Summary
Snelle detectie en betrouwbare kwantificering van RNA-bewerkingsgebeurtenissen op genomische schaal blijven een uitdaging en vertrouwen momenteel op directe RNA-sequencingmethoden. Het hier beschreven protocol maakt gebruik van microtemperature gradient gel elektroforese (μTGGE) als een eenvoudige, snelle en draagbare methode om RNA-bewerking te detecteren.
Abstract
RNA-bewerking is een proces dat leidt tot posttranscriptionele sequentieveranderingen in RNA's. Detectie en kwantificering van RNA-bewerking zijn voornamelijk afhankelijk van Sanger-sequencing- en RNA-sequencingtechnieken. Deze methoden kunnen echter kostbaar en tijdrovend zijn. In dit protocol wordt een draagbaar microtemperature gradient gel elektroforese (μTGGE) systeem gebruikt als een nonsequencing benadering voor de snelle detectie van RNA-bewerking. Het proces is gebaseerd op het principe van elektroforese, waarbij hoge temperaturen worden gebruikt om nucleïnezuurmonsters te denatureren terwijl ze over een polyacrylamidegel bewegen. Over een temperatuurbereik vormt een DNA-fragment een gradiënt van volledig dubbelstrengs DNA naar gedeeltelijk gescheiden strengen en vervolgens naar volledig gescheiden enkelstrengs DNA. RNA-bewerkte sites met verschillende nucleotidebasen produceren verschillende smeltprofielen in μTGGE-analyses. We gebruikten de op μTGGE gebaseerde benadering om de verschillen tussen de smeltprofielen van vier bewerkte RNA-fragmenten en hun overeenkomstige niet-bewerkte (wild-type) fragmenten te karakteriseren. Pattern Similarity Scores (PaSSs) werden berekend door de bandpatronen geproduceerd door de bewerkte en niet-bewerkte RNA's te vergelijken en werden gebruikt om de reproduceerbaarheid van de methode te beoordelen. Over het algemeen maakt het hier beschreven platform de detectie van zelfs enkele basemutaties in RNA's op een eenvoudige, eenvoudige en kosteneffectieve manier mogelijk. Verwacht wordt dat deze analysetool nieuwe bevindingen van de moleculaire biologie zal helpen.
Introduction
Enkelvoudige nucleotidevarianten (SNV's) in genomisch RNA, waaronder A-to-I,C-to-U en U-to-C-varianten, kunnen wijzen op RNA-bewerkingsgebeurtenissen. De detectie van SNV's in RNA blijft echter een technisch uitdagende taak. Conventioneel wordt de verhouding tussen bewerkt en niet-bewerkt RNA bepaald door directe sequencing, allel-specifieke real-time polymerasekettingreactie (PCR) of denaturerende high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) benadert 1,2,3,4,5,6. Deze benaderingen zijn echter niet bijzonder tijd- of kosteneffectief en hun lage nauwkeurigheid, veroorzaakt door hoge geluidsniveaus, vormt technologische knelpunten voor op RNA gebaseerde SNV-detectie 7,8. Hier beschrijven we een protocol op basis van temperatuurgradiëntgel-elektroforese (TGGE) om single nucleotide polymorfismen (SNP's) te identificeren als een alternatieve methode die de noodzaak van directe RNA-sequencingbenaderingen voor RNA-bewerkingsanalyses elimineert.
Elektroforese is een voorkeursmethode voor de scheiding en analyse van biomoleculen in life science laboratoria. TGGE maakt de scheiding mogelijk van dubbelstrengs DNA-fragmenten die even groot zijn maar verschillende sequenties hebben. De techniek is gebaseerd op sequentiegerelateerde verschillen in de smelttemperaturen van DNA-fragmenten en daaropvolgende veranderingen in hun mobiliteit in poreuze gels met een lineaire temperatuurgradiëntvan 9,10. Het smelten van DNA-fragmenten genereert specifieke smeltprofielen. Zodra het domein met de laagste smelttemperatuur de overeenkomstige temperatuur op een bepaalde positie in de gel bereikt, vindt de overgang van een spiraalvormige structuur naar een gedeeltelijk gesmolten structuur plaats en zal de migratie van het molecuul praktisch stoppen. Daarom maakt TGGE gebruik van zowel mobiliteit (grootte-informatie) als temperatuur-geïnduceerde structurele overgangen van DNA-fragmenten (sequentie-afhankelijke informatie), waardoor het een krachtige benadering is voor de karakterisering van DNA-fragmenten. De kenmerkpunten in een TGGE-smeltpatroon, die overeenkomen met drie structurele overgangen van het DNA-molecuul, zijn het strenginitiële-dissociatiepunt, het strengmiddendissociatiepunt en het einddissociatiepunt van de streng (figuur 1). Sequentievariaties binnen domeinen, zelfs single-base verschillen, beïnvloeden de smelttemperatuur, vandaar dat moleculen met verschillende sequenties discrete smeltpatronen (denaturatie) vertonen in TGGE-analyses. Daarom kan TGGE worden gebruikt om SNV's in genomisch RNA te analyseren en kan het een onschatbare high-throughput methode zijn voor het detecteren van RNA-bewerking. Deze winst met hoge doorvoer gaat verloren wanneer traditionele op gel-elektroforese gebaseerde TGGE wordt gebruikt. Een geminiaturiseerde versie van TGGE, genaamd microTGGE (μTGGE), kan echter worden gebruikt om de gel-elektroforetische tijd te verkorten en de analyse te versnellen met een 100-voudige toename van de productiviteit11. De eenvoud en compactheid van de μTGGE-methode zijn verbeterd door de introductie van PalmPAGE12, een in de praktijk toepasbaar, handheld en betaalbaar gel-elektroforesesysteem.
Hier wordt een nieuw op TGGE gebaseerd protocol gebruikt om drie soorten RNA-bewerkingsplaatsen (A-to-I, C-to-U en U-to-C) in vier genen te onderzoeken, waaronder twee van Arabidopsis thaliana-weefsels en twee tot expressie gebracht in HEK293-cellen van zoogdieren (figuur 1A). Het protocol integreert het gebruik van PalmPAGE (hardware), een draagbaar systeem voor de snelle detectie van RNA-bewerking, en uMelt (software)13. Met een gemiddelde looptijd van 15-30 minuten maakt dit protocol een snelle, betrouwbare en eenvoudige identificatie van RNA-bewerking mogelijk zonder de noodzaak van directe RNA-sequencingbenaderingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Optimalisatie van het doelfragment
OPMERKING: Vier bewerkte genen werden gebruikt bij de ontwikkeling van dit protocol, waaronder twee nucleaire genen (AT2G16586 en AT5G02670) van A. thaliana, en de genen die coderen voor blauw fluorescerend eiwit (BFP) en verbeterd groen fluorescerend eiwit (EGFP) uitgedrukt in HEK293-cellen.
- Om genfragmenten met verschillende smeltprofielen te identificeren, die bewerkte versus niet-bewerkte gebieden vertegenwoordigen, genereert u voorspelde smeltcurven met behulp van de uMelt HETS webgebaseerde tool, een uitbreiding van de oorspronkelijke uMelt-software13.
OPMERKING: Deze tool voorspelt de vormen van smeltcurven voor heteroduplex en homoduplex producten. - Ontwerp voor elk doelgen drie paar genfragmenten (300-324 bp lang). Elk paar bestaat uit een fragment met een bewerkte site en een overeenkomstig wild-type fragment met een niet-bewerkte site, gelegen aan het 5'-terminale uiteinde, de middelste positie of het 3'-terminale uiteinde.
- Selecteer het niet-bewerkte/bewerkte paar dat het maximale verschil tussen de smeltgebieden op de helicity-as aangaf voor verdere analyse. Voor μTGGE-analyse synthetiseert u het geselecteerde genfragment door PCR-amplificatie, zoals beschreven in rubriek 2 hieronder.
- Ontwerp de voorwaartse en achterwaartse primers met behulp van DNADynamo-software (https://www.bluetractorsoftware.com/DynamoDemo.htm) en verifieer met behulp van de NCBI Primer-BLAST-tool.
- Verdun de primers in TE-buffer (10 mM Tris-HCl met 1 mM EDTA· Na2) en bewaar ze in een concentratie van 100 pmol/μL. Verdun vóór gebruik elke primerset tot een concentratie van 10 pmol/μL met gedestilleerd water.
2. RNA-extractie en RT-PCR-versterking van het doelfragment
- RNA-extractie
- Extraheer totaal RNA uit de bron van bewerkte en niet-bewerkte genen met behulp van standaardmethoden, zoals TRIzol extraction14 of in de handel verkrijgbare kits.
- Voer de synthese van het bijbehorende cDNA uit met behulp van een standaard RT-PCR-protocol zoals beschreven in stap 2.2.
- Omgekeerde transcriptie
- Voeg 1 μL oligo(dT)-primer, 1 μL 10 mM dNTP-mix, 10 μL totaal RNA en 10 μL steriel gedestilleerd water toe aan een nucleasevrije microcentrifugebuis.
- Verwarm het mengsel gedurende 5 minuten bij 65 °C en incubeer vervolgens minstens 1 minuut op ijs.
- Verzamel de inhoud van de buis door centrifugeren met maximale snelheid (12.000 x g) gedurende 2-3 s en voeg 4 μL 5x ReverTra Ace-buffer, 1 μL van 0,1 M DTT en 1 μL M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase (200 U/μL, Materiaaltabel) toe.
- Meng door zachtjes op en neer te pipetteren. Als u willekeurige primers gebruikt, incubeer de buis bij 25 °C gedurende 5 minuten.
- Incubeer de buis bij 55 °C gedurende 60 minuten en inactiveer vervolgens de reactie door deze gedurende 15 minuten op 70 °C te verwarmen in een digitale droogbad/blokverwarming.
- Meet de concentratie van cDNA met een spectrofotometer en bewaar deze bij -25 °C.
-
PCR-versterking en bevestigende volgorde van producten
- Voeg de volgende reagentia toe aan een nucleasevrije microcentrifugebuis: 4 μL 5x Taq Polymerase Buffer, 2 μL van 2 mM dNTP-mix, 2 μL van 25 mM MgCl2, 1,6 μL van de primerset (vooruit en achteruit; elk 10 mM), 2 μL cDNA-sjabloon, 0,1 μL Taq-polymerase (2,5 U/μL) en 8,3 μL steriel gedestilleerd water (eindvolume, 20 μL).
- Voer PCR uit met de volgende fietsomstandigheden: initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 2 minuten; 35 cycli denaturatie bij 95 °C gedurende 2 minuten, gloeien bij een geschikte temperatuur (afhankelijk van de gebruikte specifieke primerset) gedurende 30 s en verlenging bij 72 °C gedurende 2 minuten; en vervolgens een laatste verlenging bij 72 °C gedurende 7 min.
- Om de PCR-producten te zuiveren, voegt u 2 U Exonuclease I en 0,5 U alkalische fosfatase (ExoSAP) toe. Incubeer de buis in een thermische cycler bij 37 °C gedurende 1 uur, gevolgd door 80 °C gedurende 15 minuten, en houd deze vervolgens op 4 °C tot de volgende stap.
- Voeg voor bevestigende sequencing 11,5 μL steriel gedestilleerd water, 2,5 μL voorwaartse of omgekeerde primer en 1 μL PCR-producten (met ExoSAP) toe aan een nieuwe microcentrifugebuis.
OPMERKING: Gebruik DNA-sequencingdiensten (bijv. Eurofins Genomics) voor sequencinganalyse. - Om de specificiteit van de PCR-producten te valideren, voert u sequencing uit met zowel voorwaartse als achterwaartse primers. De in de representatieve analyse gebruikte primerparen zijn weergegeven in tabel 1.
- Verdun de gezuiverde PCR-producten tot een concentratie van 200 ng/μL met gedeïoniseerd water. Meng vervolgens 6 μL van het gezuiverde product met 3 μL 6x gelladingskleurstof in een buis van 250 μL en verhoog het totale volume tot 12 μL met steriel water. Bewaar het PCR-product (bij -25 °C) totdat het klaar is om verder te gaan met μTGGE zoals hieronder beschreven.
3. μTGGE-analyse
OPMERKING: De μTGGE-analyse wordt uitgevoerd met behulp van een geminiaturiseerd en economisch systeem. Een overzicht van het complete systeem, inclusief de gelcassettes, gelcassettehouder, horizontaal gel-elektroforeseplatform, voeding en gelbeeldvormingssysteem, is weergegeven in figuur 2.
- Montage van de gelcassettes
- De gelcassette die wordt gebruikt voor μTGGE-analyse is weergegeven in figuur 2A. Het ontwerp bestaat uit drie 1 inch gelplaten: een onderste gelplaat, een bovenste gelplaat en een lane-former plate. Sandwich de bovenste gelplaat tussen de andere twee platen en monteer in de gelcassettehouder voor gelpolymerisatie.
- Polyacrylamide gelpreparaat
- Voeg 7,2 g ureum toe aan een buis van 50 ml en los op in 10 ml steriel water. Verwarm het monster in een magnetron gedurende 20-30 s en breng het vervolgens op kamertemperatuur (RT).
- Voeg 3 ml 5x Tris/boraat/EDTA (TBE) buffer (Tabel der Materialen), 2,25 ml 40% (w/v) acrylamide/bis (19:1), 75 μL 10x ammoniumperssulfaat en 15 μL tetramethylethyleendiamine toe aan de oplossing.
- Giet de geloplossing onmiddellijk langzaam in de gelcassettehouder, waarbij de vorming van luchtbellen wordt vermeden.
- Genereren van smeltprofielen met behulp van de μTGGE-eenheid
- Gebruik de geminiaturiseerde, economische versie van het μTGGE-apparaat in figuur 2 met een temperatuurgradiënt (25-65 °C) die loodrecht op de richting van de DNA-migratie is ingesteld.
- Week de bovenste en onderste elektroforesebufferpads (0,5 cm x 2,5 cm) in 2 ml 1x TBE-buffer.
- Plaats de gelcassette in de horizontale elektroforesekamer en plaats de bovenste en onderste bufferpads dienovereenkomstig, zoals weergegeven in figuur 2.
- Laad vervolgens 10 μL van het PCR-product in de middelste (langere) put en 1 μL van het PCR-product in elke zijput.
- Sluit na 1 minuut wachten de voedingseenheid aan en lever 100 V gedurende 12 minuten bij een lineaire temperatuurgradiënt van 25-65 °C.
- Nadat de run is voltooid, haalt u de cassette eruit en verwijdert u de bovenste glazen afdekking.
- Giet 300 μL 10x SYBR Gold vlek op de gel. Visualiseer de smeltprofielen met behulp van de blauwe LED-zaklamp die in het elektroforetische apparaat ter grootte van een handpalm is geïnstalleerd.
OPMERKING: Een zacht bestand van de gelafbeelding moet worden opgeslagen voor de berekening van de Patroongelijkheidsscore (PaSS). - Herhaal elk elektroforetisch experiment 3x om de reproduceerbaarheid van de gegevens te bevestigen.
4. PaSS-berekeningen
OPMERKING: De berekeningen worden uitgevoerd met behulp van μTGGE Analyzer-software.
- Download en open de software.
- Open het JPEG-bestand met de gelafbeelding. Merk op dat de software alleen JPEG-bestanden accepteert.
- Klik op de knop Frame en selecteer het juiste gebied (frame) van de gelafbeelding.
- Klik op de knop Coördinatencorrectie en voeg twee referentiepunten toe, zoals weergegeven in figuur 1B.
- Klik op de knop Functiepunten toevoegen en voeg voorbeeldpunten toe zoals weergegeven in figuur 1B. Sla vervolgens de verwerkte gelafbeeldingsgegevens op in μTGGE (*.tgg)-indeling.
- Klik op de knop Voorbeeld en selecteer de optie Zoeken naar eenvoudige punten om twee of meer afbeeldingen te vergelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gebruik van μTGGE om veranderingen in enkelvoudige nucleotidebases in RNA-bewerkingsgebeurtenissen te identificeren
Voor dit protocol werden vier bewerkte genen gebruikt (tabel 1), waaronder het BFP-gen geproduceerd in HEK293-cellen (met C-naar-U RNA-bewerking door de deaminase-enzymen van apolipoproteïne B mRNA-bewerkingsenzymcomplex; APOBEC115), het EGFP-gen dat het okerstopcodon (TAA) bevat dat wordt geproduceerd in HEK293-cellen (met A-naar-I RNA-bewerking door adenosine-deaminase dat inwerkt op RNA 1; ADAR116), en de AT2G16586 en AT5G02670 nucleaire genen in A. thaliana17,18 (met U-to-C RNA editing). Enkele nucleotideverschillen tussen de bewerkte en overeenkomstige niet-bewerkte monsters werden bevestigd door DNA-sequencing. Vervolgens werd een μTGGE-analyse uitgevoerd om de verschillen tussen de smeltcurven van de monsters te onderzoeken (figuur 3).
Voor het C-naar-U RNA-bewerkingstype vertoonde het niet-bewerkte monster met de oorspronkelijke C-base een langer smeltpatroon op het eindsmeltpunt van de streng dan het bewerkte monster met de gemodificeerde U-base (figuur 3A). Voor het A-tot-I(G)-bewerkingstype RNA vertoonde het bewerkte monster met de gemodificeerde I(G)-basis een langer smeltpatroon op het eindsmeltpunt van de streng dan het niet-bewerkte monster met de oorspronkelijke A-base (figuur 3B). Voor het "omgekeerde" U-naar-C RNA-bewerkingstype werden twee genen geanalyseerd. Voor het AT2G16586-gen vertoonde het bewerkte monster met de gemodificeerde C-base een langer smeltpatroon tussen de streng initieel smelt- en strengsmeltpunten dan het niet-bewerkte monster met de oorspronkelijke U-basis (figuur 3C). Een vergelijkbaar patroon werd echter niet waargenomen voor het andere AT5G02670-gen (figuur 3D). Niettemin was er een duidelijk verschil tussen de niet-bewerkte en bewerkte typen op het eindsmeltpunt. Hieruit blijkt dat het duidelijk waarnemen van smeltprofielen een belangrijke stap is in het onderscheid tussen niet-bewerkte en bewerkte typen.
Kwantitatieve analyse van μTGGE-smeltpatronen die RNA-bewerkingsgebeurtenissen vertegenwoordigen
Vervolgens berekenden we PaSS-waarden11 om de reproduceerbaarheid te evalueren van de op μTGGE gebaseerde smeltprofielen die de vier hierboven beschreven RNA-bewerkingsgebeurtenissen vertegenwoordigen. De PaSS-waarde geeft een maat voor hoe dicht twee smeltpatronen kunnen worden gesuperponeerd, waardoor een hogere waarde (maximaal: 1) wordt gegenereerd voor zeer vergelijkbare smeltpatronen. PaSS-waarden voor vergelijkingen van niet-bewerkte en bewerkte voorbeelden zullen dus naar verwachting minder dan één zijn. Zoals te zien is in figuur 1B, werden de kenmerkpunten van de smeltpatronen die overeenkwamen met structurele overgangen van dubbelstrengs naar enkelstrengs DNA gebruikt om PaSS-waarden te berekenen. Om experimentele variabelen te elimineren, werd computerondersteunde normalisatie uitgevoerd met behulp van twee interne referentiepunten: referentiepunt # 1, dat de positie van het monster in dubbelstrengsvorm weergeeft (de meest linkse rijstrook), en referentiepunt # 2, dat de positie van het monster in enkelstrengsvorm vertegenwoordigt (de meest rechtse rijstrook). De coördinaten van de objectpunten werden genormaliseerd naar die van de interne referentiepunten en werden vervolgens gebruikt om de PaSS-waarden te berekenen. Elk experiment werd drie keer herhaald en de gemiddelde waarde werd bepaald. Zoals verwacht waren de PaSS-waarden van de vier bewerkte monsters lager dan één (figuur 4). De PaSS-waarden van de C-to-you- en A-to-I RNA-bewerkingstypen waren lager dan die van de twee U-naar-C-RNA-bewerkingstypen. Dit verschil heeft waarschijnlijk te maken met de respectieve locaties van de bewerkingssites. In het bijzonder bevonden de C-to-you- en A-to-I-bewerkte sites zich relatief dicht bij de 5'-terminale uiteinden (op posities 48 en 59 van de ~ 300 bp-fragmenten, respectievelijk), terwijl de U-tot-C bewerkte sites zich in het midden van de fragmenten bevonden (op posities 152 en 169). Deze bevindingen suggereren dat bewerkte locaties op eindposities gemakkelijker kunnen worden gedetecteerd met behulp van μTGGE dan die in de richting van het midden van fragmenten.
Optimalisatie van TGGE-smeltpatronen om RNA-bewerkingsgebeurtenissen te identificeren
Omdat onze eerdere resultaten suggereerden dat de PaSS-waarde kan variëren afhankelijk van de specifieke positie van de RNA-bewerkingsplaats, onderzochten we de verschillen tussen de smeltpatronen van een 300 bp-fragment van het BFP-gen (uitgedrukt in HEK293T-cellen) waarin een C-naar-U bewerkte site zich dicht bij het 5'-terminale uiteinde bevond, dicht bij het 3'-terminale uiteinde, of in het midden van het fragment (figuur 5A). Voorafgaand aan de μTGGE-analyse werden de smeltpatronen van het niet-bewerkte fragment en drie bewerkte fragmenten voorspeld met behulp van de webgebaseerde tool uMelt HETS. Deze analyse toonde aan dat de C-naar-U-modificatie naar verwachting de smeltcurve langs de temperatuuras naar links zou verschuiven (figuur 5B). De PaSS-waarden berekend op basis van μTGGE-analyses van de niet-bewerkte en de drie bewerkte fragmenten werden als volgt geordend: 5'-terminale eind-RNA-bewerking < 3'-terminale eind-RNA-bewerking < midden van 5'- en 3'-terminale uiteinden RNA-bewerking (figuur 5C). Met name deze PaSS-waarden waren consistent met de resultaten die werden voorspeld met behulp van uMelt. Deze bevindingen geven aan dat nucleotidebasisverschillen aan het 5'- of 3'-terminale eind resulteren in grotere variaties tussen de PaSS-waarden van bewerkte en niet-bewerkte genen dan nucleotidebasisverschillen die zich centraler bevinden. Bovendien suggereren deze resultaten dat voorkennis van de verschillen tussen de smeltprofielen van bewerkte en niet-bewerkte genen kan worden gebruikt als een gids om genfragmenten te optimaliseren voor RNA-bewerking.
Figuur 1: De procedure die wordt gebruikt om RNA-bewerking door μTGGE te identificeren. (A) De soorten RNA-bewerkingsgebeurtenissen die worden onderzocht. (B) Een schematische illustratie van de typische smeltprofielen van bewerkte en niet-bewerkte genen. In μTGGE migreert een monster door een temperatuurgradiëntgel, waardoor een karakteristieke kromming ontstaat. De kenmerkpunten van het smeltpatroon worden toegewezen en vervolgens verwerkt om een PaSS-waarde (Pattern Similarity Score) te berekenen. De PaSS-berekening wordt uitgevoerd zoals weergegeven in de vergelijking, waarbij de vector P van elk kenmerkpunt zich in zijn overeenkomstige positie bevindt en de functie van temperatuur en mobiliteit (d.w.z. vector P = P (T, m)). De superscripten (1) en (2) vertegenwoordigen respectievelijk de bewerkte en niet-bewerkte genen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Illustraties en foto's van het gel-elektroforeseapparaat ter grootte van een handpalm. (A) Montage van de drie 1 in gelcassettes. (B) Illustratie van de gelcassettehouder met de temperatuurgradiëntplaat. De foto toont de posities van de bovenste en onderste bufferpads, evenals die van het monster na de eerste belasting. (C) Overzicht van het complete systeem, inclusief de voeding, het horizontale gel-elektroforeseplatform en het gelbeeldvormingssysteem. Dit systeem biedt een haalbare oplossing voor snelle, op polyacrylamide gel gebaseerde analyses op basis van elektroforese. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: TGGE-analyses van enkele nucleotideveranderingen in RNA-bewerkingsgebeurtenissen. Smeltprofielen voor drie verschillende RNA-bewerkingstypen werden onderzocht met behulp van vier genen. (A) C-naar-U RNA-bewerking in BFP tot expressie gebracht in HEK293T-cellen. (B) A-naar-I(G)-RNA-bewerking in EGFP-cellen, uitgedrukt in HEK293T-cellen. (C) U-to-C RNA-bewerking in het AT2G16586-gen van A. thaliana. (D) U-to-C RNA-bewerking in het AT5G02670-gen van A. thaliana. De locaties van de bewerkte sites zijn geel gemarkeerd (met rood lettertype) en de primerposities zijn onderstreept. De verschillen tussen de smeltpatronen van de bewerkte en niet-bewerkte monsters worden aangegeven door rode cirkels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: De gemiddelde PaSS-waarden voor de vier bewerkte genen die hier zijn onderzocht. Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van drie replicaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Positiespecifieke PaSS-analyse. (A) De C-naar-U-type RNA-bewerkingsplaats in het BFP-gen tot expressie gebracht in HEK293T-cellen werd verplaatst naar het 5'-terminale uiteinde, 3'-terminale uiteinde of midden van het genfragment. (B) Theoretische voorspelling van de smeltpatronen van de niet-bewerkte en drie bewerkte fragmenten weergegeven in (A). De voorspellingen werden uitgevoerd met behulp van uMelt. (C) De gemiddelde PaSS-waardenvan de bewerkte genen weergegeven in (A). Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van drie replicaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| S.No | RNA-bewerking | Bron | Positie | Gen-ID | Vooruit Primer | Omgekeerde primer | Lengte van de reeks | ||
| 1 | C-naar-U | HEK293T cellen | 48e | EGP | AAGCTGACCC TGAAGTTCATC |
GCTGTTGTAGT TGTACTCCAGC |
324 | ||
| 2 | A-tot-I | HEK293T cellen | 59e | EGP | AGGGCGATGC CACCTACGGCA |
STEGCCTCCT TTAAGTCGA |
300 | ||
| 3 | U-naar-C | Arabidopsis | 152e | AT2G16586 | GGGCGATGTT ACGCTCGATGA |
GTGAAGAGTAA CATGGCGTT |
301 | ||
| 4 | U-naar-C | Arabidopsis | 169e | AT5G02670 | CCAGTTGGCAG AATCCAGTCA |
CTAGCTTCCAC TGTTGAGATTC |
300 | ||
Tabel 1: Lijst van genen die in het huidige protocol worden gebruikt
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RNA-bewerking speelt een belangrijke rol in de biologie; de huidige methoden voor het detecteren van RNA-bewerking, zoals chromatografie en sequencing, vormen echter verschillende uitdagingen vanwege hun hoge kosten, overmatige tijdsvereisten en complexiteit. Het hier beschreven protocol is een eenvoudige, snelle en kosteneffectieve methode voor het detecteren van RNA-bewerking die een draagbaar, gemicrosized, TGGE-gebaseerd systeem gebruikt. Dit systeem kan worden gebruikt om onderscheid te maken tussen bewerkte en niet-bewerkte genen voorafgaand aan Sanger-sequencing. In het bijzonder kunnen bewerkte en niet-bewerkte genen met single-base nucleotidemodificaties worden onderscheiden op basis van veranderingen in de TGGE-smeltprofielen. Omdat het 1 in gels bevat, vereist het systeem zeer kleine hoeveelheden monsters en maakt het snelle detectie van verschillen tussen sequenties mogelijk. Bovendien is het hier beschreven protocol zeer eenvoudig te volgen voor zowel experts als nieuwkomers in het veld. Optimalisatie van het doelgenfragment is van cruciaal belang voor een duidelijke differentiatie tussen bewerkte en niet-bewerkte regio's, en dit proces is vereenvoudigd in het huidige protocol.
Dit protocol is compatibel met multiplexanalyses met fluorescerend getagde primers. Voor kwantitatieve analyses kunnen onbekende RNA-monsters (bewerkt of niet-bewerkt) worden gelabeld met groene fluorescentie en worden gecomigeerd met een rode fluorescentie-gelabelde referentiestandaard (bewerkt of niet-bewerkt) tijdens TGGE-analyse.
Naast het aantonen van het vermogen van de μTGGE-methode om enkele nucleotide RNA-bewerkingsgebeurtenissen te detecteren, valideerden we ook de gelijkenis tussen het experimentele resultaat verkregen met μTGGE en een theoretisch resultaat verkregen voor hetzelfde genfragment met behulp van uMELT. Bovendien vonden we dat nucleotidebasisverschillen op de 5'- en 3'-terminals van genfragmenten grotere verschillen in μTGGE-smeltprofielen produceren (d.w.z. kleinere PaSS-waarden) dan die in het midden van de fragmenten. Hoewel veelbelovend, kan het huidige protocol beperkt zijn tot de analyse en detectie van specifieke soorten nucleotidemodificaties tijdens RNA-bewerking. Verdere optimalisatie en ontwikkeling van dit protocol om andere typen en / of locaties van RNA-bewerking te analyseren, zal worden uitgevoerd in ons komende onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een Grant-in-Aid for Scientific Research van de Japan Society for the Promotion of Science (17H02204 en 18K19288). Ruchika werd financieel ondersteund door de Japanse overheid (MEXT-beurs). We bedanken mevrouw Radhika Biyani (Takagi Laboratory, JAIST) en Dr. Kirti Sharma (BioSeeds Corporation) voor hulp bij elektroforese-gerelateerde experimenten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2U ExoI | Takara | 2650A | Exonuclease I |
| 40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1) | Thermo fisher | AM9022 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Thermo Fisher | 17874 | |
| Centrifuge Mini spin | eppendorf | 5452000034 | |
| Digital dry bath/ block heater | Thermo fisher | NA | |
| Gold Taq Polymerase Master mixture | Promega | M7122 | |
| LATaq DNA polymerase | TAKARA | RR002A | Taq Polymerase |
| micro-TGGE cassette holder | BioSeeds Corp. | BS-GE-CH | |
| micro-TGGE apparatus | Lifetech Corp. | TG | |
| micro-TGGE gel cassette | BioSeeds Corp. | BS-TGGE-C | |
| NanoDrop 1000 | Thermo fisher | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Plant Rneasy Mini kit | Qiagen | 74904 | |
| ReverTra Ace Master Mix | TOYOBO | TRT101 | M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | Takara | 2660B | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Thermo fisher | S11494 | |
| TBE buffer | Thermo fisher | B52 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai tesque | 33401-72 | |
| Urea, Nuclease and protease tested | Nacalai tesque | 35940-65 |
References
- Chateigner-Boutin, A. L., Small, I. A rapid high-throughput method for the detection and quantification of RNA editing based on high-resolution melting of amplicons. Nucleic Acids Research. 35 (17), 114 (2007).
- Chen, Y. C., et al. A real-time PCR method for the quantitative analysis of RNA editing at specific sites. Analytical Biochemistry. 375 (1), 46-52 (2008).
- Barbon, A., Vallini, I., La Via, L., Marchina, E., Barlati, S. Glutamate receptor RNA editing: a molecular analysis of GluR2, GluR5 and GluR6 in human brain tissues and in NT2 cells following in vitro neural differentiation. Molecular Brain Research. 117 (2), 168-178 (2003).
- Gallo, A., Thomson, E., Brindle, J., O'Connell, M. A., Keegan, L. P. Micro-processing events in mRNAs identified by DHPLC analysis. Nucleic Acids Research. 30 (18), 3945-3953 (2002).
- Schiffer, H. H., Heinemann, S. F. A Quantitative method to detect RNA editing events. Analytical Biochemistry. 276 (2), 257-260 (1999).
- Burns, C. M., et al. Regulation of serotonin-2C receptor G-protein coupling by RNA editing. Nature. 387 (6630), 303-308 (1997).
- Marian, A. J.
- Bird, A. Genome biology: Not drowning but waving. Cell. 154 (5), 951-952 (2013).
- Jones, B. M., Knapp, L. A. Temporal temperature gradient electrophoresis for detection of single nucleotide polymorphisms. Methods in Molecular Biology. 578, Clifton, N.J. 153-165 (2009).
- Riesner, D., et al. Temperature-gradient gel electrophoresis of nucleic acids: analysis of conformational transitions, sequence variations, and protein-nucleic acid interactions. Electrophoresis. 10 (5-6), 377-389 (1989).
- Biyani, M., Nishigaki, K. Hundred-fold productivity of genome analysis by introduction of micro-temperature gradient gel electrophoresis. Electrophoresis. 22 (1), 23-28 (2001).
- Rathore, H., Biyani, R., Kato, H., Takamura, Y., Biyani, M. Palm-size and one-inch gel electrophoretic device for reliable and field-applicable analysis of recombinase polymerase amplification. Analytical Methods. 11 (39), 4969-4976 (2019).
- Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI Reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
- Bhakta, S., Sakari, M., Tsukahara, T. RNA editing of BFP, a point mutant of GFP, using artificial APOBEC1 deaminase to restore the genetic code. Scientific Reports. 10 (1), 17304 (2020).
- Azad, T. A., Qulsum, U., Tsukahara, T. Comparative activity of adenosine deaminase acting on RNA (ADARs) isoforms for correction of genetic code in gene therapy. Current Gene Therapy. 19 (1), 31-39 (2019).
- Ruchika, O. C., Sakari, M., Tsukahara, T. Genome-wide identification of U-To-C RNA editing events for nuclear genes in Arabidopsis thaliana. Cells. 10 (3), 635 (2021).
- Tsukahara, T. The U-to-C RNA editing affects the mRNA stability of nuclear genes in Arabidopsis thaliana. Biochemical and Biophysical Research Communications. 571, 110-117 (2021).
