Denne protokol beskriver metoden til genetisk at ablate retinal pigmentepitel (RPE) ved hjælp af en transgen zebrafiskmodel. Tilpasning af protokollen til at inkorporere signalvejsmodulering ved hjælp af farmakologiske forbindelser er udførligt detaljeret. En MATLAB-platform til kvantificering af RPE-regenerering baseret på pigmentering blev udviklet og præsenteres og diskuteres.
Retinalpigmentepitelet (RPE) befinder sig på bagsiden af øjet og udfører funktioner, der er afgørende for at opretholde sundheden og integriteten af tilstødende retinale og vaskulære væv. På nuværende tidspunkt har den begrænsede reparative kapacitet hos pattedyrs RPE, som er begrænset til små skader, hindret fremskridt med hensyn til at forstå in vivo RPE regenerative processer. Her tilvejebringes en detaljeret metode til at lette undersøgelsen af in vivo RPE-reparation ved hjælp af zebrafisken, en hvirveldyrmodel, der er i stand til robust vævsregenerering. Denne protokol beskriver et transgent nitroreduktase/metronidazol (NTR/MTZ)-medieret skadesparadigme (rpe65a:nfsB-eGFP), som resulterer i ablation af de centrale to tredjedele af RPE efter 24 timers behandling med MTZ med efterfølgende vævsgenopretning. Der fokuseres på RPE-ablationer i larvezebrafisk, og metoder til test af farmakologiske forbindelsers virkninger på RPE-regenerering er også skitseret. Generering og validering af RpEGEN, et MATLAB-script oprettet for at automatisere kvantificering af RPE-regenerering baseret på pigmentering, diskuteres også. Ud over aktive RPE-reparationsmekanismer kan denne protokol udvides til undersøgelser af RPE-degeneration og skadesresponser samt virkningerne af RPE-skader på tilstødende retinale og vaskulære væv, blandt andre cellulære og molekylære processer. Dette zebrafiskesystem har et betydeligt løfte om at identificere gener, netværk og processer, der driver RPE-regenerering og RPE-sygdomsrelaterede mekanismer, med det langsigtede mål at anvende denne viden på pattedyrssystemer og i sidste ende mod terapeutisk udvikling.
Metoden beskrevet heri beskriver en protokol til genetisk ablat retinal pigmentepitel (RPE) ved hjælp af larvezebrafisk. RPE strækker sig over bagsiden af øjet og befinder sig mellem de stratificerede lag af den neurale nethinde og det lag af vaskulatur, der udgør choroid. Trofisk støtte, absorption af fototoksisk lys og vedligeholdelse af visuelle cyklusproteiner er kun nogle af de kritiske funktioner, RPE udfører, der er afgørende for at opretholde sundheden og integriteten af disse tilstødende væv1. Skader på pattedyrs RPE kan repareres, når læsionerne er små2; Skader, der er lidt af større skader eller progressiv degenerativ sygdom, er imidlertid irreversible. Hos mennesker fører RPE-degenerative sygdomme (f.eks. Aldersrelateret makuladegeneration (AMD) og Stargardt-sygdom) til permanent synstab og, med få behandlingsmuligheder til rådighed, nedsat patientkvalitet. Den begrænsede evne for pattedyrs RPE til selvreparation har skabt et vidensgab inden for RPE-regenerative processer. I betragtning af zebrafiskens robuste regenerative kapacitet på tværs af mange forskellige vævstyper blev denne protokol udviklet til at etablere et in vivo-hvirveldyrsystem for at lette undersøgelser af iboende regenerering af RPE og afdække mekanismer, der driver dette svar. Ved hjælp af ablationsparadigmet, der er skitseret her, er den kanoniske Wnt-signalvej3, mTOR-vejen4 og immunrelaterede responser5 blevet identificeret som kritiske mediatorer for RPE-regenerering, sandsynligvis med overlappende funktioner.
I dette genetiske ablationsparadigme udtrykker Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 zebrafisk det bakterieafledte nitroreduktase (NTR/nfsB) gen6 smeltet sammen med eGFP under kontrol af RPE-forstærkerelementet, rpe65a7. Ablation opnås ved at tilsætte prodrug, metronidazol (MTZ), til systemvand, der huser zebrafisk. Intracellulær aktivering af MTZ ved nitroreductase resulterer i DNA-tværbinding og apoptose i NTR/nfsB-ekspressionerende celler 8,9. Denne teknologi er blevet anvendt i vid udstrækning i zebrafisk til at ablatere celler i nethinden 10,11,12,13 og andre væv 8. Tilsammen muliggør disse elementer målrettet ekspression (rpe65a) af en inducerbar celleablationsmetode (NTR/MTZ)8,9 og en fluorescerende markør (eGFP) til visualisering.
Der findes også andre interessante in vivo-modeller, der kan bruges til at studere RPE14’s regenerative potentiale. Disse er brede og omfatter RPE-til-retina transdifferentiering post-retinektomi hos padder, hvor RPE-celler tabt til retinal genvækst erstattes15,16; RPE-restaurering efter skade i “super healing” MRL / MpJ-musen17; og eksogen stimulering af RPE-spredning i en rottemodel af spontan RPE og retinal degeneration18, blandt andre. Der er også udviklet in vitro-modeller, f.eks. voksne humane RPE-stamceller (RPESC’er)19. Disse modeller er alle værdifulde værktøjer, der arbejder for at afdække de cellulære processer relateret til RPE-regenerering (f.eks. Spredning, differentiering osv.); zebrafisken er dog unik i sin evne til iboende RPE-reparation efter ablation.
Mens metoden her er skrevet for at fokusere på at forstå de mekanismer, der driver RPE-regenerering, kan Tg (rpe65a: nfsB-eGFP) -linjen og denne genetiske ablationsprotokol bruges til at studere andre cellulære processer såsom RPE-apoptose, RPE-degeneration og effekten af RPE-skade på tilstødende retinale og vaskulære væv. Ablationsprotokollen kan også ændres til at omfatte farmakologisk manipulation, hvilket er en bekvem foreløbig strategi til at screene signalveje af interesse. For eksempel har blokering af den kanoniske Wnt-vej ved hjælp af Inhibitor of Wnt Response-1 (IWR-1)20 vist sig at forringe RPE-regenerering3. Dette blev gentaget her for at guide brugerne gennem et farmakologisk manipulationseksperiment og tjene som proof-of-concept for at validere et MATLAB-script (RpEGEN), der blev oprettet for at kvantificere RPE-regenerering baseret på genopretning af pigmentering. Ligesom den transgene linje og ablationsprotokollen er RpEGEN-scripts tilpasningsdygtige og kan bruges til at kvantificere andre markører / cellulære processer inden for RPE.
Denne protokol beskriver metoden til genetisk ablat rpE og undersøgelsesmekanismer for degeneration og regenerering i larvelagrede zebrafisk. Denne protokol er også blevet udført med succes i voksne zebrafisk3, men med mindre omfattende karakterisering, hvorfor larver er i fokus her. Kritiske aspekter af denne del af protokollen (trin 1-4) omfatter: 1) tilføjelse af 1,5x PTU til embryoner før begyndelsen af melanogenese, 2) deforkortende PTU-behandlede embryoner på 2-3 dpf, 3) omhyggelig scr…
The authors have nothing to disclose.
Arbejdet beskrevet heri blev støttet af National Institutes of Health (RO1-EY29410 til J.M.G og NIH CORE Grant P30-EY08098 til Institut for Oftalmologi); UPMC Immune Transplant & Therapy Center (til L.L.L. og J.M.G.); og E. Ronald Salvitti Chair i oftalmologiforskning (til J.M.G.). Yderligere støtte blev modtaget fra Wiegand Fellowship in Ophthalmology (til L.L.L), Eye & Ear Foundation of Pittsburgh og et ubegrænset tilskud fra Research to Prevent Blindness, New York, NY. Forfattere vil også gerne takke Amanda Platt for teknisk bistand og Dr. Hugh Hammer og akvatikpersonalet for fremragende dyreplejestøtte.
Lab Material/Equipment | |||
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI) | Millipore Sigma | D9542 | |
6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-539-13 | Catalog number is for 50 mL tubes |
Diamond tip scribing pen | Fisher Scientific | 50-254-51 | Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 % | Fisher Scientific | BP231 | Check instiutional chemical waste disposal requirements |
Embryo incubator (large) | Fisher Scientific | 3720A | |
Embryo incubator (mini/tabletop) | Labnet | I5110A | |
Fluorescence stereo microscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | Or similar, with 488 nm excitation laser/filter |
Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-4 | Manufactured by Corning, non-sterile |
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo | Millipore Sigma | 5.04462 | Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements |
Methylene blue (powder) | Fisher Scientific | BP117-100 | Also available as a premade aqeuous solution |
Metronidazole (MTZ) | Millipore Sigma | M3761 | Check instiutional chemical waste disposal requirements |
N-phenylthiourea (PTU) | Millipore Sigma | P7629 | Check instiutional chemical waste disposal requirements |
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free | Fisher Scientific | AA433689M | Chemical waste, proper disposal required |
Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | 10 cm diameter |
Phosphate buffered saline (powder packets) | Millipore Sigma | P3813 | Used to make 10 X PBS stock |
Pronase | Millipore Sigma | PRON-RO | |
Shaking incubator | Benchmark | H2010 | Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius |
Stereo microscope | Leica | S9i | Or similar, with transmitted light illumination |
Student Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Fine-tipped forceps for manual dechorionation |
Tabletop rotator/shaker | Scilogex | SK-D1807-E | |
Transfer pipette | Millipore Sigma | Z135003 | 3.2 mL bulb draw, non-sterile |
Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Pentair | TRS1, TRS2, TRS5 | Also available from Fisher Scientific (NC0342409) |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
Software Material | |||
FIJI (Fiji is Just ImageJ) | FIJI (Fiji is Just ImageJ) | https://imagej.net/software/fiji/ | Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats |
GRAMM examples and how-tos | MathWorks | https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like. | |
MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox |
MATLAB support | MathWorks | https://www.mathworks.com/support.html |