Summary
A detecção rápida e a quantificação confiável dos eventos de edição de RNA em escala genômica permanecem desafiadoras e atualmente dependem de métodos de sequenciamento direto de RNA. O protocolo descrito aqui usa a eletroforese de gel de gradiente de microtemperatura (μTGGE) como um método simples, rápido e portátil de detectar a edição de RNA.
Abstract
A edição de RNA é um processo que leva a alterações de sequência pós-transcricional em RNAs. A detecção e quantificação da edição de RNA dependem principalmente de técnicas de sequenciamento de Sanger e sequenciamento de RNA. No entanto, esses métodos podem ser caros e demorados. Neste protocolo, um sistema portátil de eletroforese de gel de microtemperature (μTGGE) é usado como uma abordagem de não-sequenciamento para a rápida detecção da edição de RNA. O processo é baseado no princípio da eletroforese, que usa altas temperaturas para desnaturar amostras de ácido nucleico enquanto se movem através de um gel de poliacrilamida. Através de uma série de temperaturas, um fragmento de DNA forma um gradiente de DNA totalmente duplo para fios parcialmente separados e, em seguida, para DNA totalmente separado de uma única cadeia. Sites editados por RNA com bases nucleotídeas distintas produzem diferentes perfis de fusão em análises μTGGE. Utilizamos a abordagem baseada em μTGGE para caracterizar as diferenças entre os perfis de fusão de quatro fragmentos de RNA editados e seus fragmentos não ditados correspondentes (tipo selvagem). Os Escores de Similaridade do Padrão (PaSSs) foram calculados comparando-se os padrões de banda produzidos pelas RNAs editadas e não diutadas e foram utilizados para avaliar a reprodutibilidade do método. No geral, a plataforma descrita aqui permite a detecção de mutações de base única em RNAs de forma simples, simples e econômica. Espera-se que esta ferramenta de análise ajude novas descobertas de biologia molecular.
Introduction
Variantes de nucleotídeos únicos (SNVs) em RNA genômica, incluindo variantes A-to-I, C-to-U e U-to-C, podem indicar eventos de edição de RNA. No entanto, a detecção de SNVs no RNA continua sendo uma tarefa tecnicamente desafiadora. Convencionalmente, a razão de RNA editado para RNA não diquedado é determinada por sequenciamento direto, reação em cadeia de polimerase em tempo real (PCR) específica de alelo ou cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) se aproximade 1,2,3,4,5,6. No entanto, essas abordagens não são particularmente tempo ou custo-benefício, e suas baixas precisãos, causadas por altos níveis de ruído, representam gargalos tecnológicos para a detecção de SNV baseada em RNA 7,8. Aqui, descrevemos um protocolo baseado na eletroforese de gel gradiente de temperatura (TGGE) para identificar polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs) como um método alternativo que elimina a necessidade de abordagens diretas de sequenciamento de RNA para análises de edição de RNA.
A eletroforese é um método preferido para a separação e análise de biomoléculas em laboratórios de ciências da vida. O TGGE permite a separação de fragmentos de DNA de duplas vertentes que têm o mesmo tamanho, mas têm sequências diferentes. A técnica conta com diferenças relacionadas à sequência nas temperaturas de fusão dos fragmentos de DNA e mudanças subsequentes em suas mobilidades em géis porosos com um gradiente linear de temperatura 9,10. O derretimento de fragmentos de DNA gera perfis específicos de fusão. Uma vez que o domínio com a menor temperatura de fusão atinge a temperatura correspondente em uma posição particular no gel, a transição de uma estrutura helicoidal para uma estrutura parcialmente derretida ocorre, e a migração da molécula praticamente parará. Portanto, o TGGE utiliza tanto a mobilidade (informação de tamanho) quanto transições estruturais induzidas pela temperatura de fragmentos de DNA (informações dependentes de sequências), tornando-se uma abordagem poderosa para a caracterização de fragmentos de DNA. Os pontos de característica em um padrão de fusão TGGE, que correspondem a três transições estruturais da molécula de DNA, são o ponto de dissociação inicial da cadeia, o ponto de dissociação do fio médio e o ponto de dissociação final do fio (Figura 1). Variações sequenciais dentro dos domínios, mesmo diferenças de base única, afetam a temperatura de fusão, portanto, moléculas com diferentes sequências mostrarão padrões discretos de fusão (desnaturação) nas análises TGGE. Portanto, o TGGE pode ser usado para analisar SNVs no RNA genômico e pode ser um método inestimável de alto rendimento de detectar edição de RNA. Este ganho de alta produtividade é perdido quando o TGGE tradicional baseado em eletroforese em gel é usado. No entanto, uma versão miniaturizada de TGGE, chamada microTGGE (μTGGE), pode ser usada para encurtar o tempo eletroforético do gel e acelerar a análise com um aumento de 100 vezes na produtividade11. A simplicidade e compactação do método μTGGE foram melhoradas com a introdução do PalmPAGE12, um sistema de eletroforese gel aplicável em campo, portátil e acessível.
Aqui, um novo protocolo baseado em TGGE é usado para examinar três tipos de sites de edição de RNA (A-to-I, C-to-U e U-to-C) em quatro genes, incluindo dois de tecidos arabidopsis thaliana e dois expressos em células de mamíferos HEK293 (Figura 1A). O protocolo integra o uso do PalmPAGE (hardware), um sistema portátil para detecção rápida de edição de RNA e uMelt (software)13. Com um tempo médio de execução de 15-30 minutos, este protocolo permite uma identificação rápida, confiável e fácil da edição de RNA sem a necessidade de abordagens diretas de sequenciamento de RNA.
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Protocol
1. Otimização do fragmento de destino
NOTA: Quatro genes editados foram usados no desenvolvimento deste protocolo, incluindo dois genes nucleares (AT2G16586 e AT5G02670) de A. thaliana, e os genes codificando proteína fluorescente azul (BFP) e proteína fluorescente verde aumentada (EGFP) expressa em células HEK293.
- Para identificar fragmentos genéticos com diferentes perfis de fusão, representando regiões editadas versus não diutadas, gerar curvas de fusão previstas usando a ferramenta baseada na web uMelt HETS, uma extensão do software uMeltoriginal 13.
NOTA: Esta ferramenta prevê as formas de derretimento das curvas para produtos heteroduplex e homoduplex. - Para cada gene alvo, projete três pares de fragmentos genéticos (300-324 bp de comprimento). Cada par é composto por um fragmento com um local editado e um fragmento de tipo selvagem correspondente com um local não diutado, localizado na extremidade terminal de 5'terminal, posição média ou 3'-terminal final.
- Selecione o par não diutado/editado que mostrou a diferença máxima entre as regiões de fusão no eixo de helicidade para análise posterior. Para análise μTGGE, sintetize o fragmento genético selecionado por amplificação PCR, conforme descrito na seção 2 abaixo.
- Projete os primers para frente e para trás usando o software DNADynamo (https://www.bluetractorsoftware.com/DynamoDemo.htm) e verifique usando a ferramenta NCBI Primer-BLAST.
- Diluir os primers no buffer TE (10 mM Tris-HCl contendo 1 mM EDTA· Na2) e armazená-los a uma concentração de 100 pmol/μL. Antes de usar, diluir cada primer ajustado para uma concentração de 10 pmol/μL usando água destilada.
2. Extração de RNA e amplificação RT-PCR do fragmento de destino
- Extração de RNA
- Extrair RNA total da fonte de genes editados e não ditados usando métodos padrão, como a extração TRIzol14 ou kits disponíveis comercialmente.
- Realize a síntese do cDNA correspondente usando um protocolo RT-PCR padrão, conforme descrito na etapa 2.2.
- Transcrição reversa
- Adicione 1 μL de primer oligo(dT), 1 μL de mistura dNTP de 10 mM, 10 μL de RNA total e 10 μL de água destilada estéril a um tubo de microcentrifuge sem nuclease.
- Aqueça a mistura a 65 °C por 5 min e depois incubar no gelo por pelo menos 1 min.
- Colete o conteúdo do tubo por centrifugação em velocidade máxima (12.000 x g) para 2-3 s, e adicione 4 μL de tampão 5x ReverTra Ace, 1 μL de 0,1 M DTT e 1 μL de M-MLV (Moloney Murine Leucemia Virus) transcrição reversa (200 U/μL, Tabela de Materiais).
- Misture por pipetting para cima e para baixo suavemente. Se usar primers aleatórios, incubar o tubo a 25 °C por 5 min.
- Incubar o tubo a 55 °C por 60 min e, em seguida, inativar a reação aquecendo a 70 °C por 15 min, em um aquecedor digital seco/bloco.
- Meça a concentração de cDNA usando um espectotômetro e armazene-a a -25 °C.
-
Amplificação pcr e sequenciamento confirmatório de produtos
- Adicione os seguintes reagentes a um tubo de microcentrifuge sem nuclease: 4 μL de 5x Taq Polymerase Buffer, 2 μL de 2 mM dNTP mix, 2 μL de 25 mM MgCl2, 1,6 μL do conjunto primer (para frente e para trás; cada 10 mM), 2 μL de modelo cDNA, 0,1 μL de polimerase Taq (2,5 U/μL) e 8,3 μL de água destilada estéril (volume final, 20 μL).
- Realizar PCR com as seguintes condições de ciclismo: desnaturação inicial a 95 °C por 2 min; 35 ciclos de desnaturação a 95 °C por 2 min, ressarnamento a uma temperatura adequada (dependendo do conjunto específico de primer utilizado) para 30 s, e extensão a 72 °C por 2 min; e, em seguida, uma extensão final a 72 °C para 7 min.
- Para purificar os produtos PCR, adicione 2 U de Exonuclease I e 0,5 U de fosfatase alcalina de camarão (ExoSAP). Incubar o tubo em um cicloviário térmico a 37 °C por 1h, seguido de 80 °C por 15 min e, em seguida, manter a 4 °C até o próximo passo.
- Para sequenciamento confirmatório, adicione 11,5 μL de água destilada estéril, 2,5 μL de primer dianteiro ou reverso e 1 μL de produtos PCR (com ExoSAP) a um novo tubo de microcentrifuge.
NOTA: Use serviços de sequenciamento de DNA (por exemplo, Genômica Eurofins) para análise de sequenciamento. - Para validar a especificidade dos produtos PCR, realize o sequenciamento com primers dianteiros e invertidos. Os pares de primer utilizados na análise representativa são dados na Tabela 1.
- Diluir os produtos PCR purificados a uma concentração de 200 ng/μL com água deionizada. Em seguida, misture 6 μL do produto purificado com 3 μL de corante de carregamento de gel de 6x em um tubo de 250 μL e eleve o volume total para 12 μL com água estéril. Armazene o produto PCR (a -25 °C) até que esteja pronto para prosseguir com o μTGGE conforme descrito abaixo.
3. análise μTGGE
NOTA: A análise μTGGE é realizada utilizando um sistema miniaturizado e econômico. Uma visão geral do sistema completo, incluindo as fitas de gel, porta-fitas de gel, plataforma horizontal de eletroforese de gel, fonte de alimentação e sistema de imagem de gel, é mostrada na Figura 2.
- Montagem das fitas de gel
- O de gel usado para análise μTGGE é mostrado na Figura 2A. O design consiste em três placas de gel de 1 polegada: uma placa de gel inferior, uma placa de gel superior, e uma placa de pista anterior. Sanduiche a placa de gel superior entre as outras duas placas e monte no porta-fitas de gel para polimerização de gel.
- Preparação de gel de poliacrilamida
- Adicione 7,2 g de ureia a um tubo de 50 mL e dissolva em 10 mL de água estéril. Aqueça a amostra em um micro-ondas para 20-30 s e, em seguida, leve-a à temperatura ambiente (RT).
- Adicione 3 mL de tampão tris/borate/EDTA (TBE) (Tabela de Materiais), 2,25 mL de 40% (w/v) acrilamida/bis (19:1), 75 μL de persulor de amônio 10x e 15 μL de tetrametilenodiamina à solução.
- Despeje imediatamente a solução de gel no suporte de de gel lentamente, evitando a formação de bolhas de ar.
- Geração de perfis de fusão usando a unidade μTGGE
- Use a versão miniaturizada e econômica do aparelho μTGGE mostrado na Figura 2 com um gradiente de temperatura (25-65 °C) definido perpendicular à direção da migração de DNA.
- Mergulhe as almofadas tampão de eletroforese superior e inferior (0,5 cm x 2,5 cm) em 2 mL de tampão TBE 1x.
- Coloque o de gel na unidade horizontal de câmara de eletroforese e posicione as almofadas tampão superior e inferior em conformidade, conforme mostrado na Figura 2.
- Em seguida, carregue 10 μL do produto PCR no meio (mais longo) bem e 1 μL do produto PCR em cada lado bem.
- Após uma espera de 1 minuto, conecte a unidade de alimentação e forneça 100 V por 12 minutos a um gradiente linear de temperatura de 25-65 °C.
- Depois que a corrida tiver sido concluída, retire o e remova a tampa superior do vidro.
- Despeje 300 μL de 10x mancha de ouro SYBR no gel. Visualize os perfis de fusão usando a lanterna LED azul instalada no dispositivo eletroforético do tamanho da palma da mão.
NOTA: Um arquivo macio da imagem em gel deve ser salvo para o cálculo de Pontuação de Similaridade padrão (PaSS). - Repita cada experimento eletroforético 3x para confirmar a reprodutibilidade dos dados.
4. Cálculos pass
NOTA: Os cálculos são realizados utilizando o software μTGGE Analyzer.
- Baixe e abra o software.
- Abra o arquivo JPEG contendo a imagem em gel. Observe que o software só aceitará arquivos de formato JPEG.
- Clique no botão Quadro e selecione a área apropriada (quadro) da imagem em gel.
- Clique no botão De correção de coordenadas e adicione dois pontos de referência, como mostrado na Figura 1B.
- Clique no botão Adição de Pontos de Recurso e adicione pontos de amostra conforme mostrado na Figura 1B. Em seguida, salve os dados de imagem de gel processados no formato μTGGE (*.tgg).
- Clique no botão Amostrar e selecione a opção Pesquisar por Pontos Simples para comparar duas ou mais imagens.
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Representative Results
Uso de μTGGE para identificar mudanças de base de nucleotídeos únicos em eventos de edição de RNA
Quatro genes editados foram usados para este protocolo (Tabela 1), incluindo o gene BFP produzido em células HEK293 (com edição de RNA C-to-U pelas enzimas desaminase do complexo de enzimas de edição de mRNA apolipoproteína B; APOBEC115), o gene EGFP contendo o codon ocre stop (TAA) produzido em células HEK293 (com edição de RNA A-to-I por adenosina deaminase atuando no RNA 1; ADAR116), e os genes nucleares AT2G16586 e AT5G02670 em A. thaliana17,18 (com edição de RNA U-to-C). As diferenças de nucleotídeos únicos entre as amostras editadas e correspondentes não diquedidas foram confirmadas pelo sequenciamento de DNA. Em seguida, foi realizada uma análise μTGGE para examinar as diferenças entre as curvas de fusão das amostras (Figura 3).
Para o tipo de edição de RNA C-to-U, a amostra não ditada com a base C original mostrou um padrão de fusão mais longo no ponto de fusão final do que a amostra editada com a base U modificada (Figura 3A). Para o tipo de edição de RNA A-to-I(G), a amostra editada com a base I(G) modificada exibiu um padrão de fusão mais longo no ponto de fusão final do que a amostra não ditada com a base A original (Figura 3B). Para o tipo de edição de RNA U-to-C "reverso", foram analisados dois genes. Para o gene AT2G16586, a amostra editada com a base C modificada mostrou um padrão de fusão mais longo entre os pontos de fusão inicial do fio e os pontos de fusão final do fio do que a amostra não diutada com a base u original (Figura 3C). No entanto, não foi observado um padrão semelhante para o outro gene AT5G02670 (Figura 3D). No entanto, houve uma diferença distinta entre os tipos não ditados e editados no ponto de fusão final. Isso mostra que observar perfis de fusão claramente é um passo importante para distinguir entre tipos não ditados e editados.
Análise quantitativa dos padrões de fusão μTGGE representando eventos de edição de RNA
Em seguida, calculamos os valores pass11 para avaliar a reprodutibilidade dos perfis de fusão baseados em μTGGE representando os quatro eventos de edição de RNA descritos acima. O valor PaSS fornece uma medida de quão próximos dois padrões de fusão podem ser sobrepostos, gerando um valor mais alto (máximo: 1) para padrões de fusão altamente semelhantes. Assim, espera-se que os valores de PaSS para comparações de amostras não ditadas e editadas sejam inferiores a um. Como mostrado na Figura 1B, os pontos de característica dos padrões de fusão que correspondiam a transições estruturais de DNA de dupla mente para um único fio foram usados para calcular os valores pass. Para eliminar variáveis experimentais, a normalização auxiliada por computador foi realizada utilizando-se dois pontos de referência internos: ponto de referência nº 1, representando a posição da amostra em forma dupla encalhada (a faixa mais à esquerda) e o ponto de referência nº 2, representando a posição da amostra em forma de single-stranded (a faixa mais à direita). As coordenadas dos pontos de característica foram normalizadas às dos pontos de referência internos e foram então utilizadas para calcular os valores pass. Cada experimento foi repetido três vezes, e o valor médio foi determinado. Como esperado, os valores de PaSS das quatro amostras editadas foram inferiores a uma (Figura 4). Os valores pass dos tipos de edição de RNA C-to-you e A-to-I foram inferiores aos dos dois tipos de edição de RNA U-to-C. Essa diferença provavelmente está relacionada com os respectivos locais dos sites de edição. Especificamente, os sites editados C-to-you e A-to-I estavam localizados relativamente próximos às extremidades do terminal de 5'(nas posições 48 e 59 dos fragmentos de ~300 bp, respectivamente), enquanto os locais editados U-to-C estavam localizados perto do meio dos fragmentos (nas posições 152 e 169). Esses achados sugerem que os locais editados localizados em posições terminais podem ser detectados usando μTGGE mais facilmente do que aqueles localizados em direção ao centro dos fragmentos.
Otimização dos padrões de fusão do TGGE para identificar eventos de edição de RNA
Como nossos resultados anteriores sugeriram que o valor pass pode variar dependendo da posição específica do site de edição de RNA, examinamos as diferenças entre os padrões de fusão de um fragmento de 300 bp do gene BFP (expresso em células HEK293T) em que um site editado C-to-U estava localizado perto do final terminal de 5', perto do final de 3'terminal, ou no centro do fragmento (Figura 5A). Antes da análise μTGGE, os padrões de fusão do fragmento não diutado e três fragmentos editados foram previstos usando a ferramenta baseada na web uMelt HETS. Esta análise mostrou que a modificação C-to-U seria esperada para mudar a curva de fusão para a esquerda ao longo do eixo de temperatura (Figura 5B). Os valores pass calculados a partir de análises μTGGE dos fragmentos não ditados e dos três fragmentos editados foram ordenados da seguinte forma: 5'terminal final end RNA edit < rna final de 3'terminal editar < centro de 5'- e 3'-terminal termina RNA edit (Figura 5C). Notavelmente, esses valores PaSS foram consistentes com os resultados previstos usando o uMelt. Esses achados indicam que as diferenças de base nucleotídeos localizadas na extremidade terminal de 5'ou 3'-terminal resultam em variações maiores entre os valores PaSS de genes editados e não diutados do que as diferenças de base nucleotídeos localizadas mais centralmente. Além disso, esses resultados sugerem que o conhecimento prévio das diferenças entre os perfis de fusão de genes editados e não dilatados pode ser usado como um guia para otimizar fragmentos genéticos para a edição de RNA.
Figura 1: O procedimento utilizado para identificar a edição de RNA por μTGGE. (A) Os tipos de eventos de edição de RNA examinados. (B) Uma ilustração esquemática dos perfis típicos de fusão de genes editados e não diutados. Em μTGGE, uma amostra migra através de um gel gradiente de temperatura, produzindo uma curvatura característica. Os pontos de característica do padrão de fusão são atribuídos e, em seguida, processados para calcular um valor de Pontuação de Similaridade padrão (PaSS). O cálculo pass é realizado como mostrado na equação, onde o vetor P de cada ponto de característica está em sua posição correspondente e a função de temperatura e mobilidade (ou seja, vetor P = P (T, m)). Os sobrescritos (1) e (2) representam os genes editados e não diutados, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Ilustrações e fotografias do dispositivo de eletroforese gel do tamanho da palma da mão. (A) Montagem dos três 1 em fitas de gel. (B) Ilustração do porta-fitas de gel com a placa de gradiente de temperatura. A fotografia mostra as posições das almofadas tampão superior e inferior, bem como as da amostra após o carregamento inicial. (C) Visão geral do sistema completo, incluindo a fonte de alimentação, a plataforma horizontal de eletroforese de gel e o sistema de imagem em gel. Este sistema fornece uma solução viável para análises rápidas baseadas em gel de poliacrilamida no local. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análises TGGE de mudanças de nucleotídeos únicos em eventos de edição de RNA. Perfis de fusão para três tipos diferentes de edição de RNA foram examinados usando quatro genes. (A) Edição de RNA C-to-U em células BFP expressas em células HEK293T. (B) Edição de RNA A-to-I(G) em EGFP expressa em células HEK293T. (C) Edição de RNA U-to-C no gene AT2G16586 de A. thaliana. (D) Edição de RNA U-to-C no gene AT5G02670 de A. thaliana. Os locais dos sites editados são destacados em amarelo (com fonte vermelha), e as posições de primer são sublinhadas. As diferenças entre os padrões de fusão das amostras editadas e não diutadas são indicadas por círculos vermelhos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Os valores médios de PaSS para os quatro genes editados aqui examinados. As barras de erro representam o desvio padrão de três réplicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Análise pass específica da posição. (A) O site de edição de RNA do tipo C-to-U no gene BFP expresso nas células HEK293T foi deslocado para o final de 5'terminal, final terminal de 3'-terminal ou centro do fragmento genético. (B) Previsão teórica dos padrões de fusão dos fragmentos não ditados e três editados mostrados em (A). As previsões foram realizadas utilizando-se uMelt. (C) Osvalores médios de PaSS dos genes editados mostrados em (A). As barras de erro representam o desvio padrão de três réplicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| S.No | Edição de RNA | Fonte | Posição | ID de Genes | Primer avançado | Primer reverso | Comprimento da sequência | ||
| 1 | C-to-U | Células HEK293T | 48 | EGFP | AAGCTGACCC TGAAGTTCATC |
GCTGTTGTAGT TGTACTCCAGC |
324 | ||
| 2 | A-para-I | Células HEK293T | 59 | EGFP | AGGGCGATGC CACCTACGGCA |
CCGTCCTCCT TTAAGTCGA |
300 | ||
| 3 | U-para-C | Arabidopsis | 152 | AT2G16586 | GGGCGATGTT ACGCTCGATGA |
GTGAAGAGTAA CATGGCGTT |
301 | ||
| 4 | U-para-C | Arabidopsis | 169 | AT5G02670 | CCAGTTGGCAG AATCCAGTCA |
CTAGCTTCCAC TGTTGAGATTC |
300 | ||
Tabela 1: Lista de genes usados no protocolo atual
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Discussion
A edição de RNA desempenha um papel importante na biologia; no entanto, os métodos atuais de detecção da edição de RNA, como cromatografia e sequenciamento, apresentam vários desafios devido ao seu alto custo, exigências de tempo excessivo e complexidade. O protocolo descrito aqui é um método simples, rápido e econômico de detectar a edição de RNA que usa um sistema portátil, microdimensionado, baseado em TGGE. Este sistema pode ser usado para diferenciar entre genes editados e não dilatados antes do sequenciamento de Sanger. Especificamente, genes editados e não dilatados com modificações de nucleotídeos de base única podem ser diferenciados com base em alterações nos perfis de fusão TGGE. Como incorpora 1 em géis, o sistema requer quantidades muito pequenas de amostras e permite a detecção rápida de diferenças entre sequências. Além disso, o protocolo aqui descrito é muito fácil de seguir tanto para especialistas quanto para recém-chegados ao campo. A otimização do fragmento genético alvo é fundamental para uma clara diferenciação entre regiões editadas e não diutadas, e esse processo é simplificado no protocolo atual.
Este protocolo é compatível com análises multiplex usando primers fluorescentes. Para análises quantitativas, amostras de RNA desconhecidas (editadas ou não dilatadas) podem ser marcadas com fluorescência verde e comigadas com um padrão de referência marcado por fluorescência vermelha (editada ou não) durante a análise TGGE.
Além de demonstrar a capacidade do método μTGGE de detectar eventos únicos de edição de RNA nucleotídeos, também validamos a semelhança entre o resultado experimental obtido usando μTGGE e um resultado teórico obtido para o mesmo fragmento genético usando uMELT. Além disso, descobrimos que as diferenças de base nucleotídea localizadas nos terminais de 5'e 3'-terminais de fragmentos genéticos produzem diferenças maiores nos perfis de fusão μTGGE (ou seja, menores valores pass) do que aqueles localizados em direção ao centro dos fragmentos. Embora promissor, o protocolo atual pode estar limitado à análise e detecção de tipos específicos de modificações de nucleotídeos durante a edição de RNA. Mais otimização e desenvolvimento deste protocolo para analisar outros tipos e/ou locais de edição de RNA serão realizados em nossa próxima pesquisa.
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Disclosures
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por um Grant-in-Aid for Scientific Research da Japan Society for the Promotion of Science (17H02204 e 18K19288). Ruchika foi apoiado financeiramente pelo governo japonês (bolsa MEXT). Agradecemos à Sra. Radhika Biyani (Laboratório Takagi, JAIST) e Dr. Kirti Sharma (BioSeeds Corporation) por ajuda com experimentos relacionados à eletroforose.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2U ExoI | Takara | 2650A | Exonuclease I |
| 40(w/v)%-acrylamide/bis (19:1) | Thermo fisher | AM9022 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Thermo Fisher | 17874 | |
| Centrifuge Mini spin | eppendorf | 5452000034 | |
| Digital dry bath/ block heater | Thermo fisher | NA | |
| Gold Taq Polymerase Master mixture | Promega | M7122 | |
| LATaq DNA polymerase | TAKARA | RR002A | Taq Polymerase |
| micro-TGGE cassette holder | BioSeeds Corp. | BS-GE-CH | |
| micro-TGGE apparatus | Lifetech Corp. | TG | |
| micro-TGGE gel cassette | BioSeeds Corp. | BS-TGGE-C | |
| NanoDrop 1000 | Thermo fisher | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Plant Rneasy Mini kit | Qiagen | 74904 | |
| ReverTra Ace Master Mix | TOYOBO | TRT101 | M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase | Takara | 2660B | |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | Thermo fisher | S11494 | |
| TBE buffer | Thermo fisher | B52 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai tesque | 33401-72 | |
| Urea, Nuclease and protease tested | Nacalai tesque | 35940-65 |
References
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