी-टू-यू और यू-टू-सी वेरिएंट शामिल हैं, आरएनए संपादन घटनाओं का संकेत दे सकते हैं। हालांकि, आरएनए में एसएनवी का पता लगाना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण कार्य बना हुआ है। परंपरागत रूप से, संपादित से गैर-संपादित आरएनए का अनुपात प्रत्यक्ष अनुक्रमण, एलील-विशिष्ट वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर), या उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) दृष्टिकोण 1,2,3,4,5,6 तक पहुंचने के लिए विकृत द्वारा निर्धारित किया जाता है। हालांकि, ये दृष्टिकोण विशेष रूप से समय- या लागत प्रभावी नहीं हैं, और उनकी कम सटीकता, शोर के उच्च स्तर के कारण, आरएनए-आधारित एसएनवी डिटेक्शन 7,8 के लिए तकनीकी बाधाएं पैदा करती है। यहां, हम एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपताओं (एसएनपी) की पहचान करने के लिए तापमान ग्रेडिएंट जेल वैद्युतकणसंचलन (टीजीजीई) पर आधारित एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो आरएनए संपादन विश्लेषण के लिए प्रत्यक्ष आरएनए अनुक्रमण दृष्टिकोण की आवश्यकता को समाप्त करता है।

वैद्युतकणसंचलन जीवन विज्ञान प्रयोगशालाओं में बायोमोलेक्यूल्स के पृथक्करण और विश्लेषण के लिए एक पसंदीदा विधि है। टीजीजीई डबल-फंसे डीएनए टुकड़ों के अलगाव को सक्षम बनाता है जो समान आकार के होते हैं लेकिन अलग-अलग अनुक्रम होते हैं। तकनीक डीएनए टुकड़ों के पिघलने के तापमान में अनुक्रम से संबंधित अंतर और रैखिक तापमान ढाल 9,10 के साथ झरझरा जैल में उनकी गतिशीलता में बाद में परिवर्तन पर निर्भर करती है। डीएनए के टुकड़ों का पिघलना विशिष्ट पिघलने वाले प्रोफाइल उत्पन्न करता है। एक बार जब सबसे कम पिघलने वाले तापमान वाला डोमेन जेल में एक विशेष स्थिति में संबंधित तापमान तक पहुंच जाता है, तो आंशिक रूप से पिघली हुई संरचना में एक हेलिकल संरचना से संक्रमण होता है, और अणु का प्रवास व्यावहारिक रूप से रुक जाएगा। इसलिए, टीजीजीई गतिशीलता (आकार की जानकारी) और डीएनए टुकड़ों (अनुक्रम-निर्भर जानकारी) के तापमान-प्रेरित संरचनात्मक संक्रमण दोनों का उपयोग करता है, जिससे यह डीएनए टुकड़ों के लक्षण वर्णन के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण बन जाता है। एक टीजीजीई पिघलने के पैटर्न में विशेषता बिंदु, जो डीएनए अणु के तीन संरचनात्मक संक्रमणों के अनुरूप हैं, स्ट्रैंड प्रारंभिक-पृथक्करण बिंदु, स्ट्रैंड मध्य-पृथक्करण बिंदु, और स्ट्रैंड अंत-पृथक्करण बिंदु (चित्रा 1) हैं। डोमेन के भीतर अनुक्रम भिन्नताएं, यहां तक कि एकल-आधार अंतर, पिघलने के तापमान को प्रभावित करते हैं, इसलिए, विभिन्न अनुक्रमों वाले अणु टीजीजीई विश्लेषण में असतत पिघलने (विकृतीकरण) पैटर्न दिखाएंगे। इसलिए, टीजीजीई का उपयोग जीनोमिक आरएनए में एसएनवी का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है और आरएनए संपादन का पता लगाने का एक अमूल्य उच्च-थ्रूपुट तरीका हो सकता है। यह उच्च-थ्रूपुट लाभ खो जाता है जब पारंपरिक जेल वैद्युतकणसंचलन-आधारित टीजीजीई का उपयोग किया जाता है। हालांकि, TGGE का एक छोटा संस्करण, जिसका नाम microTGGE (μTGGE) है, का उपयोग जेल इलेक्ट्रोफोरेटिक समय को छोटा करनेऔर उत्पादकता 11 में 100 गुना वृद्धि के साथ विश्लेषण में तेजी लाने के लिए किया जा सकता है। μTGGE विधि की सादगी और कॉम्पैक्टनेस PalmPAGE12, एक क्षेत्र-लागू, हैंडहेल्ड और सस्ती जेल वैद्युतकणसंचलन प्रणाली की शुरूआत से सुधार किया गया है।

यहां, एक नए टीजीजीई-आधारित प्रोटोकॉल का उपयोग चार जीनों में तीन प्रकार के आरएनए संपादन साइटों (ए-टू-आई, सी-टू-यू, और यू-टू-सी) की जांच करने के लिए किया जाता है, जिसमें दो एराबिडोप्सिस थैलियाना ऊतकों से और दो स्तनधारी HEK293 कोशिकाओं (चित्रा 1 ए) में व्यक्त किए गए हैं। प्रोटोकॉल PalmPAGE (हार्डवेयर) के उपयोग को एकीकृत करता है, जो आरएनए संपादन का तेजी से पता लगाने के लिए एक पोर्टेबल सिस्टम है, और uMelt (सॉफ़्टवेयर)13। 15-30 मिनट के औसत रन-टाइम के साथ, यह प्रोटोकॉल प्रत्यक्ष आरएनए अनुक्रमण दृष्टिकोण की आवश्यकता के बिना आरएनए संपादन की तेजी से, विश्वसनीय और आसान पहचान को सक्षम बनाता है।

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Protocol

1. लक्ष्य टुकड़ा का अनुकूलन

नोट: इस प्रोटोकॉल के विकास में चार संपादित जीनों का उपयोग किया गया था, जिसमें ए थालियाना से दो परमाणु जीन (AT2G16586 और AT5G02670) शामिल थे, और जीन एन्कोडिंग ब्लू फ्लोरोसेंट प्रोटीन (BFP) और बढ़ी हुई हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) HEK293 कोशिकाओं में व्यक्त किए गए थे।

  1. विभिन्न पिघलने वाले प्रोफाइल के साथ जीन के टुकड़ों की पहचान करने के लिए, संपादित बनाम गैर-संपादित क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करते हुए, uMelt HETS वेब-आधारित उपकरण का उपयोग करके अनुमानित पिघलने वाले घटता उत्पन्न करते हैं, जो मूल uMelt सॉफ़्टवेयर13 का विस्तार है।
    नोट:: यह उपकरण heteroduplex और homoduplex उत्पादों के लिए पिघलने घटता के आकार की भविष्यवाणी करता है।
  2. प्रत्येक लक्ष्य जीन के लिए, जीन टुकड़ों के तीन जोड़े (लंबाई में 300-324 बीपी) डिजाइन करें। प्रत्येक जोड़ी में एक संपादित साइट के साथ एक टुकड़ा और एक गैर-संपादित साइट के साथ एक संबंधित जंगली-प्रकार का टुकड़ा होता है, जो या तो 5'-टर्मिनल अंत, मध्य स्थिति, या 3'-टर्मिनल अंत में स्थित होता है।
  3. उस गैर-संपादित/संपादित जोड़ी का चयन करें जिसने आगे के विश्लेषण के लिए हेलिसिटी अक्ष पर पिघलने वाले क्षेत्रों के बीच अधिकतम अंतर दिखाया। μTGGE विश्लेषण के लिए, पीसीआर प्रवर्धन द्वारा चयनित जीन टुकड़े को संश्लेषित करें, जैसा कि नीचे अनुभाग 2 में वर्णित है।
  4. DNADynamo सॉफ़्टवेयर (https://www.bluetractorsoftware.com/DynamoDemo.htm) का उपयोग करके आगे और रिवर्स प्राइमरों को डिज़ाइन करें और एनसीबीआई प्राइमर-ब्लास्ट टूल का उपयोग करके सत्यापित करें।
  5. TE बफर में प्राइमरों को पतला करें (10 mM Tris-HCl जिसमें 1 mM EDTA · Na2) और उन्हें 100 pmol / μL की सांद्रता पर संग्रहीत करें। उपयोग करने से पहले, आसुत पानी का उपयोग करके प्रत्येक प्राइमर सेट को 10 pmol / μL की एकाग्रता में पतला करें।

2. आरएनए निष्कर्षण और लक्ष्य टुकड़ा के आरटी-पीसीआर प्रवर्धन

  1. आरएनए निष्कर्षण
    1. मानक विधियों का उपयोग करके संपादित और गैर-संपादित जीन के स्रोत से कुल आरएनए निकालें, जैसे कि TRIzol निष्कर्षण14 या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट।
    2. चरण 2.2 में वर्णित के रूप में एक मानक RT-PCR प्रोटोकॉल का उपयोग कर संगत cDNA का संश्लेषण निष्पादित करें।
  2. रिवर्स प्रतिलेखन
    1. ओलिगो (डीटी) प्राइमर के 1 μL, 10 mM dNTP मिश्रण के 1 μL, कुल RNA के 10 μL, और एक न्यूक्लिएज मुक्त माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब के लिए बाँझ आसुत पानी के 10 μL जोड़ें।
    2. मिश्रण को 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें और फिर कम से कम 1 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
    3. 2-3 s के लिए अधिकतम गति (12,000 x g) पर centrifugation द्वारा ट्यूब की सामग्री ले लीजिए, और 5x ReverTra ऐस बफर के 4 μL, 0.1 M DTT के 1 μL, और M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज (200 U / μL, सामग्री की तालिका) के μL जोड़ें।
    4. धीरे से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण. यदि यादृच्छिक प्राइमरों का उपयोग कर रहे हैं, तो 5 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब को इनक्यूबेट करें।
    5. 60 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब को इनक्यूबेट करें और फिर डिजिटल ड्राई बाथ / ब्लॉक हीटर में 15 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करके प्रतिक्रिया को निष्क्रिय करें।
    6. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके सीडीएनए की एकाग्रता को मापें और इसे -25 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. पीसीआर प्रवर्धन और उत्पादों की पुष्टि अनुक्रमण
    1. न्यूक्लिएज-मुक्त माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में निम्नलिखित अभिकर्मकों को जोड़ें: 5x Taq पोलीमरेज़ बफर का 4 μL, 2 mM dNTP मिश्रण का 2 μL, 25 mM MgCl2 का μL, प्राइमर सेट के 1.6 μL (आगे और रिवर्स; प्रत्येक 10 mM), cDNA टेम्पलेट का 2 μL, Taq पोलीमरेज़ का 0.1 μL (2.5 U/μL), और बाँझ आसुत पानी का 8.3 μL (अंतिम मात्रा) 20 μL)।
    2. निम्नलिखित साइक्लिंग स्थितियों के साथ पीसीआर करें: 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक विकृतीकरण; 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण के 35 चक्र, 30 सेकंड के लिए एक उपयुक्त तापमान (उपयोग किए गए विशिष्ट प्राइमर सेट के आधार पर) पर एनीलिंग, और 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार; और फिर 7 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम विस्तार।
    3. पीसीआर उत्पादों को शुद्ध करने के लिए, एक्सोन्यूक्लिएज I के 2 यू और झींगा क्षारीय फॉस्फेट (एक्सोसैप) के 0.5 यू जोड़ें। 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक थर्मल साइकलर में ट्यूब को इनक्यूबेट करें, इसके बाद 15 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस तक, और फिर अगले चरण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
    4. पुष्टिकरण अनुक्रमण के लिए, बाँझ आसुत पानी के 11.5 μL, आगे या रिवर्स प्राइमर के 2.5 μL, और पीसीआर उत्पादों के 1 μL (ExoSAP के साथ) को एक नई माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में जोड़ें।
      नोट: अनुक्रमण विश्लेषण के लिए डीएनए अनुक्रमण सेवाओं (जैसे, Eurofins जीनोमिक्स) का उपयोग करें।
    5. पीसीआर उत्पादों की विशिष्टता को मान्य करने के लिए, आगे और रिवर्स प्राइमर दोनों के साथ अनुक्रमण करें। प्रतिनिधि विश्लेषण में उपयोग किए जाने वाले प्राइमर जोड़े तालिका 1 में दिए गए हैं।
    6. विआयनीकृत पानी के साथ 200 एनजी / μL की एकाग्रता के लिए शुद्ध पीसीआर उत्पादों को पतला करें। इसके बाद, एक 250 μL ट्यूब में 6x जेल लोडिंग डाई के 3 μL के साथ शुद्ध उत्पाद के 6 μL मिश्रण और बाँझ पानी के साथ 12 μL करने के लिए कुल मात्रा बढ़ाने के लिए। नीचे वर्णित के रूप में μTGGE के साथ आगे बढ़ने के लिए तैयार होने तक पीसीआर उत्पाद (-25 डिग्री सेल्सियस पर) स्टोर करें।

3. μTGGE विश्लेषण

नोट:: μTGGE विश्लेषण एक लघुकृत और आर्थिक प्रणाली का उपयोग कर किया जाता है। जेल कैसेट, जेल कैसेट धारक, क्षैतिज जेल वैद्युतकणसंचलन मंच, बिजली की आपूर्ति, और जेल इमेजिंग प्रणाली सहित पूरी प्रणाली का एक सिंहावलोकन, चित्रा 2 में दिखाया गया है।

  1. जेल कैसेट की असेंबली
    1. μTGGE विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली जेल कैसेट को चित्र 2A में दिखाया गया है। डिजाइन में तीन 1 इंच जेल प्लेटें होती हैं: एक नीचे जेल प्लेट, एक शीर्ष जेल प्लेट, और एक लेन-पूर्व प्लेट। सैंडविच अन्य दो प्लेटों के बीच शीर्ष जेल प्लेट और जेल polymerization के लिए जेल कैसेट धारक में इकट्ठा.
  2. Polyacrylamide जेल तैयारी
    1. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में 7.2 ग्राम यूरिया जोड़ें और 10 मिलीलीटर बाँझ पानी में भंग करें। नमूने को 20-30 सेकंड के लिए माइक्रोवेव में गर्म करें और फिर इसे कमरे के तापमान (आरटी) पर लाएं।
    2. समाधान में 5x Tris/ borate/EDTA (TBE) बफर (TBE) बफर (सामग्री की तालिका), 40% (w/v) एक्रिलामाइड/bis (19:1) के 2.25 mL, 10x अमोनियम परसल्फेट के 75 μL, और टेट्रामेथेथिलेथिलीनडायमिन के 15 μL के 3 mL जोड़ें।
    3. तुरंत जेल समाधान को जेल कैसेट धारक में धीरे-धीरे डालें, हवा के बुलबुले के गठन से बचें।
  3. μTGGE इकाई का उपयोग कर पिघलने प्रोफाइल की पीढ़ी
    1. डीएनए माइग्रेशन की दिशा के लंबवत सेट तापमान ढाल (25-65 डिग्री सेल्सियस) के साथ चित्र 2 में दिखाए गए μTGGE उपकरण के लघुकृत, किफायती संस्करण का उपयोग करें।
    2. ऊपरी और निचले वैद्युतकणसंचलन बफर पैड (0.5 सेमी x 2.5 सेमी) को 1x टीबीई बफर के 2 एमएल में भिगोएं।
    3. क्षैतिज वैद्युतकणसंचलन कक्ष इकाई में जेल कैसेट रखें और तदनुसार ऊपरी और निचले बफर पैड की स्थिति रखें, जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है।
    4. इसके बाद, पीसीआर उत्पाद के 10 μL को मध्य (लंबे समय तक) अच्छी तरह से और पीसीआर उत्पाद के 1 μL को प्रत्येक पक्ष में अच्छी तरह से लोड करें।
    5. 1 मिनट की प्रतीक्षा के बाद, बिजली इकाई को कनेक्ट करें और 25-65 डिग्री सेल्सियस से एक रैखिक तापमान ढाल पर 12 मिनट के लिए 100 वी की आपूर्ति करें।
    6. रन पूरा होने के बाद, कैसेट को बाहर निकालें और ऊपरी ग्लास कवर को हटा दें।
    7. जेल पर 10x SYBR गोल्ड दाग के 300 μL डालो. हथेली के आकार के इलेक्ट्रोफोरेटिक डिवाइस में स्थापित नीले एलईडी टॉर्च का उपयोग करके पिघलने वाले प्रोफाइल की कल्पना करें।
      नोट:: जेल छवि की एक नरम फ़ाइल पैटर्न समानता स्कोर (PaSS) परिकलन के लिए सहेजा जाना चाहिए।
    8. डेटा की पुनरुत्पादकता की पुष्टि करने के लिए हर इलेक्ट्रोफोरेटिक प्रयोग 3x को दोहराएं।

4. PaSS गणना

नोट:: गणना μTGGE विश्लेषक सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर किया जाता है।

  1. डाउनलोड करें और सॉफ़्टवेयर खोलें।
  2. जेल छवि युक्त JPEG फ़ाइल खोलें। ध्यान दें कि सॉफ़्टवेयर केवल JPEG प्रारूप फ़ाइलों को स्वीकार करेगा।
  3. फ़्रेम बटन पर क्लिक करें और जेल छवि के उपयुक्त क्षेत्र (फ्रेम) का चयन करें।
  4. निर्देशांक सुधार बटन पर क्लिक करें और दो संदर्भ बिंदु जोड़ें, जैसा कि चित्र 1 B में दिखाया गया है।
  5. फीचर पॉइंट्स के अतिरिक्त बटन पर क्लिक करें और नमूना अंक जोड़ें जैसा कि चित्र 1 B में दिखाया गया है। फिर संसाधित जेल छवि डेटा को μTGGE (*.tgg) प्रारूप में सहेजें।
  6. नमूना बटन पर क्लिक करें और दो या अधिक छवियों की तुलना करने के लिए सरल अंक के लिए खोज विकल्प का चयन करें।

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Representative Results

आरएनए संपादन घटनाओं में एकल न्यूक्लियोटाइड आधार परिवर्तनों की पहचान करने के लिए μTGGE का उपयोग
इस प्रोटोकॉल (तालिका 1) के लिए चार संपादित जीनों का उपयोग किया गया था, जिसमें एचईके 293 कोशिकाओं में उत्पादित बीएफपी जीन भी शामिल था (एपोलिपोप्रोटीन बी एमआरएनए संपादन एंजाइम कॉम्प्लेक्स के डिमिनेस एंजाइमों द्वारा सी-टू-यू आरएनए संपादन के साथ); APOBEC115), EGFP जीन जिसमें HEK293 कोशिकाओं में उत्पादित ochre stop codon (TAA) होता है (आरएनए 1 पर अभिनय करने वाले एडेनोसिन डिमिनेज़ द्वारा A-to-I आरएनए संपादन के साथ); ADAR116), और AT2G16586 और AT5G02670 परमाणु जीन ए थालियाना17,18 (यू-टू-सी आरएनए संपादन के साथ) में। संपादित और संबंधित गैर-संपादित नमूनों के बीच एकल न्यूक्लियोटाइड अंतर डीएनए अनुक्रमण द्वारा पुष्टि की गई थी। फिर नमूनों के पिघलने वाले वक्रों के बीच अंतर की जांच करने के लिए एक μTGGE विश्लेषण किया गया था (चित्रा 3)।

सी-टू-यू आरएनए संपादन प्रकार के लिए, मूल सी बेस के साथ गैर-संपादित नमूने ने संशोधित यू बेस (चित्रा 3 ए) के साथ संपादित नमूने की तुलना में स्ट्रैंड एंड-गलनांक पर एक लंबा पिघलने वाला पैटर्न दिखाया। A-to-I(G) RNA संपादन प्रकार के लिए, संशोधित I(G) आधार के साथ संपादित नमूना मूल A आधार (चित्रा 3B) के साथ गैर-संपादित नमूने की तुलना में स्ट्रैंड एंड-गलनांक पर एक लंबा पिघलने वाला पैटर्न प्रदर्शित करता है। "रिवर्स" यू-टू-सी आरएनए संपादन प्रकार के लिए, दो जीनों का विश्लेषण किया गया था। AT2G16586 जीन के लिए, संशोधित C आधार के साथ संपादित नमूने ने मूल U आधार (चित्रा 3C) के साथ गैर-संपादित नमूने की तुलना में स्ट्रैंड प्रारंभिक-पिघलने और स्ट्रैंड एंड-गलनांक के बीच एक लंबा पिघलने वाला पैटर्न दिखाया। हालांकि, अन्य AT5G02670 जीन (चित्रा 3D) के लिए एक समान पैटर्न नहीं देखा गया था। फिर भी, अंत-गलनांक पर गैर-संपादित और संपादित प्रकारों के बीच एक अलग अंतर था। इससे पता चलता है कि पिघलने वाले प्रोफाइल को स्पष्ट रूप से देखना गैर-संपादित और संपादित प्रकारों के बीच अंतर करने में एक महत्वपूर्ण कदम है।

ΜTGGE पिघलने पैटर्न का मात्रात्मक विश्लेषण आरएनए संपादन घटनाओं का प्रतिनिधित्व करता है
इसके बाद, हमने ऊपर वर्णित चार आरएनए संपादन घटनाओं का प्रतिनिधित्व करने वाले μTGGE-आधारित पिघलने वाले प्रोफाइल की पुनरुत्पादकता का मूल्यांकन करने के लिए PaSS मानों11 की गणना की। PaSS मान एक उपाय प्रदान करता है कि दो पिघलने वाले पैटर्न को कितनी बारीकी से सुपरपोज़ किया जा सकता है, जिससे अत्यधिक समान पिघलने वाले पैटर्न के लिए एक उच्च मूल्य (अधिकतम: 1) उत्पन्न होता है। इस प्रकार, गैर-संपादित और संपादित नमूनों की तुलना के लिए PaSS मान एक से कम होने की उम्मीद है। जैसा कि चित्रा 1 बी में दिखाया गया है, पिघलने वाले पैटर्न के फीचर बिंदु जो डबल-फंसे हुए डीएनए से एकल-फंसे हुए डीएनए तक संरचनात्मक संक्रमणों के अनुरूप थे, का उपयोग पीएएसएस मूल्यों की गणना करने के लिए किया गया था। प्रयोगात्मक चर को समाप्त करने के लिए, कंप्यूटर-सहायता प्राप्त सामान्यीकरण दो आंतरिक संदर्भ बिंदुओं का उपयोग करके किया गया था: संदर्भ बिंदु # 1, डबल-फंसे हुए रूप (सबसे बाएं लेन) में नमूने की स्थिति का प्रतिनिधित्व करता है, और संदर्भ बिंदु # 2, एकल-फंसे हुए रूप (सबसे दाएं लेन) में नमूने की स्थिति का प्रतिनिधित्व करता है। सुविधा बिंदुओं के निर्देशांक आंतरिक संदर्भ बिंदुओं के उन लोगों के लिए सामान्यीकृत किए गए थे और फिर PaSS मानों की गणना करने के लिए उपयोग किए गए थे। प्रत्येक प्रयोग को तीन बार दोहराया गया था, और औसत मूल्य निर्धारित किया गया था। जैसा कि अपेक्षित था, चार संपादित नमूनों के PaSS मान एक से कम थे (चित्रा 4)। C-to-you और A-to-I RNA संपादन प्रकारों के PaSS मान दो U-to-C RNA संपादन प्रकारों की तुलना में कम थे. यह अंतर संभवतः संपादन साइटों के संबंधित स्थानों से संबंधित है। विशेष रूप से, सी-टू-यू और ए-टू-आई संपादित साइटें अपेक्षाकृत 5'-टर्मिनल छोरों के करीब स्थित थीं (क्रमशः ~ 300 बीपी टुकड़े के 48 और 59 पदों पर), जबकि यू-टू-सी संपादित साइटें टुकड़ों के बीच में स्थित थीं (पदों 152 और 169 पर)। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि टर्मिनल पदों पर स्थित संपादित साइटों को टुकड़ों के केंद्र की ओर स्थित लोगों की तुलना में अधिक आसानी से μTGGE का उपयोग करके पता लगाया जा सकता है।

आरएनए संपादन घटनाओं की पहचान करने के लिए TGGE पिघलने पैटर्न का अनुकूलन
जैसा कि हमारे पिछले परिणामों ने सुझाव दिया था कि आरएनए संपादन साइट की विशिष्ट स्थिति के आधार पर पीएएसएस मान भिन्न हो सकता है, हमने बीएफपी जीन के 300 बीपी टुकड़े के पिघलने के पैटर्न (HEK293T कोशिकाओं में व्यक्त) के बीच के अंतर की जांच की, जिसमें एक सी-टू-यू संपादित साइट 5'-टर्मिनल अंत के करीब स्थित थी, 3'-टर्मिनल अंत के करीब, या टुकड़े के केंद्र में (चित्रा 5 ए)। μTGGE विश्लेषण से पहले, nonedited टुकड़े और तीन संपादित टुकड़ों के पिघलने पैटर्न uMelt HETS वेब आधारित उपकरण का उपयोग करके भविष्यवाणी की गई थी। इस विश्लेषण से पता चला है कि सी-टू-यू संशोधन से तापमान अक्ष (चित्रा 5 बी) के साथ बाईं ओर पिघलने की वक्र को स्थानांतरित करने की उम्मीद की जाएगी। गैर-संपादित और तीन संपादित टुकड़ों के μTGGE विश्लेषणों से परिकलित PaSS मानों को निम्नानुसार आदेश दिया गया था: 5'-टर्मिनल एंड आरएनए संपादन < 3'-टर्मिनल एंड आरएनए संपादन 5'- और 3'-टर्मिनल समाप्त होता है आरएनए संपादन (चित्रा 5 सी) के केंद्र <। विशेष रूप से, ये PaSS मान uMelt का उपयोग करके भविष्यवाणी किए गए परिणामों के अनुरूप थे। इन निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि न्यूक्लियोटाइड बेस अंतर 5'- या 3'-टर्मिनल अंत में स्थित है, जिसके परिणामस्वरूप न्यूक्लियोटाइड बेस अंतर की तुलना में संपादित और गैर-संपादित जीनों के पीएएस मूल्यों के बीच बड़ी भिन्नताएं होती हैं जो अधिक केंद्रीय रूप से स्थित हैं। इसके अलावा, इन परिणामों से पता चलता है कि संपादित और गैर-संपादित जीन के पिघलने वाले प्रोफाइल के बीच अंतर के पूर्व ज्ञान का उपयोग आरएनए संपादन के लिए जीन के टुकड़ों को अनुकूलित करने के लिए एक गाइड के रूप में किया जा सकता है।

Figure 1
चित्र 1: μTGGE द्वारा RNA संपादन की पहचान करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रक्रिया। (A) RNA संपादन घटनाओं के प्रकारों की जांच की गई। (बी) संपादित और गैर-संपादित जीनों के विशिष्ट पिघलने वाले प्रोफाइल का एक योजनाबद्ध चित्रण। μTGGE में, एक नमूना एक तापमान ग्रेडिएंट जेल के माध्यम से माइग्रेट करता है, जो एक विशेषता वक्रता का उत्पादन करता है। पिघलने पैटर्न के सुविधा बिंदु असाइन किए जाते हैं और फिर एक पैटर्न समानता स्कोर (PaSS) मान की गणना करने के लिए संसाधित किए जाते हैं। PaSS गणना समीकरण में दिखाए गए अनुसार की जाती है, जहां प्रत्येक सुविधा बिंदु का वेक्टर P अपनी संबंधित स्थिति में होता है और तापमान और गतिशीलता का कार्य (यानी, वेक्टर P = P (T, m))। सुपरस्क्रिप्ट (1) और (2) क्रमशः संपादित और गैर-संपादित जीन का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: हथेली के आकार के जेल वैद्युतकणसंचलन डिवाइस के चित्र और तस्वीरें। (ए) जेल कैसेट में तीन 1 की असेंबली। (बी) तापमान ढाल प्लेट के साथ जेल कैसेट धारक का चित्रण। तस्वीर ऊपरी और निचले बफर पैड की स्थिति दिखाती है, साथ ही प्रारंभिक लोडिंग के बाद नमूने की स्थिति भी दिखाती है। (सी) बिजली की आपूर्ति, क्षैतिज जेल वैद्युतकणसंचलन मंच, और जेल इमेजिंग प्रणाली सहित पूरी प्रणाली का अवलोकन। यह प्रणाली तेजी से, ऑनसाइट पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन-आधारित विश्लेषण के लिए एक व्यवहार्य समाधान प्रदान करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: टीजीजीई आरएनए संपादन घटनाओं में एकल न्यूक्लियोटाइड परिवर्तनों का विश्लेषण करता है। तीन अलग-अलग आरएनए संपादन प्रकारों के लिए पिघलने वाले प्रोफाइल की जांच चार जीनों का उपयोग करके की गई थी। (ए) बीएफपी में सी-टू-यू आरएनए संपादन एचईके 293 टी कोशिकाओं में व्यक्त किया गया है। (बी) एचईके 293 टी कोशिकाओं में व्यक्त ईजीएफपी में ए-टू-आई (जी) आरएनए संपादन। (सी) ए थालियाना से एटी 2 जी 16586 जीन में यू-टू-सी आरएनए संपादन। (डी) एटी 5 जी02670 जीन में यू-टू-सी आरएनए संपादन ए थालियाना से। संपादित साइटों के स्थानों को पीले रंग (लाल फ़ॉन्ट के साथ) में हाइलाइट किया गया है, और प्राइमर पदों को रेखांकित किया गया है। संपादित और गैर-संपादित नमूनों के पिघलने के पैटर्न के बीच के अंतर लाल हलकों द्वारा इंगित किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: चार संपादित जीनों के लिए औसत पीएएस मूल्यों की जांच यहां की गई है। त्रुटि पट्टियाँ तीन प्रतिकृतियों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: स्थिति-विशिष्ट PaSS विश्लेषण. (A) HEK293T कोशिकाओं में व्यक्त BFP जीन में C-to-U प्रकार RNA संपादन साइट को 5'-टर्मिनल अंत, 3'-टर्मिनल अंत, या जीन टुकड़े के केंद्र में स्थानांतरित कर दिया गया था। (बी) (ए) में दिखाए गए गैर-संपादित और तीन संपादित टुकड़ों के पिघलने के पैटर्न की सैद्धांतिक भविष्यवाणी। भविष्यवाणियों uMelt का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था. (C) (A)में दिखाए गए संपादित जीनों के औसत PaSS मान। त्रुटि पट्टियाँ तीन प्रतिकृतियों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

S.No आरएनए संपादन स्रोत पद जीन आईडी अग्रेषित प्राइमर रिवर्स प्राइमर अनुक्रम लंबाई
1 C-to-U HEK293T कोशिकाएँ 48वीं EGFP AAGCTGACCC
TGAAGTTCATC		 GCTGTTGTAGT
TGTACTCCAGC		 324
2 A-to-I HEK293T कोशिकाएँ 59वां EGFP AGGGCGATGC
CACCTACGGCA		 CCGTCCTCCT
TTAAGTCGA		 300
3 U-to-C Arabidopsis 152वीं AT2G16586 GGGCGATGTT
ACGCTCGATGA		 GTGAAGAGTAA
CATGGCGTT		 301
4 U-to-C Arabidopsis 169वीं AT5G02670 CCAGTTGGCAG
AATCCAGTCA		 CTAGCTTCCAC
TGTTGAGATTC		 300

तालिका 1: वर्तमान प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले जीनों की सूची

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Discussion

आरएनए संपादन जीव विज्ञान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है; हालांकि, क्रोमैटोग्राफी और अनुक्रमण जैसे आरएनए संपादन का पता लगाने के वर्तमान तरीके, उनकी उच्च लागत, अत्यधिक समय आवश्यकताओं और जटिलता के कारण कई चुनौतियां पेश करते हैं। यहां वर्णित प्रोटोकॉल आरएनए संपादन का पता लगाने का एक सरल, तेज़ और लागत प्रभावी तरीका है जो एक पोर्टेबल, माइक्रोसाइज्ड, टीजीजीई-आधारित सिस्टम का उपयोग करता है। इस प्रणाली का उपयोग सेंगर अनुक्रमण से पहले संपादित और गैर-संपादित जीनों के बीच अंतर करने के लिए किया जा सकता है। विशेष रूप से, एकल-आधार न्यूक्लियोटाइड संशोधनों के साथ संपादित और गैर-संपादित जीन को टीजीजीई पिघलने वाले प्रोफाइल में परिवर्तन के आधार पर विभेदित किया जा सकता है। जैसा कि यह जैल में 1 को शामिल करता है, सिस्टम को बहुत कम मात्रा में नमूनों की आवश्यकता होती है और अनुक्रमों के बीच अंतर का तेजी से पता लगाने में सक्षम बनाता है। इसके अलावा, यहां वर्णित प्रोटोकॉल क्षेत्र में विशेषज्ञों और नवागंतुकों दोनों के लिए पालन करना बहुत आसान है। लक्षित जीन टुकड़ा का अनुकूलन संपादित और गैर-संपादित क्षेत्रों के बीच स्पष्ट अंतर के लिए महत्वपूर्ण है, और इस प्रक्रिया को वर्तमान प्रोटोकॉल में सरलीकृत किया गया है।

यह प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंटली टैग किए गए प्राइमरों का उपयोग करके मल्टीप्लेक्स विश्लेषण के साथ संगत है। मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, अज्ञात आरएनए नमूनों (संपादित या गैर-संपादित) को हरे रंग की प्रतिदीप्ति के साथ टैग किया जा सकता है और टीजीजीई विश्लेषण के दौरान लाल प्रतिदीप्ति-टैग किए गए संदर्भ मानक (संपादित या गैर-संपादित) के साथ comigrated किया जा सकता है।

एकल न्यूक्लियोटाइड आरएनए संपादन घटनाओं का पता लगाने के लिए μTGGE विधि की क्षमता का प्रदर्शन करने के अलावा, हमने μTGGE का उपयोग करके प्राप्त प्रयोगात्मक परिणाम और uMELT का उपयोग करके एक ही जीन टुकड़े के लिए प्राप्त एक सैद्धांतिक परिणाम के बीच समानता को भी मान्य किया। इसके अलावा, हमने पाया कि जीन टुकड़ों के 5 '- और 3'-टर्मिनलों पर स्थित न्यूक्लियोटाइड बेस अंतर टुकड़ों के केंद्र की ओर स्थित लोगों की तुलना में μTGGE पिघलने वाले प्रोफाइल (यानी, छोटे PaSS मूल्यों) में बड़े अंतर पैदा करते हैं। हालांकि आशाजनक, वर्तमान प्रोटोकॉल आरएनए संपादन के दौरान विशिष्ट प्रकार के न्यूक्लियोटाइड संशोधनों के विश्लेषण और पता लगाने तक सीमित हो सकता है। अन्य प्रकारों और / या आरएनए संपादन के स्थानों का विश्लेषण करने के लिए इस प्रोटोकॉल का आगे अनुकूलन और विकास हमारे आगामी शोध में किया जाएगा।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को जापान सोसाइटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस (17H02204 और 18K19288) से वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए अनुदान-इन-एड द्वारा समर्थित किया गया था। रुचिका को जापानी सरकार (एमईएक्सटी छात्रवृत्ति) द्वारा वित्तीय रूप से समर्थित किया गया था। हम वैद्युतकणसंचलन से संबंधित प्रयोगों में मदद के लिए सुश्री राधिका बियानी (ताकागी प्रयोगशाला, जेएआईएसटी) और डॉ कीर्ति शर्मा (बायोसीड्स कॉर्पोरेशन) को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2U ExoI Takara 2650A Exonuclease I
40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1) Thermo fisher AM9022
Ammonium persulfate (APS) Thermo Fisher 17874
Centrifuge Mini spin eppendorf 5452000034
Digital dry bath/ block heater Thermo fisher NA
Gold Taq Polymerase Master mixture Promega M7122
LATaq DNA polymerase TAKARA RR002A Taq Polymerase
micro-TGGE  cassette holder BioSeeds Corp. BS-GE-CH
micro-TGGE apparatus Lifetech Corp. TG
micro-TGGE gel cassette BioSeeds Corp. BS-TGGE-C
NanoDrop 1000 Thermo fisher ND-1000 Spectrophotometer
Plant Rneasy Mini kit Qiagen 74904
ReverTra Ace Master Mix TOYOBO TRT101 M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase
Rneasy Mini kit Qiagen 74104
Shrimp Alkaline Phosphatase Takara 2660B
SYBR Gold nucleic acid gel stain Thermo fisher S11494
TBE buffer Thermo fisher B52
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Nacalai tesque 33401-72
Urea, Nuclease and protease tested Nacalai tesque 35940-65

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References

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Bioengineering अंक 182
आरएनए संपादन की तेजी से पहचान के लिए एक nonsequencing दृष्टिकोण
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, R., Tshukahara, T., Biyani, M. A… More

, R., Tshukahara, T., Biyani, M. A Nonsequencing Approach for the Rapid Detection of RNA Editing. J. Vis. Exp. (182), e63591, doi:10.3791/63591 (2022).

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