Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الاستئصال بوساطة النيتروكتاز / ميترونيدازول ومنصة MATLAB (RpEGEN) لدراسة تجديد صبغة شبكية الزرد

Published: March 2, 2022 doi: 10.3791/63658
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Ophthalmology, Louis J. Fox Center for Vision Restoration, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Earth Research Institute, University of California, Santa Barbara, 3Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

يصف هذا البروتوكول منهجية استئصال ظهارة صبغة الشبكية وراثيا (RPE) باستخدام نموذج الزرد المعدل وراثيا. تكييف البروتوكول لدمج تعديل مسار الإشارات باستخدام المركبات الدوائية مفصل على نطاق واسع. تم تطوير منصة MATLAB لقياس تجديد RPE على أساس التصبغ ويتم تقديمها ومناقشتها.

Abstract

توجد ظهارة صبغة الشبكية (RPE) في الجزء الخلفي من العين وتؤدي وظائف ضرورية للحفاظ على صحة وسلامة أنسجة الشبكية والأوعية الدموية المجاورة. وفي الوقت الحاضر، أعاقت القدرة المحدودة على إصلاح قواعد السلوك في الثدييات، التي تقتصر على الإصابات الصغيرة، التقدم المحرز في فهم العمليات التجديدية للقواعد في الجسم الحي . هنا ، يتم توفير منهجية مفصلة لتسهيل دراسة إصلاح RPE في الجسم الحي باستخدام الزرد ، وهو نموذج فقاري قادر على تجديد الأنسجة القوية. يصف هذا البروتوكول نموذج إصابة بوساطة النيتروجين / ميترونيدازول المعدل وراثيا (NTR / MTZ) (rpe65a: nfsB-eGFP) ، والذي يؤدي إلى استئصال الثلثين المركزيين من RPE بعد 24 ساعة من العلاج باستخدام MTZ ، مع استعادة الأنسجة لاحقا. وينصب التركيز على عمليات استئصال RPE في أسماك الزرد اليرقية وطرق اختبار آثار المركبات الدوائية على تجديد RPE. كما تمت مناقشة إنشاء والتحقق من صحة RpEGEN ، وهو برنامج نصي MATLAB تم إنشاؤه لأتمتة القياس الكمي لتجديد RPE على أساس التصبغ. بالإضافة إلى آليات إصلاح RPE النشطة ، يمكن توسيع هذا البروتوكول ليشمل دراسات انحطاط RPE واستجابات الإصابة بالإضافة إلى آثار تلف RPE على أنسجة الشبكية والأوعية الدموية المجاورة ، من بين العمليات الخلوية والجزيئية الأخرى. يحمل نظام الزرد هذا وعدا كبيرا في تحديد الجينات والشبكات والعمليات التي تدفع تجديد RPE والآليات المتعلقة بأمراض RPE ، مع هدف طويل الأجل يتمثل في تطبيق هذه المعرفة على أنظمة الثدييات ، وفي النهاية ، نحو التطوير العلاجي.

Introduction

تفصل المنهجية الموصوفة هنا بروتوكولا لاستئصال ظهارة صبغة الشبكية (RPE) وراثيا باستخدام الزرد اليرقي. يمتد RPE فوق الجزء الخلفي من العين ويقيم بين الطبقات الطبقية للشبكية العصبية وطبقة الأوعية الدموية التي تشكل المشيمة. الدعم الغذائي ، وامتصاص الضوء السام للضوء ، والحفاظ على بروتينات الدورة البصرية ليست سوى بعض الوظائف الحرجة التي يؤديها RPE والتي تعتبر ضرورية للحفاظ على صحة وسلامة هذه الأنسجة المجاورة1. الأضرار التي لحقت RPE الثدييات قابلة للإصلاح عندما تكون الآفات صغيرة2 ؛ ومع ذلك ، فإن الأضرار التي تعاني منها الإصابات الأكبر أو الأمراض التنكسية التقدمية لا رجعة فيها. في البشر ، تؤدي الأمراض التنكسية RPE (على سبيل المثال ، التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) ومرض Stargardt) إلى فقدان البصر الدائم ، ومع قلة خيارات العلاج المتاحة ، انخفاض نوعية حياة المريض. وقد خلقت القدرة المحدودة ل RPE الثدييات على الإصلاح الذاتي فجوة معرفية في مجال العمليات التجديدية RPE. وبالنظر إلى القدرة التجديدية القوية لأسماك الزرد عبر العديد من أنواع الأنسجة المختلفة، تم تطوير هذا البروتوكول لإنشاء نظام فقاريات في الجسم الحي لتسهيل الدراسات حول تجديد RPE بشكل جوهري والكشف عن الآليات التي تدفع هذه الاستجابة. باستخدام نموذج الاستئصال الموضح هنا ، تم تحديد مسار إشارات Wnt الأساسي3 ، ومسار mTOR4 ، والاستجابات المتعلقة بالمناعة5 كوسطاء حاسمين لتجديد RPE ، على الأرجح مع وظائف متداخلة.

في نموذج الاستئصال الجيني هذا، يعبر Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 الزرد عن الجين6 المشتق من البكتيريا النيتروجيني المختزل (NTR/nfsB) المنصهر في eGFP تحت سيطرة عنصر محسن RPE، rpe65a7. يتم تحقيق الاجتثاث عن طريق إضافة البرودوية ، ميترونيدازول (MTZ) ، إلى نظام الزرد الذي يحتوي على الماء. يؤدي التنشيط داخل الخلايا ل MTZ بواسطة nitroreductase إلى ترابط الحمض النووي وموت الخلايا المبرمج في الخلايا المعبرة عن NTR / nfsB 8,9. وقد استخدمت هذه التكنولوجيا على نطاق واسع في أسماك الزرد للقضاء على خلايا شبكية العين 10،11،12،13 وغيرها من الأنسجة8. معا ، تتيح هذه العناصر التعبير المستهدف (rpe65a) لمنهجية استئصال الخلايا القابلة للحث (NTR / MTZ) 8,9 وعلامة الفلورسنت (eGFP) للتصور.

توجد أيضا نماذج أخرى مثيرة للاهتمام في الجسم الحي يمكن استخدامها لدراسة الإمكانات التجديدية ل RPE14. وهي واسعة النطاق وتشمل تحويل RPE إلى شبكية العين بعد استئصال شبكية العين في البرمائيات ، حيث يتم استبدال خلايا RPE المفقودة بسبب إعادة نمو الشبكية15,16 ؛ استعادة RPE بعد الإصابة في الماوس MRL / MpJ17 "الشفاء الفائق" ؛ والتحفيز الخارجي لانتشار RPE في نموذج الفئران من RPE التلقائي وتنكس الشبكية18 ، من بين أمور أخرى. كما تم تطوير نماذج في المختبر، مثل الخلايا الجذعية البشرية البالغة (RPESCs)19. وهذه النماذج كلها أدوات قيمة تعمل على الكشف عن العمليات الخلوية المتصلة بتجديد قواعد التشغيل والتقييم (مثل الانتشار، والتمايز، وما إلى ذلك)؛ ومع ذلك ، فإن الزرد فريد من نوعه في قدرته على إصلاح RPE الجوهري بعد الاستئصال.

في حين أن المنهجية هنا مكتوبة للتركيز على فهم الآليات التي تقود تجديد RPE ، يمكن استخدام خط Tg (rpe65a: nfsB-eGFP) وبروتوكول الاستئصال الجيني هذا لدراسة العمليات الخلوية الأخرى مثل موت الخلايا المبرمج RPE ، وتنكس RPE ، وتأثير إصابة RPE على أنسجة الشبكية والأوعية الدموية المجاورة. يمكن أيضا تعديل بروتوكول الاستئصال ليشمل التلاعب الدوائي ، وهو استراتيجية أولية مريحة لفحص مسارات الإشارات ذات الاهتمام. على سبيل المثال ، ثبت أن حظر مسار Wnt الأساسي باستخدام مثبط استجابة Wnt Response-1 (IWR-1)20 ، يضعف تجديد RPE3. تم تكرار ذلك هنا لتوجيه المستخدمين من خلال تجربة التلاعب الدوائي ويكون بمثابة إثبات للمفهوم للتحقق من صحة برنامج نصي MATLAB (RpEGEN) تم إنشاؤه لتحديد تجديد RPE بناء على استعادة التصبغ. مثل الخط المعدل وراثيا وبروتوكول الاستئصال ، فإن نصوص RpEGEN قابلة للتكيف ويمكن استخدامها لتحديد العلامات / العمليات الخلوية الأخرى داخل RPE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

جميع المنهجيات الموضحة هنا متوافقة مع اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) بجامعة بيتسبرغ.

1. التحضير قبل جمع جنين الزرد

  1. اضبط حاضنة الأجنة على 28.5 درجة مئوية.
  2. قم بإعداد محلول مخزون 25x لمثبط تكوين الميلانوجينيا ، N-phenylthiourea (PTU) 21,22. يتم قياس محلول المخزون هذا من وصفة شائعة22 و 1x يساوي 0.003٪ من الوزن لكل حجم (٪ w / v) (على سبيل المثال ، 0.003 غرام من مسحوق PTU إلى 100 مل من المذيب السائل).
    1. لصنع محلول مخزون PTU كبير 25x ، أضف 0.75 جم من مسحوق PTU إلى 1 لتر من الماء النقي منزوع الأيونات (يشار إليه فيما يلي باسم dH2O) واخلطه جيدا في درجة حرارة الغرفة (~ 25 درجة مئوية) باستخدام شريط تحريك ولوحة تحريك. يخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر محمية من الضوء.
      ملاحظة: من الصعب الحصول على PTU للذهاب إلى محلول مائي وقد يكون من الضروري التحريك الممتد بين عشية وضحاها.
      تحذير: PTU خطير ، ويجب توخي الحذر لمنع الابتلاع والاستنشاق و / أو ملامسة الجلد أو العينين. قد تحتاج إلى التخلص من مسحوق PTU وجميع المشتقات السائلة PTU الموصوفة هنا كنفايات كيميائية اعتمادا على لوائح الدولة والمؤسسة. يوصى بتأكيد طرق التخلص من النفايات PTU المناسبة ، إن وجدت ، قبل الاستخدام.
    2. لإنشاء حل عمل 1.5x PTU (يشار إليه فيما يلي باسم 1.5x PTU) ، أضف 60 مل من محلول مخزون PTU 25x إلى 940 مل من مياه مرفق إسكان أسماك الزرد (يشار إليها فيما يلي باسم مياه النظام). وقد وصفت البارامترات المثلى لنوعية المياه لأسماك الزرد23 وينبغي أن يكون لدى مرافق الأحياء المائية إجراءات موحدة لرصد المياه. قم بتخزين 1.5x PTU على درجة حرارة 28.5 درجة مئوية لمدة 1-2 أسابيع محمية من الضوء.
      ملاحظة: يتم تنفيذ هذا البروتوكول بشكل روتيني باستخدام تركيزات PTU والمذيبات ومعلمات التخزين الموضحة في الخطوة 1.2. كإجراء وقائي ، يجب ملاحظة الأجنة / اليرقات كل 1-2 أيام أثناء وجودها في PTU للتحقق من الفعالية وتأكيد التصبغ المستدام. يجب تحسين ظروف الذوبان و / أو التخزين إذا تم الاشتباه في انخفاض في قابلية / فعالية PTU.
  3. قم بإعداد محلول مخزون بنسبة 0.05٪ w/v methylene blue ، وهو مثبط للنمو الفطري ، عن طريق إضافة 0.05 جم من مسحوق الميثيلين الأزرق إلى 100 مل من dH2O. اخلطه جيدا باستخدام شريط التحريك ولوحة التحريك. يخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  4. قم بإعداد ماصات للتلاعب بالأجنة / اليرقات (على سبيل المثال ، نقل الأجنة / اليرقات بين أطباق بتري ، وفصل اليرقات أثناء فحص التألق ، وجمع اليرقات الرحيمة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة للتثبيت ، وما إلى ذلك) عن طريق تقليل النهاية المدببة لماصة باستور الزجاجية باستخدام قلم كتابة طرف الماس. حفر حول محيط الماصة باستخدام قلم الماس واسحب الطرف أو التقطه برفق لعمل استراحة نظيفة.
    ملاحظة: يجب أن يكون فم الماصة سلسا وواسعا بما يكفي لاستيعاب الجنين بسهولة داخل المشيمة دون قص. استخدم ماصة نقل سحب المصباح كبديل. يمكن أيضا استخدام الماصات المحضرة لإزالة السائل أثناء تغيرات الماء (بدلا من الصب) لتقليل فقدان الجنين / اليرقات.
  5. قم بإعداد محلول بارافورمالدهيد (PFA) بنسبة 4٪ في محلول ملحي مخزن مؤقتا بالفوسفات (PBS) (على سبيل المثال ، أضف 10 مل من 16٪ PFA إلى 4 مل من 10x PBS و 26 مل من dH2O). يخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أسابيع محمية من الضوء.
    تحذير: بارافورمالدهيد مادة كيميائية خطرة ويجب التعامل معها في غطاء الدخان الكيميائي والتخلص منها بشكل صحيح. يجب توخي الحذر ، ويجب ارتداء معدات الحماية الشخصية (PPE) ، لمنع الابتلاع والاستنشاق و / أو ملامسة الجلد أو العينين.

2. جمع جنين الزرد وصيانته قبل الاستئصال الجيني (0-5 أيام بعد الإخصاب)

  1. الحفاظ على سمك الزرد البالغ كما هو موضح سابقا3،4،5. بعد الظهر / المساء قبل جمع الأجنة ، افصل أسماك الزرد البالغة في خزانات تربية للتبويض.
  2. في صباح اليوم التالي (0 أيام بعد الإخصاب (dpf))، جمع الأجنة في أطباق بتري قطرها 10 سم في ماء النظام وإزالة جميع البيض غير القابل للحياة أو غير المخصب، والتي سوف تظهر معتمة و / أو تظهر السيتوبلازم غير المنتظمة وفشل الانقسام24.
    ملاحظة: سيكون الانقسام الطبيعي وأحداث التدريج التنموي واضحة في الأجنة السليمة كما هو موضح25. يجب أن تبقى أطباق بتري ممتلئة بثلاثة أرباع (~ 30 مل لطبق قطره 10 سم) طوال البروتوكول.
    1. أضف قطرتين من 0.05٪ مع الميثيلين الأزرق إلى كل طبق بتري ، واخلطهما بلطف ، واخزني الأجنة على درجة حرارة 28.5 درجة مئوية لبقية البروتوكول.
  3. حوالي 6 ساعات بعد الإخصاب (hpf) 4،5،26 ، استبدل ماء النظام في أطباق بتري الجنينية ب 1.5x PTU (حل العمل المصنوع في الخطوة 1.2.2) وتجديد الميثيلين الأزرق.
    ملاحظة: يجب إضافة PTU إلى الأجنة قبل ظهور التصبغ (أي قبل 24 hpf)25 لأن الأنسجة المصطبغة بالفعل لن تتحلل عند إضافة PTU21. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أنه تم الإبلاغ عن انخفاض حجم العين ، والعجز في العين والقحف الوجهي ، وتعطيل بعض مسارات الإشارات (على سبيل المثال ، إشارات الغدة الدرقية) في أسماك الزرد المعالجة ب PTU27،28،29. يبدو أن السمية التنموية ل PTU تعتمد على تركيز وتوقيت إضافة PTU27,29. كما ذكر أعلاه للتحقق من فعالية PTU (الخطوة 1.2) ، يجب أيضا مراقبة علامات سمية PTU بعناية ، وإذا كان يشتبه في ذلك ، يجب تحسين تركيز العمل و / أو وقت إضافة PTU.
  4. على 2-3 dpf ، الأجنة dechorionate باستخدام محلول pronase الطازجة.
    1. يذوب البروناز في 1.5x PTU بتركيز 2 ملغ / مل عن طريق الدوامة.
      تنبيه: يتم تعبئة Pronase كمسحوق ناعم جدا وهو مهيج. اتخاذ تدابير لتجنب الاستنشاق و / أو ملامسة الجلد والعينين وما إلى ذلك.
    2. فصل الأجنة المفرخة عن الأجنة غير المفرخة وعلاج الأجنة غير المفرخة فقط.
    3. استبدل 1.5x PTU بمحلول بروناس 2 ملغم / مل مصنوع في الخطوة 2.4.1 واتركه على الأجنة غير المفرخة لمدة 4-5 دقائق مع إثارة لطيفة (على سبيل المثال ، على دوار / شاكر على الطاولة أو عن طريق الدوران اليدوي).
    4. يسكب محلول البروناس ويشطف على الفور ب 1.5x PTU طازج. شطف 1.5x PTU بلطف على الأجنة باستخدام ماصة نقل سحب المصباح.
    5. كرر شطف PTU الثاني بمعدل 1.5x للتخلص من جميع حطام المشيمة ، ثم قم بتجديد 1.5x PTU للصيانة.
      ملاحظة: يمكن أيضا إزالة الأحشاء يدويا باستخدام ملقط ذو رؤوس دقيقة. في هذه الحالة ، يجب إزالة حطام المشيمية وتجديد 1.5x PTU بعد إزالة الشوك اليدوي.
  5. مراقبة صحة الجنين / اليرقات وتجديد 1.5x PTU كل 1-2 أيام. يتم الاحتفاظ بالأجنة / اليرقات في 1.5x PTU حتى الاستئصال عند 5 dpf.
    ملاحظة: يتم تناول أهمية الخطوتين 2.3 و2.4 بمزيد من التفصيل في قسم المناقشة.

3. فحص يرقات الزرد ل rpe65a: nfsB-eGFP والاستئصال الجيني لظهارة صبغة الشبكية (5-6 أيام بعد الإخصاب)

  1. اصنع محلول ميترونيدازول (MTZ) طازج 10 مللي متر مربع على 5 dpf (يوم الاستئصال). تستغرق هذه العملية 2 ساعة لإكمالها.
    1. أضف مسحوق MTZ إلى ماء النظام بدون PTU واخلطه جيدا عن طريق الاهتزاز القوي (على سبيل المثال ، 250 دورة في الدقيقة) لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    2. قم بتبريد محلول MTZ سعة 10 mM لمدة 1 ساعة إضافية في درجة حرارة الغرفة على دوار / شاكر على الطاولة وتأكد من الذوبان الكامل قبل الإضافة إلى أطباق Petri مع اليرقات.
      ملاحظة: يمكن إجراء فحص التألق وفصل يرقات eGFP + (الخطوة 3.2) أثناء حضانة 37 درجة مئوية ودرجة حرارة الغرفة.
      تحذير: MTZ خطرة ، ويجب توخي الحذر لمنع الابتلاع والاستنشاق و / أو ملامسة الجلد أو العينين. قد تحتاج إلى التخلص من مسحوق MTZ وجميع المشتقات السائلة الموضحة هنا كنفايات كيميائية اعتمادا على لوائح الدولة والمؤسسات. يوصى بتأكيد الطرق المناسبة للتخلص من نفايات MTZ ، إن وجدت ، قبل الاستخدام.
  2. شاشة يرقات الزرد ل rpe65a:nfsB-eGFP transgene.
    1. تخدير اليرقات مع 0.168 جم / لتر من التريكاين (MS-222) واليرقات المعدلة وراثيا (eGFP+) المنفصلة (الشكل 1) عن اليرقات غير المعدلة وراثيا (eGFP-) باستخدام مجهر ستيريو فلوري مع ليزر / مرشح إثارة 488 نانومتر.
      ملاحظة: يجب إضافة Tricaine إلى 1.5x PTU و / أو المحاليل المركبة الدوائية حيث يجب أن تظل اليرقات مغمورة في العلاج أثناء فحصها بحثا عن eGFP. احتضان اليرقات في التريكاين فقط طوال مدة الفحص (على سبيل المثال ، ≤10 دقائق لطبق بتري واحد 10 سم يحتوي على 50 يرقة).
    2. استيقظ على الفور من اليرقات التي تم فحصها عن طريق السحب مباشرة إلى طبق بتري مع 1.5x PTU طازج بدون تريكاين.
    3. عند الانتهاء من الفحص ، قم بفصل يرقات eGFP + إلى مجموعتين من أطباق Petri: مجموعة واحدة لتلقي علاج MTZ (ablated / MTZ +) ومجموعة واحدة لتكون التحكم غير المقيد (MTZ-).
  3. إزالة ظهارة صبغة الشبكية.
    1. قم بإزالة 1.5x PTU من أطباق التحكم غير المنفذة (MTZ-) وأضف مياه النظام العذبة بدون PTU.
    2. قم بإزالة 1.5x PTU من أطباق المعالجة المبطنة (MTZ +) وأضف محلول MTZ الطازج 10 mM (الخطوة 3.1).
    3. قم بإزالة محلول MTZ 10 mM بعد 24 ساعة بالضبط (معين بعد يوم واحد بعد الإصابة (dpi)) وأضف مياه النظام العذبة بدون PTU. تغيير مياه النظام العذبة بدون PTU على طبق ( أطباق) MTZ. لن تتعرض اليرقات ل PTU مرة أخرى لما تبقى من البروتوكول.
      ملاحظة: قد يكون من الصعب ماصة أو صب كل 1.5x PTU (الخطوتان 3.3.1 و 3.3.2) أو 10 mM MTZ (الخطوة 3.3.3) بين تبادل المحلول دون فقدان اليرقات لأن الحيوانات تسبح بنشاط. في هذه الحالة ، يمكن إضافة غسل (غسلات) مياه النظام بدون PTU لضمان تبادل الحلول بنجاح.

4. صيانة اليرقات بعد الاستئصال الوراثي (6+ أيام بعد الإخصاب)

  1. تحقق من اليرقات وقم بتجديد مياه النظام بدون PTU يوميا حتى القتل الرحيم (الخطوة 5.6) أو العودة إلى مرفق إسكان أسماك الزرد.
  2. راقب نجاح ومدى الاستئصال في الجسم الحي على 2 نقطة في البوصة (7 dpf) باستخدام إضاءة الضوء المنقولة على مجهر ستيريو (الشكل 2).

5. دمج العلاج الدوائي في بروتوكول استئصال ظهارة الظهارة الصباغية لأسماك الزرد

ملاحظة: كما تم إجراؤه سابقا3 ، يتم توضيح المعالجة باستخدام 15 ميكرومتر IWR-1 أو التحكم في مركبة ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) المطابق للحجم بدءا من 4 dpf هنا كمثال على تجربة لاختبار RpEGEN. قد تختلف التركيزات والجداول الزمنية باختلاف المركبات الدوائية ويتم تناول التوصيات للتحقق من صحة الاستجابة للجرعة ، ومدة العلاج ، والفحص ، والجوانب الأخرى للتصميم التجريبي لدراسات التلاعب الدوائي في قسم المناقشة. اتبع الخطوتين 6 و7 إذا كان تحليل الصورة مطلوبا.

  1. جمع الأجنة وصيانتها كما هو موضح في الخطوة 2. الأجنة dechorionate على 2 dpf.
  2. قم بفحص يرقات eGFP + على 4 dpf كما هو موضح في الخطوة 3.2. بدلا من أطباق بتري ، ضع يرقات eGFP + في ألواح من 6 آبار بكثافة n ≤ 10 يرقات لكل 6 آبار للعلاج الدوائي. قم بتعيين لوحات منفصلة من 6 آبار لليرقات التي سيتم تحريرها (MTZ-) واليرقات التي سيتم استئصالها (MTZ +).
    ملاحظة: تكون إشارة eGFP مرئية على 4 dpf ولكنها تبدو باهتة من شدة الإشارة على 5 dpf.
  3. قبل معالجة يرقات eGFP+ 4 dpf eGFP+ مع 15 ميكرومتر IWR-1 أو التحكم في مركبة DMSO المتطابقة مع الحجم لمدة 24 ساعة بالضبط قبل الاستئصال الجيني باستخدام محلول MTZ 10 mM.
    ملاحظة: في كثير من الأحيان ، هناك حاجة إلى القليل جدا من المركب لتجارب العلاج الدوائي. لتجنب وزن كميات صغيرة من مسحوق IWR-1 ، يتم شراء هذا المركب الدوائي بالفعل في محلول DMSO ، بتركيز 25 mM ، ويتم اقتباسه إلى أحجام أصغر عند الوصول لتجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة.
    1. تحديد حجم العلاجات الدوائية والتحكم في المركبات اللازمة و aliquot 1.5x PTU في أنابيب مخروطية وفقا لذلك. يوصى باستخدام حجم 5 مل / بئر من لوحة 6 آبار.
    2. أضف مخزون IWR-1 إلى 1.5x PTU للحصول على تركيز نهائي قدره 15 ميكرومتر IWR-1 (على سبيل المثال ، 3 ميكرولتر من 25 mM IWR-1 لكل 5 مل من 1.5x PTU). أضف حجما مطابقا من مخزون DMSO إلى 1.5x PTU (على سبيل المثال ، 3 ميكرولتر ≥ 99.7٪ DMSO لكل 5 مل من 1.5x PTU). هنا ، سيؤدي ذلك في النهاية إلى تركيز نهائي بنسبة 0.06٪ حجم / حجم (٪ v / v) DMSO. تخلط جيدا عن طريق الدوامة وتؤكد بصريا ذوبان المركبات.
      تحذير: قد يلزم التخلص من DMSO و IWR-1 والمركبات والمذيبات الدوائية الأخرى كنفايات كيميائية اعتمادا على لوائح الدولة والمؤسسة. يوصى بتأكيد مستوى الخطر والطرق المناسبة للتخلص من النفايات لهذه المركبات ، إن وجدت ، قبل الاستخدام.
    3. قم بإزالة 1.5x PTU من يرقات eGFP + في ألواح 6 آبار وأضف 5 مل / بئر من معالجات DMSO v/v الطازجة المصنوعة حديثا بنسبة 0.06٪ أو 15 ميكرومتر IWR-1 من الخطوة 5.3.2.
  4. على 5 dpf ، قم بإلغاء RPE. بالإضافة إلى المعالجة المسبقة لمدة 24 ساعة (الخطوة 5.3) ، ستظل اليرقات مغمورة في العلاجات الدوائية وعلاجات التحكم في المركبات خلال 24 ساعة من الاستئصال الجيني باستخدام 10 mM MTZ وأثناء التعافي بعد الاستئصال ، حتى التثبيت (على سبيل المثال ، من 4-9 dpf).
    1. اصنع محلول MTZ 10 mM قبل 2 ساعة من إجراء الاستئصال الجيني (الخطوة 3.1).
    2. تحديد حجم المعالجات الدوائية ومعالجات التحكم في المركبات اللازمة لكل من الصفائح غير المبطنة (MTZ-) و (MTZ-) ذات 6 آبار و aliquot الكميات المناسبة من مياه النظام العذبة بدون PTU (MTZ-) أو محلول MTZ 10 mM (MTZ +) في أنابيب مخروطية الشكل. سيؤدي ذلك إلى أربعة شروط علاجية: 1) 0.06٪ v / v DMSO ، MTZ-؛ 2) 15 ميكرومتر IWR-1 ، MTZ - ؛ 3) 0.06٪ ضد / v DMSO، MTZ +؛ و 4) 15 ميكرومتر IWR-1 ، MTZ +.
    3. أضف حلول مخزون IWR-1 و DMSO إلى الأنابيب المخروطية ذات الصلة كما تم تنفيذها في الخطوة 5.3.2. تخلط جيدا عن طريق الدوامة وتؤكد بصريا ذوبان المركبات.
    4. قم بإزالة 0.06٪ v/v DMSO و 15 ميكرومتر IWR-1 من العلاجات في 1.5x PTU (الخطوة 5.3.2) من لوحات 6 آبار (MTZ-) و (MTZ+) المعينة غير الملغومة (MTZ+) وتجديدها باستخدام العلاجات المناسبة التي تم إجراؤها في الخطوة 5.4.3.
    5. قم بإزالة 0.06٪ v / v DMSO و 15 μM IWR-1 في محلول MTZ 10 mM بعد 24 ساعة بالضبط وتجديده بالمعالجات في مياه النظام العذبة بدون PTU. قم بتجديد 0.06٪ v / v DMSO و 15 μM IWR-1 في مياه النظام العذبة بدون PTU على لوحة (لوحات) 6 آبار غير معطلة (MTZ-).
  5. اتبع صيانة اليرقات بعد الاستئصال كما هو موضح في الخطوة 4 وقم بتجديد 0.06٪ v / v DMSO أو 15 μM IWR-1 يوميا في مياه النظام بدون PTU.
  6. القتل الرحيم لليرقات على 9 dpf (4 DPI للأشقاء المعالجين ب MTZ المتطابقين مع العمر) عن طريق غمر الحيوانات في محلول تريكاين 0.3 جم / لتر (جرعة زائدة قاتلة) إلى جانب التبريد السريع (على سبيل المثال ، ضع أطباق بتري على الجليد) لمدة 20 دقيقة على الأقل30. تحقق للتأكد من أن اليرقات لا تستجيب للمس والإصلاح في 4٪ PFA (الخطوة 1.5) لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة أو عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
  7. معالجة الأنسجة اليرقية بعد التثبيت للحصول على صورة z-stack على المجهر البؤري كما هو موضح سابقا 5,31 وهنا في قسم النتائج التمثيلية. وسيتطلب التحليل الوارد في الخطوتين 6 و7، كحد أدنى، الحصول على علامة نووية (مثل DAPI) وصور سطوع فيلد z-stack.

6. المجهر البؤري z-stack الصورة المعالجة المسبقة في فيجي (ImageJ)

  1. استيراد وتنسيق صور المجهر البؤري z-stack باستخدام FIJI32.
    1. افتح صور المجهر باستخدام خيارات استيراد التنسيقات الحيوية التي تم تعيينها لعرض المكدس باستخدام: Hyperstack ووضع اللون: تدرج رمادي.
    2. قم بإنشاء إسقاط أقصى كثافة لصورة المجهر المستوردة عن طريق اختيار صورة | مكدسات | مشروع Z. في نافذة ZProjection، قم بتعيين Start Slice و Stop Slice لتضمين كل الشرائح لتلك الصورة. على سبيل المثال، قم بتعيين شريحة البدء: 1 وشريحة التوقف: 18 لمكدس z يحتوي على إجمالي 18 شريحة. اختر نوع العرض: أقصى كثافة وانقر على موافق.
    3. قم بتحويل ملف الإسقاط الأقصى للكثافة إلى صورة 8 بت (إن لم يكن بالفعل) عن طريق اختيار صورة | النوع | 8 بت.
    4. أعد توجيه الصورة بحيث يكون الجانب الظهري لأعلى ويترك بعيدا (أي العدسة) عن طريق اختيار الصورة | تحويل | اقلب أفقيا (بالنسبة للأمر الأخير، حدد الخيار الذي يناسب الاتجاه المطلوب لتلك الصورة). للحصول على صورة متعددة القنوات ، انقر فوق نعم في مكدس العملية؟ نافذة لإعادة توجيه جميع القنوات.
      ملاحظة: هذه الخطوة بالغة الأهمية، ولكنها ليست ضرورية إذا كانت الصورة موجودة بالفعل في الاتجاه الظهري لأعلى والاتجاه الأيسر البعيد. انظر الشكل 3A-D والشكل 4 للحصول على صور ذات عيون في الاتجاه الصحيح للمعالجة.
    5. احفظ الإسقاط الأقصى للكثافة 8 بت كملف بتنسيق ملف صورة (TIF) باختيار ملف | وفر باسم| تيب....
  2. إنشاء منطقة اهتمام RPE (ROI) باستخدام FIJI.
    1. افتح صورة TIF 8 بت تم إنشاؤها كما هو موضح في الخطوة 6.1. ابدأ تشغيل مدير عائد الاستثمار باختيار تحليل | أدوات | مدير العائد على الاستثمار.
    2. استخدام | الصور قم بالتكبير والتبديل بين قنوات DAPI و brightfield لتحديد النقطة (النقاط) التي يكون فيها الجانب القمي من RPE مجاورا لطرف الغشاء المحدد الخارجي (OLM) (الشكل 3B '، B "، D ، D "؛ رؤوس الأسهم الزرقاء). استخدم هذا المعلم التشريحي كنقطة انطلاق لعائد الاستثمار.
    3. قم بإنشاء عائد استثمار RPE باستخدام أداة تحديدات المضلع (في شريط أدوات FIJI) باستخدام كل من قنوات الصور DAPI و brightfield ووظيفة التكبير/التصغير (الصورة | Zoom) لتحديد حدود RPE القمية والقاعدية. اجلب الأطراف الظهرية والبطنية لعائد الاستثمار (أي حيث ينتقل عائد الاستثمار من الجانب القمي إلى الجانب القاعدي من RPE) إلى نقطة حادة بدلا من التثبيط أو التقريب (الشكل 3B '، B "، D ، D "؛ خطوط أرجوانية).
      ملاحظة: يعد إنشاء نهاية عائد استثمار مدببة خطوة حاسمة لتحسين اكتشاف نقطة النهاية باستخدام RpEGEN ويتم تناولها في قسم المناقشة.
    4. أضف عائد الاستثمار بالنقر فوق إضافة في مدير عائد الاستثمار. اضبط عائد الاستثمار حسب الحاجة وانقر على تحديث في مدير عائد الاستثمار.
    5. احفظ ملف عائد الاستثمار باختيار المزيد>> | أنقذ... داخل مدير عائد الاستثمار. استخدم أسماء متطابقة لملفات صور عائد الاستثمار وTIF المتطابقة (على سبيل المثال، [اسم الملف].tif و[اسم الملف].roi).
  3. دمج ملفات TIF وعائد الاستثمار 8 بت لكل شرط في مجلد واحد. على سبيل المثال، سيحتوي المجلد، DMSO_9dpf، على جميع ملفات TIF وعائد الاستثمار المتطابقة لمجموعة اليرقات المعالجة ب 9 dpf unablated (MTZ-) 0.06٪ v/v DMSO.

7. القياس الكمي والتصور لتجديد RPE باستخدام نصوص RpEGEN

  1. تثبيت وإعداد البرامج النصية RpEGEN.
    1. قم بتنزيل أحدث البرامج النصية RpEGEN من مستودع GitHub (https://github.com/burchfisher/RpEGEN) بالنقر فوق Code | تنزيل ملف ZIP.
    2. قم بفك ضغط المجلد ووضعه في موقع مساحة العمل المطلوب (على سبيل المثال، سطح المكتب).
    3. افتح MATLAB.
    4. انتقل إلى مجلد RpEGEN في جزء المجلد الحالي (عادة على الجانب الأيمن).
    5. انقر بزر الماوس الأيمن فوق مجلد RpEGEN واختر إضافة إلى المسار | المجلدات والمجلدات الفرعية المحددة. يؤدي ذلك إلى إضافة المجلد إلى مسار MATLAB حتى يتمكن تلقائيا من العثور على أي برامج نصية في المجلد وتشغيلها.
    6. انقر نقرا مزدوجا فوق المجلد RpEGEN في جزء المجلد الحالي لإظهار كافة المجلدات الفرعية وملفات M.
    7. انقر نقرا مزدوجا فوق الملف RpEGEN.m لفتحه في جزء المحرر .
    8. ضمن قسم المتغيرات المعرفة من قبل المستخدم من ملف RpEGEN.M، أدخل مواقع الدليل للمجلدات التي تحتوي على ملفات عائد الاستثمار (.ROI) وملفات الصور (.tif) وحيث يجب حفظ ملفات الإخراج. أدخل اسم المجموعة لملف .mat المراد تصديره (على سبيل المثال، DMSO_9dpf DMSO_4dpi وما إلى ذلك) وموقع قناة الحقل الساطع في مكدس صور TIF (على سبيل المثال، 3، إذا كان الحقل الساطع هو القناة الثالثة في مكدس الصور). إذا كان ملف الصورة يحتوي فقط على صورة الحقل الساطع ، فيجب أن يكون هذا مساويا ل 1.
  2. قم بتشغيل البرنامج النصي RpEGEN.m والتحقق من صحة النتائج.
    ملاحظة: يتطلب RpEGEN تنشيط مربع أدوات معالجة الصور وصندوق أدوات تركيب المنحنى وصندوق أدوات الإحصائيات والتعلم الآلي على ترخيص MATLAB للمستخدم من أجل التشغيل. وبالإضافة إلى ذلك، فإن مجموعة أدوات ReadImageJROI33 المتاحة مجانا مطلوبة لاستيراد عائد الاستثمار في فيجي إلى MATLAB؛ ومع ذلك ، يتم توفيره في مجلد RpEGEN جنبا إلى جنب مع ملفات M الوظيفية الأخرى التي لا تتطلب أي تنشيط.
    1. قم بتشغيل البرنامج النصي بالنقر فوق الزر " تشغيل " في قائمة "محرر " في الجزء العلوي من MATLAB.
      ملاحظة: بمجرد بدء التشغيل، ستوفر نافذة الأوامر مخرجات مطولة تشير إلى تقدم البرنامج النصي. بعد حفظ ملف MAT الذي يحتوي على البيانات المستخرجة ، سيظهر شكل من ثلاث لوحات ويتم حفظه كملف PDF في دليل المخرجات لكل صورة يتم تشغيلها. هذه هي أرقام مراقبة الجودة (QC) للتأكد من أن كل شيء قد تم تشغيله بشكل صحيح وتشمل: 1) صورة الحقل الساطع التي تراكبها عائد الاستثمار (الشكل 4A) ؛ 2) عائد الاستثمار مع خط الوسط والمسافة الزاوية المرتبطة بها (درجات) (الشكل 4G) ؛ و 3) عائد الاستثمار مع قيم كثافة متوسط خط الوسط (0-255 ، مقياس ألوان 8 بت) (الشكل 4H). انتظر حتى يتم حفظ ملفات PDF لمراقبة الجودة في مجلد الإخراج ويختفي الشكل الأخير قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.
    2. افتح ملفات PDF الفردية المصدرة إلى مجلد المخرجات في أي عارض PDF وتحقق من أن جميع عائد الاستثمار يتطابق مع صور الحقول الساطعة، وأن قيم خط الوسط هي تقريب معقول لمركز عائد الاستثمار، وأن قيم متوسط الكثافة يتم تعبئتها بشكل مناسب بالبيانات (أي ليست كل نفس القيمة عبر خط الوسط بأكمله).
      ملاحظة: يمكن العثور على وصف مفصل وهيكل لكل متغير محفوظ في ملف MAT بواسطة RpEGEN.m في الجدول 1.
  3. قم بتشغيل البرنامج النصي RpEGEN_PermPlot.m.
    ملاحظة: يستخدم البرنامج النصي RpEGEN_PermPlot.m مخرجات RpEGEN.m لإجراء مقارنات إحصائية باستخدام محاكاة تبديل لمتوسطات مجموعتين ويوفر أيضا التعليمات البرمجية لإعادة إنتاج المؤامرات في هذه الورقة باستخدام صندوق أدوات GRAMM34 المتاح مجانا ، والذي تم تضمينه أيضا في مجلد RpEGEN.
    1. انقر نقرا مزدوجا فوق ملف RpEGEN_PermPlot.m لفتحه في علامة تبويب محرر جديدة.
    2. ضمن القسم 1 - المتغيرات المعرفة من قبل المستخدم في ملف RpEGEN_PermPlot.M، أدخل موقع الدليل لمجلد الإخراج الذي يحتوي على ملفات MAT من تشغيل RpEGEN.M وأدخل كل اسم ملف MAT المراد تحميله (على سبيل المثال، DMSO_4dpi.mat IWR1_4dpi.mat).
    3. قم بتشغيل هذا القسم من البرنامج النصي بالنقر فوق الزر " تشغيل القسم " في قائمة " المحرر" أعلى MATLAB.
    4. في القسم 2، أدخل اسمي المجموعتين للمقارنة الإحصائية في data_A والمتغيرات data_B (هذه هي المجموعات التي سيتم اشتقاق الوسيطات منها باستخدام محاكاة التباديل). في متغير bin_sz ، أدخل عدد الدرجات التي سيتم من خلالها دمج قيم الكثافة المتوسطة لمجموعات البيانات (الافتراضي هو صناديق 1 درجة).
      ملاحظة: يشير متغير reps إلى عدد التباديل التي يجب استخدامها لإنشاء توزيع احتمالي ويمكن تعيينها إلى أي رقم (القيمة الافتراضية هي 20000). بشكل عام ، سيكون عدد أكبر من التكرار أكثر قوة من الناحية الإحصائية ولكنه سيزيد من وقت المعالجة.
    5. قم بتشغيل هذا القسم من البرنامج النصي بالنقر فوق الزر " تشغيل القسم " في قائمة " المحرر" أعلى MATLAB. قد يستغرق هذا القسم بعض الوقت لإكماله استنادا إلى عدد مرات التكرار المحددة ولكنه يوفر تحديثا مستمرا للحالة في نافذة الأوامر.
    6. قم بتشغيل أقسام HEATMAP FIGURE و GROUP RESULTS AND P-VALUES بشكل مستقل باستخدام الزر تشغيل القسم . قم بتحرير متغيرات البيانات في أي أقسام تم التعليق عليها باستخدام "أدخل البيانات هنا". يتم حفظ ملفات PDF الخاصة بهذه الأرقام تلقائيا لكل منها ويمكن تعديلها بسهولة في أي معالجة لاحقة لبرنامج متجه.
      ملاحظة: تكون المؤامرات التي تم إنشاؤها في ملف RpEGEN_PermPlot.m مخصصة ومن المحتمل أن تتطلب تعديلات استنادا إلى احتياجات البيانات والتصور المحددة لكل مستخدم. ومع ذلك ، توفر الأرقام أساسا متينا يمكن تخصيصه بسهولة باستخدام كل من موقعي MATLAB و GRAMM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

من المعروف أن تثبيط مسار إشارات Wnt الأساسي يضعف بشكل كبير تجديد RPE لأسماك الزرد باستخدام نموذج الاستئصال الجيني (rpe65a: nfsB-eGFP) ومنهجية التلاعب الدوائي (IWR-1) الموصوفة في البروتوكول3. تم تكرار هذه التجربة هنا للتحقق من صحة طريقة آلية لقياس كمية تجديد RPE لأسماك الزرد بناء على التصبغ. وشملت النتائج الموجزة أدناه جميع خطوات البروتوكول، من يوم الإخصاب (0 dpf) إلى القياس الكمي لتجديد RPE باستخدام RpEGEN.

تنفيذ بروتوكول الاستئصال RPE (مع التلاعب الدوائي) في أسماك الزرد اليرقية
بدأت الأجنة التي تم جمعها من ثلاث مجموعات أصلية منفصلة (N = 3) العلاج باستخدام 1.5x PTU حوالي 6 hpf وتم تأكيد عدم وجود تصبغ في RPE والخلايا الصباغية السطحية بصريا على 1 dpf. تم تفكيك الأجنة إنزيميا على 2 dpf باستخدام 2 mg / mL من pronase (الخطوة 2.4). على 4 dpf ، تم تخدير اليرقات باستخدام tricaine (MS-222) وفحصها بحثا عن eGFP باستخدام مجهر ستيريو فلوري (الخطوتان 3.2 و 5.2). تم نقل يرقات eGFP + إلى لوحات 6 آبار (n = 10 يرقات / بئر) وعولجت إما بنسبة 0.06٪ v / v DMSO (التحكم في المركبة) أو 15 μM IWR-1 (الخطوة 5.3). استندت كثافة اليرقات المبلغ عنها هنا في البداية إلى تقريب منطقة نمو 1 يرقة / سم2 وتم التحقق من صحتها من خلال المراقبة الصحية الدقيقة (على سبيل المثال ، تطور المثانة السباحة) بمرور الوقت. وبدت شدة eGFP باهتة على 4 dpf ، لذلك أعيد فحص اليرقات على 5 dpf لتأكيد تعبير eGFP الساطع (الشكل 1). RPE65 (rpe65a في أسماك الزرد) هو علامة على RPE7 الناضجة ، وفي أسماك teleost ، يتم توليد خلايا الشبكية و RPE باستمرار من المنطقة الهامشية الهدبية (CMZ) ، وهي محراب للخلايا الجذعية في الطرف البعيد من شبكية العين ، بجوار العدسة35. وهكذا ، في الخط المعدل وراثيا rpe65a:nfsB-eGFP ، توجد RPE غير الناضجة في المحيط وتظهر eGFP- (حوالي ثلث إجمالي أنسجة RPE) بينما يعبر الثلثان المركزيان الناضجان من RPE عن eGFP (الشكل 1B ؛ رؤوس الأسهم البيضاء). كان الجين المحور مرئيا أيضا في الغدة الصنوبرية (الشكل 1A ؛ رأس السهم الأصفر) ، والذي كان متوقعا لأن rpe65a يظهر تعبيرا صنوبريا في الزرد36. تم سحب يرقات قاتمة نسبيا أو eGFP من لوحات 6 آبار والقتل الرحيم على 5 dpf. في 24 ساعة بالضبط بعد المعالجة باستخدام DMSO أو IWR-1 ، تمت معالجة 5 يرقات dpf ب 10 mM MTZ لاستئصال RPE (الخطوات 3.1 و 3.3 و 5.4). تم غسل MTZ بعد 24 ساعة بالضبط (أي على 6 dpf / 1 نقطة في البوصة) للسماح بتجديد RPE.

ولوحظت اليرقات يوميا على مجهر ستيريو باستخدام إضاءة ضوئية منقولة من 6 dpf/1 dpi إلى وقت القتل الرحيم على 9 dpf/4 dppi. تم تأكيد نجاح الاستئصال الجيني في الجسم الحي على 2 نقطة في البوصة من خلال عدم وجود صبغة في الثلثين المركزيين للعين في يرقات MTZ + (الشكل 2B ؛ رؤوس الأسهم الحمراء) مقارنة ب 7 dpf MTZ - الأشقاء الضابطين (الشكل 2A) (الخطوة 4.2). وكما كان متوقعا، بدت المنطقة الخالية من الصباغ على 2 نقطة في البوصة مماثلة لمنطقة التعبير الجيني العابر rpe65a:nfsB-eGFP الذي لوحظ على 5 dpf (الشكل 1B). تم إجراء التقييم على 2 نقطة في البوصة وليس قبل ذلك حيث تخضع RPE لإعادة التصبغ بعد إزالة PTU واعتمادا على وقت المراقبة في الجسم الحي ، قد يكون من الصعب تمييز الفرق الملحوظ بين RPE المركزي المنزوع و RPE المحيطي المنقذ (غير الملغى) إذا لم يتم إعادة تصبغ الأخير بالكامل. على الرغم من إمكانية حدوث غموض عياني ، فقد تبين سابقا أن استئصال RPE عند 1 نقطة في البوصة واضح بسهولة في الأنسجة المجزأة ، مما يكشف عن فقدان RPE المركزي والطبقة النووية الخارجية (ONL ؛ أي المستقبلات الضوئية) سلامة الأنسجة جنبا إلى جنب مع أدلة على موت الخلايا (النوى pyknotic ) (الشكل 5)3. وعلى عكس فقدان الأنسجة، تم تحديد الانتشار القوي ليكون محركا رئيسيا أثناء تجديد الأنسجة في نموذج الزرد rpe65a:nfsB-eGFP3. كل من الاستجابة الاستماتية المبكرة ، حيث يؤدي استئصال RPE إلى انحطاط الأنسجة المجاورة (على سبيل المثال ، المستقبلات الضوئية وغشاء Bruch ؛ الشكل 6A-C)، والاستجابة التكاثرية من المحيطية إلى المركزية التي تلي ذلك، والتي تسفر عن "مناطق" تجديد غير متجانسة تتحرك إلى الداخل في موقع الإصابة (الشكل 6D-F)، قد تم توصيفها ومناقشتها على نطاق واسع سابقا 3.

إعداد الأنسجة ، والحصول على الصورة متحدة البؤرة ، والمعالجة المسبقة للصورة للقياس الكمي الآلي على أساس تصبغ RPE باستخدام RpEGEN
على 9 dpf / 4 dpi ، تم قتل اليرقات المعالجة DMSO و IWR-1 بجرعة زائدة من التريكاين وتثبيتها في PFA بنسبة 4٪ لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة (الخطوة 5.6). تم اختيار أربع يرقات من كل مجموعة أم مستقلة عشوائيا لمعالجة الأنسجة اللاحقة (N = 3 ؛ n = 12 يرقات لكل علاج). تم إجراء الحماية من التبريد ، والتقسيم بالتبريد (بسماكة 12 ميكرومتر) ، ومكافحة التلطيخ النووي باستخدام DAPI ، وتركيب الغطاء على النحو المشار إليه في الخطوة 5.7 5,31. تم تصوير قسم مركزي ، مع عصب بصري مرئي ، من كل يرقة على مجهر مسح ليزر متحد البؤرة باستخدام هدف غمر الزيت 40x (الفتحة العددية = 1.30) للحصول على صور z-stack 512 × 512 بكسل مع فاصل زمني 1 ميكرومتر z-step. احتوت كل صورة على بيانات من ثلاث قنوات: القناة 1 = 405 نانومتر الإثارة ل DAPI ، القناة 2 = 488 نانومتر الإثارة ل eGFP ، القناة 3 = الضوء المرسل ل brightfield. نظرا لأن كثافة البكسل تم تحديدها كميا في صور برايتفيلد ، فقد تم الحفاظ على إعدادات جهد مصباح الضوء المنقول ثابتة وتم تصوير جميع البيانات التي تم جمعها لإجراء مقارنات إحصائية في نفس اليوم.

تمت معالجة صور المجهر البؤري z-stack مسبقا للقياس الكمي الآلي كما هو موضح في الخطوة 6 ، باستخدام FIJI. تم استبعاد الصور من المعالجة المسبقة والقياس الكمي إذا تم اختراق الأنسجة بطريقة تجعل توليد عائد الاستثمار صعبا (على سبيل المثال ، من التمزق (الشكل 7 ألف; رؤوس الأسهم الأرجوانية) أو انسداد المعالم (الشكل 7 باء; أرجواني بيضاوي)) أو قياسات كثافة عائد الاستثمار المنحرفة (على سبيل المثال ، من الطي (الشكل 7 جيم; أرجواني بيضاوي)). على الرغم من حذف عدد قليل من اليرقات مع معايير الاستبعاد هذه ، فإن جميع مجموعات البيانات الواردة هنا تمثل N = 3 مع العدد التالي من النسخ المتماثلة البيولوجية (اليرقات): n = 11 ، DMSO MTZ-; n = 10، IWR-1 MTZ-; n = 11 ، DMSO MTZ+; n = 12، IWR-1 MTZ+. باستخدام قناة DAPI ، بدأت ROIs RPE أولا من خلال تحديد النقطة التي كان فيها الجانب القمي الظهري من RPE (المواجه للشبكية) مجاورا مباشرة للطرف الظهري ل OLM (الشكل 3 باء',D'; رؤوس الأسهم الزرقاء) (الخطوة 6.2.2). نظرا لأن امتداد RPE البعيد يمكن أن يختلف بين الأقسام ، فقد تم استخدام OLM كمعلم تشريحي لتوحيد نقاط نهاية ROI RPE وتطبيع قياسات المسافة الزاوية في MATLAB (حيث 0 ° = نقطة نهاية عائد الاستثمار الظهري و 180 ° = نقطة نهاية عائد الاستثمار البطني). عند إجراء عمليات استئصال RPE مع التلاعب الدوائي أو في خلفية متحولة ، يجب تحديد معلم تشريحي والتحقق من صحته قبل المعالجة المسبقة والكمية. هنا ، كان OLM واضحا في جميع اليرقات التي تم تحديدها كميا ولم يتم اختراقه عن طريق التمزق (كما هو الحال في الشكل 7 باء) أو العلاج باستخدام DMSO أو IWR-1. بعد تحديد نقطة البداية الظهرية ، تم إنشاء عائد استثمار بعد الجانب القمي من RPE (من الظهري إلى البطني) حتى تم الوصول إلى النقطة المجاورة لطرف OLM البطني (الشكل 3 باء",D"; رؤوس الأسهم الزرقاء). بعد ذلك ، تم إنشاء نقطة نهاية عائد استثمار بطني بين الجانبين القمي والقاعدي (المواجه للمشيمة) من RPE كما نوقش في الخطوة 6.2.3 (الشكل 3 باء",D"; خط أرجواني). استمر عائد الاستثمار ، بعد الجانب القاعدي من RPE (من البطني إلى الظهري) حتى الوصول إلى الجانب القاعدي المجاور لنقطة البداية عند OLM الظهري. ثم تم تضمين عائد الاستثمار عن طريق إنشاء نهاية ظهرية مدببة (الشكل 3 باء',D'; خط أرجواني) كما هو الحال في البطن. وقد تبين أن الاستئصال الجيني يؤدي إلى فقدان التعبير المركزي eGFP الذي يتم استرداده مع استمرار التجديد (يلخص في الشكل 6)3; وبالتالي ، اعتمادا على مدى التجديد وكثافة eGFP في نقطة الاهتمام الزمنية ، قد تكون قناة eGFP مفيدة فقط لتوليد عائد الاستثمار في MTZ- مجموعة. ولذلك، في حين أن عمليات الاستحواذ البؤرية احتوت أيضا على صور قناة eGFP، فقد اكتمل توليد عائد الاستثمار باستخدام قنوات DAPI وقنوات brightfield كما هو مذكور في الخطوة 6.2.3. كان توليد عائد الاستثمار RPE واضحا في DMSO- و IWR-1 المعالجة MTZ- مجموعات اليرقات والمناطق المشمولة بالزغابات الدقيقة القمية المصطبغة بشكل واضح (الشكل 3 باء; رأس السهم الأحمر) جنبا إلى جنب مع أجسام الخلايا المصطبغة بشكل بارز. تم تطبيق نفس المعلمات على MTZ+ مجموعات اليرقات (الشكل 3D; رأس السهم الأحمر) ؛ ومع ذلك ، بسبب الأنسجة التالفة المتبقية داخل موقع الإصابة ، كان من الصعب تحديد حدود الزغابات الدقيقة والتصبغ القمي في قناة برايتفيلد وحدها في بعض الحالات. وفي هذه المناطق، استخدمت قناة DAPI أيضا لتحديد الحطام الخلوي داخل موقع إصابة RPE، الذي أدرج في عائد الاستثمار (الشكل 3 جيم,D; يشار إلى أمثلة على الحطام الخلوي الموضعي لموقع الإصابة برؤوس الأسهم السماوية). تلطيخ المناعة مع علامات RPE غير ناضجة / ناضجة (على سبيل المثال ، ZPR2 ؛ الشكل 6 دال، ه)37 و / أو المستقبلات الضوئية (على سبيل المثال ، ZPR1)37,38 ويمكن أيضا استخدامها لتيسير تحديد عائد الاستثمار في قواعد التشغيل والتقييم في اليرقات الملغوصة.

في السابق، أظهرت اليرقات الممزقة المعالجة ب IWR-1 من 4 dpf إلى 4 dpi ضعفا كبيرا في تجديد RPE مقارنة بضوابط الأخوة المعالجة بواسطة DMSO (الشكل 8C)3. تم الإبلاغ عن ذلك كنسبة مئوية من استعادة الصباغ المركزي ، الأمر الذي تطلب خبرة سابقة كبيرة في النموذج والقياسات اليدوية للمسافة الزاوية لتعيين حدود التجديد (الشكل 8B ؛ رؤوس الأسهم السوداء). تم إنشاء RpEGEN لأتمتة القياس الكمي لتجديد RPE والحد من التحيزات الجوهرية. ليس ذلك فحسب ، بل مكنت RpEGEN أيضا من توليد مجموعات بيانات قوية للغاية. على سبيل المثال، تم إنشاء 10 نقاط بيانات سابقا من القياس الكمي اليدوي ل n = 10 يرقات MTZ + المعالجة ب DMSO (الشكل 8C؛ النسبة المئوية لاستعادة الصباغ لكل قياسات القسم)3، في حين تم إنشاء 174,801 نقطة بيانات من n = 11 يرقات MTZ+ المعالجة ب DMSO / ROIs هنا باستخدام RpEGEN (الشكل 9C ؛ قياسات كثافة البكسل).

تم تطوير RpEGEN لتقييم التغيرات الإقليمية في التصبغ بشكل تدريجي على كامل RPE عن طريق اشتقاق خط وسط هيكلي (عرض 1 بكسل) من عائد الاستثمار الأصلي الذي تم إنشاؤه باستخدام FIJI (الشكل 4A ، B). لدمج جميع وحدات البكسل داخل عائد الاستثمار للتحليل (أي ليس فقط بيكسلات خط الوسط)، تم إجراء تحويل المسافة الإقليدية على كل بكسل من خط الوسط لإنشاء خريطة لأقرب فهرس خط وسط لكل بكسل في قناع عائد الاستثمار. سمحت خريطة المؤشرات هذه بعزو كل بكسل خارج خط الوسط إلى بكسل خط وسط واحد، مما أدى إلى إنشاء مجموعة بيانات شاملة عبر RPE بالكامل لكل يرقة (الشكل 4E). تم تمثيل الطول الظهري إلى البطني ل RPE بالمسافة الزاوية (الشكل 4G ؛ 0-180 درجة) بدلا من مسافة البكسل العادية (الشكل 4F ؛ 0-1 الوحدات التعسفية) ، حيث كان هذا أكثر بديهية بناء على القياسات السابقة لتجديد RPE 3,4,5 وحقيقة أن المسافة الزاوية لا تختلف مع الاختلافات المورفولوجية. وكان متوسط الكثافات المستمدة من صناديق 5 درجات هو المقياس المختار لتسليط الضوء على الاتجاهات واسعة النطاق والتقليل إلى أدنى حد من التباين عالي التردد الذي لوحظ في البيانات المثبتة بدرجة واحدة (الجدول 1، الشكل 10 ألف). تم اختيار محاكاة التباديل لاختبار الفرضية الصفرية لمعرفة ما إذا كانت متوسطات مجموعتي العلاج (هنا ، DMSO MTZ + و IWR-1 MTZ + (كلاهما 4 نقاط في البوصة) ، الشكل 10B) متشابهة39. تفتقر تقنية إعادة التشكيل هذه إلى افتراضات صارمة حول توزيع البيانات ويمكن استخدامها في مجموعة من إحصاءات الاختبار (على سبيل المثال ، المتوسط ، المتوسط ، الوسيط ، إلخ) لإنشاء تقديرات قوية للقيمة p. يمكن تكييف عدد من هذه المعلمات (على سبيل المثال ، حجم حاوية البيانات الخام والوسيطة ، وتكرار محاكاة التباديل ، وما إلى ذلك) وتعديلها لتناسب احتياجات المستخدم. بالنسبة لهذا الأخير ، تم اختيار 20000 تكرار لإنشاء مقارنة قوية إحصائيا ، ومع ذلك ، ينبغي توخي الحذر لتحقيق التوازن بين الكفاءة الحسابية والمتانة الإحصائية لأن القليل جدا من التكرار قد ينتج تقديرات خاطئة للقيمة p. يوصى بتشغيل قيم تكرار متعددة (10000 ، 20000 ، إلخ) لضمان أن يكون توزيع قيمة p وقيمها مستقرة نسبيا قبل البدء في التفسيرات. زيادة تكرار التباديل سيزيد من القوة الإحصائية (ولكن سيستغرق أيضا وقتا أطول للتشغيل) ، مما قد يكون مفيدا لبعض مجموعات البيانات.

تم تحديد مجموعات بيانات الصور متحدة البؤرة باستخدام RpEGEN كما هو موضح في الخطوة 7. تتوفر RpEGEN المشروحة والبرامج النصية للدعم في GitHub (https://github.com/burchfisher/RpEGEN) إلى جانب TIF 8 بت وملفات عائد الاستثمار المقابلة للمستخدمين المهتمين لاختبارها. أظهرت الخرائط الحرارية التي تعرض بيانات أولية من عائد استثمار اليرقات MTZ توزيعا إجماليا لكثافة البكسل الداكنة (حيث 0 = أسود و 255 = أبيض ، مقياس ألوان 8 بت) يمتد من الظهر (0 درجة) إلى الطول البطني (180 درجة) من RPE ، بغض النظر عن العلاج بنسبة 0.06٪ v / v DMSO أو 15 μM IWR-1 (الشكل 9A ، B). سهل رسم كثافة البكسل المتوسطة التصور بين جميع المجموعات وأظهر أوجه التشابه بين مجموعات MTZ عبر RPE (الشكل 10A ؛ الخطوط السوداء والرمادية). ودعمت هذه البيانات وجود طبقة أحادية اللون مصطبغة سليمة من RPE (الشكل 9E,F) وقدمت قيم كثافة بكسل متوسطة خط الأساس (أي أقل من 150) ل RPE غير المكشوف (الشكل 10A؛ الخطوط السوداء والرمادية). وبالمقارنة، أظهرت البيانات الخام (الشكل 9C,D) والوسيط (الشكل 10A؛ الخطوط الزرقاء والحمراء) من عائد الاستثمار اليرقي MTZ+ توزيعا عاما لكثافة البكسل الأخف وزنا في RPE المركزية، مرة أخرى، بغض النظر عن حالة العلاج. أظهرت اليرقات المعالجة ب DMSO توزيعا مركزيا لوحدات بكسل الضوء عند حوالي 100 درجة (± 15 درجة) (الشكل 9C ؛ صناديق برتقالية حمراء). ويتوافق هذا مع غياب واضح للتصبغ في موقع إصابة RPE المركزي في / حول العصب البصري (الشكل 9G ؛ رؤوس الأسهم الزرقاء). كما أظهرت اليرقات المعالجة ب IWR-1 توزيعا مركزيا لوحدات بكسل الضوء التي تم توسيعها ظهريا (إلى حوالي 50 درجة) وبطنيا (بمقدار 5 درجات تقريبا) عند مقارنتها بعناصر تحكم الأشقاء المعالجة ب MTZ + DMSO (الشكل 9D ؛ الصناديق البرتقالية الحمراء). كان وجود موقع إصابة موسع مرئيا بوضوح في الأنسجة المجزأة (الشكل 9H ؛ رؤوس الأسهم الزرقاء). باستثناء صندوقين من درجة واحدة ، كان الفرق الملحوظ بين مجموعات MTZ + ذا دلالة إحصائية في RPE المركزي (الشكل 10B ؛ منطقة مظللة باللون الأزرق الفاتح بين ~ 40-140 °; p-value ≤ 0.05) ، مما يشير إلى تصبغ RPE مركزي أقل بكثير في اليرقات المعالجة ب MTZ + IWR-1 عند مقارنتها بعناصر تحكم الأشقاء المعالجة ب MTZ + DMSO. تم التحقق من صحة تفسير هذه البيانات الخام (الشكل 9C و D) والبيانات المتوسطة (الشكل 10A) مع المقارنة الإحصائية (الشكل 10B) باستخدام RpEGEN ليس فقط من خلال مراقبة الأنسجة المجزأة (الشكل 9G ، H) ، ولكن أيضا دعم النتائج السابقة من القياس الكمي اليدوي (الشكل 8)3.

Figure 1
الشكل 1: rpe65a:nfsB-eGFP التعبير الجيني المتحول في 5 أيام بعد الإخصاب. (أ-ج) صور كاملة لليرقة المعالجة بتقنية PTU 5 dpf تظهر تعبيرا جينيا خافتا في الغدة الصنوبرية (A ؛ رأس السهم الأصفر) وتعبيرا جينيا متحولا ساطعا في RPE (B ، C) في وقت فحص الاستئصال الجيني. (ب) التعبير الجيني العابر موضعي بشكل واضح إلى الثلثين المركزيين من RPE ، وتسلط رؤوس الأسهم البيضاء الضوء على الحدود بين RPE المحيطية (غير الناضجة) والمركزية (الناضجة). أخضر = eGFP. الأمامي هو ما يصل. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التحقق من الاستئصال الجيني الناجح ل RPE في الجسم الحي. صور كاملة ل (A) ثلاث يرقات غير مبطنة (MTZ-) 7 dpf تظهر تصبغ RPE في جميع أنحاء العين و (B) ثلاث يرقات مبطنة (MTZ +) 2 نقطة في البوصة تظهر منطقة استئصال حيث يوجد غياب للصبغة في الثلثين المركزيين من RPE (رؤوس الأسهم الحمراء). الأمامي هو ما يصل. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: مناطق الاهتمام بقواعد التشغيل والتقييم (ROIs) للقياس الكمي الآلي باستخدام RpEGEN. المقاطع المبردة المستعرضة ل (A ، B) يرقة غير مبطنة (MTZ-) 9 dpf و (C ، D) يرقة مبطأة (MTZ +) 4 نقطة في البوصة مع تمييز عائد الاستثمار RPE باللون الأرجواني. (ب، د) تسلط رؤوس الأسهم الحمراء الضوء على المناطق التي تم فيها تضمين الزغابات الدقيقة القمية المصطبغة بشكل واضح في عائد الاستثمار. (ج، د) تشير رؤوس الأسهم السماوية إلى مناطق على سبيل المثال من حطام DAPI+ الموضعي في موقع الإصابة ، والذي تم استخدامه لتضمين حطام خلايا RPE في عائد الاستثمار. (B',B",D',D") تظهر التكبيرات الرقمية لكل من منطقتي عائد الاستثمار الظهرية والبطنية (المربعات السوداء المنقطة في B و D) نقاط بداية عائد الاستثمار المقترحة (رؤوس الأسهم الزرقاء) ونهايات عائد الاستثمار المدببة التي تعتبر ضرورية للكشف عن نقطة النهاية في MATLAB. تظهر صور برايتفيلد أيضا في الشكل 9E,G. أبيض/رمادي = نواة. الظهرية هي أعلى واليسار البعيد. (أ-دال) أشرطة المقياس = 40 ميكرومتر (B',B",D',D") أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر.

Figure 4
الشكل 4: سير عمل معالجة RpEGEN. (أ) مثال على صورة سطوع 8 بت موجهة بشكل صحيح وعائد استثمار (أحمر) تم إنشاؤه بواسطة FIJI تم استيراده إلى MATLAB. الظهرية هي أعلى واليسار البعيد. يمثل شريط اللون قيم كثافة تدرج رمادي 8 بت حيث 0 = أسود و 255 = أبيض. (ب) الهيكل العظمي الثنائي الأولي (الأبيض) لقناع عائد الاستثمار (الأحمر) الذي يظهر وجود نتوءات خاطئة وتحديد نقطتي البداية والنهاية لترسيم مسافة البكسل الجيوديسي كما هو موضح في (C). يمثل شريط اللون في (C) مسافة البكسل الإقليدية. (D) تتم إزالة توتنهام باستخدام مسار مبسط بأقل تكلفة من بكسل النهاية إلى بكسل البدء ، مما يؤدي إلى خط وسط مستمر خال من النتوءات (أحمر). (ه) أقرب مؤشرات خط الوسط الخطي استنادا إلى تحويل المسافة بين جميع وحدات البكسل في قناع عائد الاستثمار وبيكسلات خط الوسط (أبيض). تسمح قيم الفهرس هذه بتعيين كل بيكسل صورة داخل قناع عائد الاستثمار إلى أقرب بيكسل خط الوسط للتحليل. يمثل شريط اللون قيم فهرس بيكسل خط الوسط الخطي. (F) مثال على مسافة البكسل العادية على طول خط الوسط، حيث 0 (البيكسل الأزرق، البكسل الظهري البعيد) هو بكسل البداية و 1 (البكسل الأحمر البعيد البطني) هو بكسل النهاية. (G) مشابهة ل (F) ولكن باستخدام المسافة الزاوية ، حيث 0 درجة (أزرق) هي بكسل البداية و 180 درجة (أحمر) هي بكسل النهاية. (H) مثال على قيم كثافة البكسل الوسيطة المحسوبة لكل بكسل خط الوسط. يمثل شريط الألوان قيمة كثافة التدرج الرمادي الوسطي لجميع بيكسلات عائد الاستثمار التي تساهم في كل بيكسل خط وسط معين. يوضح هذا الشكل صورا من مجموعة بيانات اختبار وليس يرقات من مجموعات معالجة 0.06٪ v/v DMSO أو 15 μM IWR-1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: دليل على استئصال RPE وانحطاط المستقبلات الضوئية. (أ) المقاطع المبردة المستعرضة ليرقة 6 dpf غير منقوصة. (أ، أ) بعد التعرض ل PTU ، يقتصر التعبير الجيني العابر على خلايا RPE الناضجة ، مع اقتصار التعبير الأكثر سطوعا على الثلثين المركزيين من RPE. تشير رؤوس الأسهم إلى الزغابات الدقيقة القمي. (أ") تكشف صور تباين التداخل التفاضلي (DIC) عن بنية الطبقة النووية الخارجية العادية (ONL ؛ أي المستقبلات الضوئية). (ب، ب') تكشف المقاطع المبردة المستعرضة ليرقة 1 نقطة في البوصة عن اضطراب كبير في مورفولوجيا خلايا eGFP + وعدم التنظيم في تصفيح ONL. تشير الأسهم إلى النوى الرقائقية والبيكنوية. (ب") تكشف صور DIC أيضا عن الاضطراب الملحوظ في بنية ONL. الأخضر = eGFP ، الأزرق = النوى ، الأصفر = ONL. الظهرية هي أعلى واليسار البعيد. يمثل شريط المقياس في (A) 40 ميكرومتر ويمكن تطبيقه على (B). يمثل شريط المقياس في (A') 40 ميكرومتر ويمكن تطبيقه على (A",B',B"). تم تعديل هذا الشكل ونص أسطورة الشكل من Hanovice et al. 2019 (الشكل 1)3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: نموذج تجديد RPE في أسماك الزرد اليرقية . (A) nfsB-eGFP يتم التعبير عنه في RPE الناضج في الثلثين المركزيين للعين. (ب) يؤدي تطبيق MTZ إلى موت الخلايا المبرمج (TUNEL ، الأحمر) من RPE والمستقبلات الضوئية. (ج) يؤدي استئصال RPE إلى انحطاط المستقبلات الضوئية وغشاء Bruch (الخط المنقط). (د) تبدأ قواعد التشغيل والتثبيت غير المقننة في المحيط في الانتشار وتمتد إلى موقع الإصابة (أزرق). (هاء) عندما تظهر قاعدة بيانات الإثبات الإلكترونية المجددة eGFP+ RPE في الأطراف، يمكن تقسيم قاعدة بيانات الأداء إلى أربع مناطق: قاعدة الإثبات الطرفية (pRPE)، وقاعدة الإثبات المتباينة (dRPE)، والمنطقة الانتقالية (TZ)، وموقع الإصابة (IS). (E، مضمن) يظهر RPE المتمايز المجدد (الأخضر) في المحيط القريب من RPE المحيطي غير المتكامل ، ويحتوي على خلايا تكاثرية مجاورة للمنطقة الانتقالية. تتكون المنطقة الانتقالية من خلايا RPE التي لا تزال متمايزة (ZPR2 ، أحمر) وخلايا تكاثرية (زرقاء). يتكون موقع الإصابة من خلايا تكاثرية غير مصطبغة لا تعبر عن أي علامات تمايز RPE. (F) تجديد طبقة RPE وظيفية وغشاء Bruch مكتمل بمقدار 14 نقطة في البوصة. تم تعديل هذا الشكل ونص أسطورة الشكل من Hanovice et al. 2019 (الشكل 14)3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: أقسام الأنسجة المخترقة المستبعدة من تحليل الصور. (A-C) المقاطع المبردة المستعرضة لليرقات من مجموعات بيانات 0.06٪ v/v DMSO و 15 μM IWR-1 التي استوفت معايير الاستبعاد. تظهر إحدى اليرقة تمزق أنسجة RPE الظهرية (A ؛ رؤوس الأسهم الأرجوانية) وتظهر يرقتان أخريان طي الأنسجة التي إما تعيق معلما تشريحيا (OLM الظهري) في قناة DAPI (B ؛ بيضاوية منقطة أرجوانية) أو قد تحرف قياسات كثافة RPE من قناة brightfield (C ؛ بيضاوية منقطة أرجوانية). أبيض/رمادي = نواة. الظهرية هي أعلى واليسار البعيد. أشرطة المقياس = 40 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: التثبيط الدوائي باستخدام IWR-1 يضعف تجديد RPE. المقاطع المبردة المستعرضة لليرقات المبطلة (MTZ +) بدقة 4 نقاط في البوصة من (A) 0.06٪ v / v DMSO و (B) 15 ميكرومتر IWR-1 مجموعات العلاج. تظهر صور Brightfield (A و B) والقياس الكمي للنسبة المئوية لاستعادة RPE / القسم (C) تأخيرا كبيرا في استرداد طبقة أحادية مصطبغة في يرقات IWR-1 المعالجة (اختبار t غير المقترن للطالب ، *** p < 0.0001). (ب) تشير رؤوس الأسهم السوداء إلى الحافة المركزية القصوى ل RPE المجددة. الظهرية هي أعلى واليسار البعيد. يمثل شريط المقياس في (B) 40 ميكرومتر ويمكن تطبيقه على (A). تم تعديل هذا الشكل ونص أسطورة الشكل من Hanovice et al. 2019 (الشكل 13)3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9: مخرجات البيانات الخام من القياس الكمي الآلي لتجديد RPE في RpEGEN. (A-D) خرائط حرارية توضح توزيعات كثافة بكسل الحقل الساطع المجمعة من منطقة عائد الاستثمار RPE بأكملها ، من الظهرية (المحاور x ؛ المسافة الزاوية = 0 درجة) إلى البطنية (المحاور السينية ؛ المسافة الزاوية = 180 درجة) ، لجميع اليرقات في كل مجموعة بيانات: (A) n = 11 ، DMSO MTZ-; (ب) ن = 10، IWR-1 MTZ-؛ (C) n = 11 ، DMSO MTZ + ؛ (D) n = 12 ، IWR-1 MTZ + (من ثلاث مجموعات أصلية مستقلة ، N = 3). على سبيل المثال، يعرض (A) بيانات من 177,460 بكسل عبر 11 عائد استثمار. على المحاور y ، يتم عرض كثافة البكسل استنادا إلى مقياس ألوان 8 بت حيث 0 = أسود و 255 = أبيض. يتم عرض البيانات الخام في 5 درجات (x-axis) بواسطة صناديق قيمة كثافة 5-8 بت (المحور y) حيث الأحمر = الحد الأقصى لعدد الحاويات والأزرق الداكن = الحد الأدنى لعدد المهملات. (ه-ح) المقاطع المبردة المستعرضة لليرقات التمثيلية (E ، F) غير المطلقة (MTZ-) 9 dpf و (G ، H) المذبوحة (MTZ +) 4 نقطة في البوصة من 0.06٪ v / v DMSO و 15 μM IWR-1 مجموعات العلاج. يتم تمييز عائد الاستثمار RPE باللون الأرجواني ويشار إلى أقصى درجات المسافة الزاوية (0 ° = الظهرية ، 180 ° = البطنية). على نطاق واسع ، تظهر هذه البيانات توزيع وحدات البكسل الداكنة (قيم الكثافة بين 0-150) في (A ، B ، E ، F) عائد استثمار غير ملغى عند مقارنته ب (C ، D ، G ، H) العائد على الاستثمار الملغى ، بغض النظر عن العلاج. تظهر البيانات المستمدة من عائد الاستثمار المذبوح (C,G) التوزيع المركزي (100 درجة ± 15 درجة) للبكسل الأخف وزنا (قيم الكثافة بين 150-250) في مجموعة معالجة DMSO التي (D ، H) تتوسع ظهريا (إلى ~ 50 درجة) وبطنيا قليلا (بمقدار ~ 5 درجات) في اليرقات المعالجة ب IWR-1. (ز، ح) يتم تمييز مناطق الاستئصال المركزية هذه الغائبة عن الصباغ بواسطة رؤوس الأسهم الزرقاء. تشير الأسهم السوداء إلى موقع العصب البصري. كما تظهر الصور من اليرقات المعالجة ب DMSO في الشكل 3. أشرطة المقياس = 40 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 10
الشكل 10: نتائج المجموعة والمقارنة الإحصائية المستمدة من القياس الكمي الآلي لتجديد RPE في RpEGEN. (A) قيم وسيطة مجلدة ب 5 درجات ومغلفات ثقة بنسبة 95٪ مشتقة من البيانات الخام لكل مجموعة. تظهر المؤامرة تشابها بين مجموعات MTZ (الخطوط السوداء والرمادية) عبر الطول الظهري (0 درجة) إلى البطني (180 درجة) من RPE مع اختلافات ملحوظة بين وبين مجموعات MTZ + (الخطوط الزرقاء والحمراء) في RPE المركزية (منطقة مظللة باللون الأزرق الفاتح بين ~ 40-140 درجة). على وجه التحديد ، يظهر متوسط كثافة البكسل أخف وزنا (0 = أسود و 255 = أبيض) في IWR-1 MTZ + 4 dpi عند مقارنته بأي مجموعة علاج أخرى ، وهو ما يتوافق مع انخفاض تصبغ RPE المركزي. (ب) مقارنة إحصائية للقيم الوسيطة المشتقة من صناديق بزاوية 1 درجة عبر الطول الظهري (0 درجة) إلى البطني (180 درجة) من RPE ل DMSO MTZ + 4 dpi و IWR-1 MTZ + 4 dpi تعزز الملاحظة في (A). تم حساب p-Values باستخدام محاكاة التباديل مع 20000 تكرار واختبار على الوجهين لكل حاوية 1 درجة. في ظل فرضية العدم القائلة بأن المجموعتين لهما قيم وسيطة متشابهة لأي صندوق 1 درجة مقابل، تشير القيمة p ≤ 0.05 إلى وجود فرق ذي دلالة إحصائية بين متوسطات المجموعة (الخط الأسود المتقطع = فاصل الثقة 95٪ (CI)). يشير وجود قيم p ≤ 0.05 عبر RPE المركزي (منطقة مظللة باللون الأزرق الفاتح بين ~ 40-140 درجة) إلى تصبغ أقل بكثير في اليرقات المعالجة ب IWR-1 المذبوطة (MTZ +) عند مقارنتها بعناصر تحكم الأشقاء المعالجة ب DMSO (MTZ+). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

اسم المتغير نوع المتغير حجم متغير وصف المتغير
عائد الاستثمار خلية {N x 1} أسماء ملفات عائد الاستثمار التي تمت معالجتها
عائد الاستثمار خلية {N x 1} رؤوس العائد على الاستثمار لكل ملف عائد استثمار تمت معالجته
IMGname خلية {N x 1} أسماء ملفات صور TIF التي تمت معالجتها
آي إم جي خلية {N x 1} بيانات صورة برايتفيلد 8 بت لكل TIF تتم معالجته
رويبو خلية {N x 1} قناع عائد استثمار منطقي (0 أو 1) بنفس أبعاد صور IMG
كلاين خلية ث / الجداول {N x 1} (n x 16) بيانات خط الوسط للصور الفردية بما في ذلك x و y والمسافة والزاوية والفهرس وعدد النقاط والإحصائيات
جال دكس خلية {N x 1} بيانات مؤشر خط الوسط المتعلقة بنقاط قناع عائد الاستثمار إلى أقرب نقطة خط وسط لحساب CLine
جلاين بي دبليو خلية {N x 1} مصفوفة منطقية (0 أو 1) بنفس أبعاد صور IMG تشير إلى موقع خط الوسط (=1)
RAW_data جدول ن × 3 جدول يجمع بين جميع البيانات الأولية لكل بكسل في عائد الاستثمار عبر جميع صور IMG المختلفة
BIN_1_deg_all جدول ن × 9 جدول يحتوي على بيانات وإحصاءات مثبتة بدرجة 1 باستخدام البيانات المستمدة من RAW_data
BIN_5_deg_all جدول ن × 9 جدول يحتوي على بيانات وإحصاءات مثبتة ب 5 درجات باستخدام البيانات من RAW_data
BIN_10_deg_all جدول ن × 9 جدول يحتوي على بيانات وإحصاءات مثبتة بزاوية 10 درجات باستخدام البيانات المستمدة من RAW_data

الجدول 1: وصف المتغيرات المصدرة من البرنامج النصي RpEGEN.m إلى ملف MAT. التعاريف هي كما يلي: عائد الاستثمار (عائد الاستثمار) = المنطقة (المناطق) ذات الاهتمام؛ TIF = تنسيق ملف الصورة المعلم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف هذا البروتوكول منهجية لاستئصال RPE وراثيا ودراسة آليات التنكس والتجديد في أسماك الزرد في عمر اليرقات. كما تم تنفيذ هذا البروتوكول بنجاح في الزرد البالغ3 ولكن مع توصيف أقل شمولا ، وهذا هو السبب في أن اليرقات هي التركيز هنا. تشمل الجوانب الحرجة لهذا الجزء من البروتوكول (الخطوات 1-4) ما يلي: 1) إضافة 1.5x PTU إلى الأجنة قبل بداية تكوين الميلانين ، 2) إزالة الأجنة المعالجة ب PTU على 2-3 dpf ، 3) الفحص الدقيق ل eGFP ، و 4) توقيت تغيرات المياه أثناء الاستئصال الجيني باستخدام MTZ. يمنع PTU تخليق الميلانين21,22 وقد تم استخدامه في نموذج الاستئصال RPE هذا لتسهيل فحص التعبير الجيني rpe65a:nfsB-eGFP ولتمكين توصيف العمليات التنكسية والتجديدية RPE على أساس غياب الأنسجة المصطبغة وعودتها اللاحقة ، على التوالي ،3. نظرا لأن PTU سيمنع المزيد من التصبغ ، ولكن ليس أنسجة التصبغ بمجرد بدء تكوين الميلانوجين21 ، يجب إضافة PTU قبل بداية التصبغ ، والذي يبدأ حوالي 24 hpf في الزرد25. هنا ، وفي الدراسات السابقة 4,5 ، تمت إضافة PTU عند حوالي 6 hpf26 لضمان تثبيط قبل بدء تخليق الميلانين. في حين أن PTU تمكن من تصور خطوات البروتوكول الرئيسية ، يمكن أن يؤثر علاج PTU على بعض جوانب التطور (كما نوقش في الخطوة 2.3) ويضعف فقس الجنين. ويمكن أن تؤدي العملية الأخيرة، إذا تأخرت لفترة طويلة جدا، إلى عجز في التشكل والحركة وتؤثر على الجدوى40؛ وبالتالي ، فإن إزالة الأجنة (الفقس) إما إنزيميا باستخدام pronase أو يدويا باستخدام ملقط على 2-3 dpf أمر مهم للحفاظ على صحة اليرقات وتوحيدها قبل الاستئصال الجيني. ومن الاعتبارات الهامة الأخرى لتجنب المشاكل المتعلقة بصحة اليرقات القديمة وقابليتها للبقاء (لا علاقة لها بمعالجة PTU) ، أن اليرقات يجب أن تبدأ في أنظمة تغذية موحدة إذا بقيت خارج نظام المرافق المائية بعد 9 dpf / 4 dpi للتجارب41.

كما هو موضح ، فإن rpe65a يدفع التعبير الجيني في RPE الناضج في الثلثين المركزيين للعين الخلفية. عادة ما يتم اكتشاف التعبير عن eGFP في يرقات 5 dpf المعالجة ب PTU بسهولة ومكثفة بشكل واضح (مشرق) ، كما هو موضح في الشكل 1. يمكن أيضا ملاحظة اليرقات التي تعبر بشكل خافت عن eGFP عند 5 dpf مقارنة بالأشقاء ذوي التعبير الساطع. قد يكون هناك أيضا تباين في نسب كثافة التعبير (أي الساطع مقابل الخافت) بين الأجيال ، حيث أن بعض الأجيال لديها يرقات تعبر بشكل خافت أكثر من غيرها. على أي حال ، عادة ما تمثل اليرقات ذات التعبير الخافت eGFP أقلية من الحيوانات في كل قابض. في حين أنه من غير المعروف ما إذا كانت اليرقات المعبرة بشكل خافت تظهر أنماطا ظاهرية أقل حدة لإصابة RPE ، فقد تم إجراء عمليات الاستئصال في مجموعة eGFP + الساطعة من كل قابض وتم قتل الأشقاء الخافتين نسبيا عند الفحص واستبعادهم من التحليل. وبالمثل ، تم إجراء توصيف واسع النطاق لاستئصال أسماك الزرد RPE وتجديدها في اليرقات غير المتجانسة الزيجوت ل rpe65a: nfsB-eGFP transgene ، عن طريق تجاوز rpe65a: nfsB-eGFP البالغين غير المتجانسين الزيجوت إلى البالغين من النوع البري3. ومع ذلك ، فمن غير المحتمل ، غير المعروف ، ما إذا كانت اليرقات متماثلة الزيجوت ل rpe65a: nfsB-eGFP تظهر أنماطا ظاهرية أكثر حدة للاستئصال. وتشمل الجهود الأخرى المبذولة لتوحيد بروتوكول الاستئصال إضافة أحجام متساوية ومقاسة (على سبيل المثال، 30 مل لكل طبق بتري 10 سم) إلى أطباق MTZ و MTZ + خلال فترة الاستئصال الجيني التي تستغرق 24 ساعة. وبالمثل ، تلقت اليرقات في أطباق العلاج الدوائي كميات متساوية ومقاسة (على سبيل المثال ، 5 مل لكل 6 آبار) وتجديد المركبات الطازجة في الوقت المناسب (على سبيل المثال ، كل 24 ساعة). عند التعامل مع الأطباق ذات المعالجات المختلفة MTZ و / أو المركبات الدوائية ، يجب اتخاذ تدابير دقيقة لمنع الانسكاب والتلوث المتبادل غير المقصود أثناء النقل وتغيرات المياه.

يمكن تعديل بروتوكول استئصال الزرد RPE ليشمل التلاعب الدوائي (الخطوة 5). وقد تم ذلك سابقا لتحديد مسارات إشارات الاستجابة المناعية5 و mTOR4 و Wnt3 كمنظمات حاسمة لتجديد RPE. وقد تبين أن هذا الأخير قابل للتكرار هنا وتم استخدامه للتحقق من صحة RpEGEN. بالإضافة إلى إلقاء الضوء على مسارات تجديد RPE الحرجة ، تم استخدام التلاعب الدوائي على نطاق واسع لدراسات تجديد شبكية العين الزرد10،42،43،44،45،46،47. قبل الدمج في بروتوكول الاستئصال RPE ، يجب تقييم العوامل الدوائية بدقة من حيث السمية والفعالية ومدة العلاج. ويمكن القيام بذلك عن طريق: إجراء تجارب الاستجابة للجرعة لتقييم السمية48؛ تقييم التعبير عن الجينات / البروتينات المستهدفة المعروفة 4,5 ؛ وتقييم العواقب الوظيفية المعروفة للتلاعب الدوائي ، على سبيل المثال ، استنفاد الكريات البيض مع علاج PLX339748،49،50،51. هنا ، تمت إضافة DMSO (التحكم في المركبة) و IWR-1 قبل 24 ساعة من الاستئصال الجيني وتم فحص اليرقات مباشرة قبل المعالجة المسبقة الدوائية على 4 dpf. في حين أن يرقات eGFP + يمكن تمييزها عن يرقات eGFP على 4 dpf ، يمكن أن تظهر شدة eGFP قاتمة تماما ، ولهذا السبب تم إعادة فحص اليرقات للتعبير عن eGFP على 5 dpf (النتائج التمثيلية). قد يكون فحص eGFP قبل 4 dpf صعبا لأن التعبير قد يكون منخفضا جدا بحيث لا يمكن اكتشافه للعين. وبالتالي ، يمكن إضافة المعالجة المسبقة بالعوامل الدوائية قبل 4 dpf (أي على 2 dpf)4 إلى اليرقات غير المفحوصة التي سيتم فصلها على 5 dpf عندما يكون eGFP مرئيا بوضوح. في أي سيناريو تحتاج فيه اليرقات إلى التلاعب بها (على سبيل المثال ، أثناء الفحص ، والتضمين للتصوير ، وما إلى ذلك) ، يجب الحفاظ على ظروف العلاج الدوائي ، وبغض النظر عن عمر الفحص ، يجب إزالة RPE باستخدام MTZ على 5 dpf.

بالإضافة إلى بروتوكول الاستئصال الجيني ، يتم تحديد التعليمات خطوة بخطوة للمعالجة المسبقة لصورة المجهر البؤري والقياس الكمي الآلي لتجديد RPE باستخدام RpEGEN (الخطوات 6-7). تم إنشاء RpEGEN لتوحيد القياس الكمي لتجديد RPE عبر المستخدمين وزيادة متانة مجموعة بيانات المخرجات ، مع تقليل التحيزات الجوهرية التي قد تأتي مع القياس الكمي اليدوي الممل الذي تم إجراؤه سابقا. يتم تنفيذ الجوانب الحرجة لهذا الجزء من البروتوكول أثناء إنشاء عائد الاستثمار (الخطوة 6). أولا ، يجب أن تكون الصورة / العين في الاتجاه الأيسر الخلفي البعيد (على سبيل المثال ، الشكل 3A-D ، الشكل 4) حيث تم تحسين RpEGEN لهذا الاتجاه. ومن الأهمية بمكان أيضا أن تكون الأطراف الظهرية والبطنية لعائد الاستثمار RPE مستدقا إلى طرف مدبب كما هو موضح في الشكل 3B',B",D',D" (خطوط أرجوانية). إذا كانت هذه النهايات مربعة أو مقربة بدلا من ذلك ، فقد يواجه البرنامج النصي RpEGEN صعوبة في تحديد بيكسلات بداية ونهاية الهيكل العظمي المركزي وقد يولد توتنهام في نهايات عائد الاستثمار الطرفي بدلا من خط مركزي (الشكل 4B). يمكن أن تؤدي النتوءات في نهايات عائد الاستثمار الطرفي إلى تقصير خط الوسط أثناء إزالة التحفيز (الشكل 4D) و / أو مشكلات في قياسات المسافة الزاوية في RPE الطرفية (الشكل 4G). تعد أنظمة التسمية المتطابقة لملفات TIF و ROI المقابلة لكل يرقة فردية أيضا خطوة مهمة وحتمية لإقران ملف TIF 8 بت مع عائد الاستثمار الصحيح في RpEGEN. سيؤدي عدم تطابق أسماء ملفات TIF وعائد الاستثمار إلى الفشل في إنشاء سير عمل معالجة RpEGEN الموضح في قسم النتائج التمثيلية (الشكل 4) ، وفي النهاية ، منع القياس الكمي لتجديد RPE باستخدام هذا البرنامج النصي.

بشكل جماعي ، يوفر هذا البروتوكول تعليمات لاستئصال RPE بنجاح في أسماك الزرد اليرقية ، والتعامل مع مسارات الإشارات التي قد تكون ذات أهمية قبل أو أثناء أو بعد إصابة RPE ، وتحديد كمية تجديد RPE بطريقة موحدة مع تحيزات متأصلة محدودة. في سياق النماذج المتاحة في الجسم الحي وفي المختبر لدراسة الإمكانات التجديدية ل RPE ، فإن الزرد فريد من نوعه في قدرته على تجديد RPE الجوهري14. ومع ذلك ، هذا نموذج حاد لإصابة RPE ، وليس مزمنا كما هو الحال مع الأمراض التنكسية RPE المستهدفة للتطوير العلاجي (على سبيل المثال ، AMD). في حين أن هذا هو الحد من النموذج ، فإنه لا يزال منصة ممتازة لدراسة آليات تجديد RPE ، والتي هي غير معروفة إلى حد كبير ، وقد تكون قابلة للتكيف في المستقبل لدراسة الإصابات والأمراض المزمنة. الأدوات والمنهجية الموصوفة هنا متعددة الاستخدامات ويمكن تطبيقها أيضا على دراسات العمليات الخلوية المشاركة في الاستجابة التنكسية ودراسة مصير الأنسجة المجاورة ل RPE بعد الاستئصال. وبالمثل ، يمكن تعديل البرنامج النصي RpEGEN ليناسب احتياجات مخرجات بيانات المستخدم ؛ على سبيل المثال ، لإجراء تحليلات مكانية لعلامات أخرى غير الصباغ (على سبيل المثال ، تحقيقات التهجين في الموقع ، والتعبير عن البروتين ، وما إلى ذلك).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

L.L.L. هو المخترع المشارك في براءة الاختراع الأمريكية رقم 9,458,428 ، والتي تصف طريقة سريعة لاشتقاق ظهارة صبغة الشبكية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. هذا لا علاقة له بالمحتوى الموجود هنا. ليس لدى J.M.G. و G.B.F. ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

تم دعم العمل الموصوف هنا من قبل المعاهد الوطنية للصحة (RO1-EY29410 إلى J.M.G ، ومنحة NIH CORE P30-EY08098 إلى قسم طب العيون) ؛ مركز UPMC لزراعة وعلاج المناعة (إلى L.L.L. و J.M.G.) ؛ وكرسي E. Ronald Salvitti في أبحاث طب العيون (إلى J.M.G.). تم تلقي دعم إضافي من زمالة ويغاند في طب العيون (إلى L.L.L) ، ومؤسسة العين والأذن في بيتسبرغ ، ومنحة غير مقيدة من Research to Prevent Blindness ، New York ، NY. يود المؤلفون أيضا أن يشكروا أماندا بلات على المساعدة التقنية والدكتور هيو هامر وموظفي الألعاب المائية على دعمهم الممتاز لرعاية الحيوانات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lab Material/Equipment
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI) Millipore Sigma D9542
6-well plates Fisher Scientific 07-200-83
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 05-539-13 Catalog number is for 50 mL tubes
Diamond tip scribing pen Fisher Scientific 50-254-51 Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 % Fisher Scientific BP231 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Embryo incubator (large) Fisher Scientific 3720A
Embryo incubator (mini/tabletop) Labnet I5110A
Fluorescence stereo microscope Zeiss Axio Zoom.V16 Or similar, with 488 nm excitation laser/filter
Glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-4 Manufactured by Corning, non-sterile
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo Millipore Sigma 5.04462 Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements
Methylene blue (powder) Fisher Scientific BP117-100 Also available as a premade aqeuous solution
Metronidazole (MTZ) Millipore Sigma M3761 Check instiutional chemical waste disposal requirements
N-phenylthiourea (PTU) Millipore Sigma P7629 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free Fisher Scientific AA433689M Chemical waste, proper disposal required
Petri dishes Fisher Scientific FB0875712 10 cm diameter
Phosphate buffered saline (powder packets) Millipore Sigma P3813 Used to make 10 X PBS stock
Pronase Millipore Sigma PRON-RO
Shaking incubator Benchmark H2010 Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius
Stereo microscope Leica S9i Or similar, with transmitted light illumination
Student Dumont #5 forceps Fine Science Tools 91150-20 Fine-tipped forceps for manual dechorionation
Tabletop rotator/shaker Scilogex SK-D1807-E
Transfer pipette Millipore Sigma Z135003 3.2 mL bulb draw, non-sterile
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Pentair TRS1, TRS2, TRS5 Also available from Fisher Scientific (NC0342409)
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Software Material
FIJI (Fiji is Just ImageJ) FIJI (Fiji is Just ImageJ) https://imagej.net/software/fiji/ Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats
GRAMM examples and how-tos MathWorks https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.
MATLAB MathWorks https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox
MATLAB support MathWorks https://www.mathworks.com/support.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Grierson, I., et al. repair and regeneration of the retinal pigment epithelium. Eye. 8 (2), 255-262 (1994).
  3. Hanovice, N. J., et al. Regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium after widespread genetic ablation. PLoS Genetics. 15 (1), 1007939 (2019).
  4. Lu, F., Leach, L. L., Gross, J. M. mTOR activity is essential for retinal pigment epithelium regeneration in zebrafish. bioRxiv. , (2021).
  5. Leach, L. L., Hanovice, N. J., George, S. M., Gabriel, A. E., Gross, J. M. The immune response is a critical regulator of zebrafish retinal pigment epithelium regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (21), (2021).
  6. Zenno, S., Koike, H., Tanokura, M., Saigo, K. Gene cloning, purification, and characterization of nfsb, a minor oxygen-insensitive nitroreductase from escherichia coli, similar in biochemical properties to frase I, the major flavin reductase in vibrio fischeri. The Journal of Biochemistry. 120 (4), 736-744 (1996).
  7. Hamel, C. P., et al. Molecular cloning and expression of rpe65, a novel retinal pigment epithelium-specific microsomal protein that is post-transcriptionally regulated in vitro. Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15751-15757 (1993).
  8. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: A new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
  9. White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62 (3), 232-240 (2013).
  10. White, D. T., et al. Immunomodulation-accelerated neuronal regeneration following selective rod photoreceptor cell ablation in the zebrafish retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 3719-3728 (2017).
  11. Yoshimatsu, T., et al. Presynaptic partner selection during retinal circuit reassembly varies with timing of neuronal regeneration in vivo. Nature Communications. 7, 10590 (2016).
  12. Montgomery, J. E., Parsons, M. J., Hyde, D. R. A novel model of retinal ablation demonstrates that the extent of rod cell death regulates the origin of the regenerated zebrafish rod photoreceptors. The Journal of Comparative Neurology. 518 (6), 800-814 (2010).
  13. Hagerman, G. F., et al. Rapid recovery of visual function associated with blue cone ablation in zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0166932 (2016).
  14. George, S. M., Lu, F., Rao, M., Leach, L. L., Gross, J. M. The retinal pigment epithelium: Development, injury responses, and regenerative potential in mammalian and non-mammalian systems. Progress in Retinal and Eye Research. 85, 100969 (2021).
  15. Chiba, C., et al. Visual cycle protein rpe65 persists in new retinal cells during retinal regeneration of adult newt. The Journal of Comparative Neurology. 495 (4), 391-407 (2006).
  16. Yoshii, C., Ueda, Y., Okamoto, M., Araki, M. Neural retinal regeneration in the anuran amphibian xenopus laevis post-metamorphosis: Transdifferentiation of retinal pigmented epithelium regenerates the neural retina. Developmental Biology. 303 (1), 45-56 (2007).
  17. Xia, H., Krebs, M. P., Kaushal, S., Scott, E. W. Enhanced retinal pigment epithelium regeneration after injury in mrl/mpj mice. Experimental Eye Research. 93 (6), 862-872 (2011).
  18. McGill, T. J., et al. Subretinal transplantation of human central nervous system stem cells stimulates controlled proliferation of endogenous retinal pigment epithelium. Translational Vision Science and Technology. 8 (3), 43 (2019).
  19. Salero, E., et al. Adult human rpe can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
  20. Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nature Chemical Biology. 5 (2), 100-107 (2009).
  21. Whittaker, J. R. An analysis of melanogenesis in differentiating pigment cells of ascidian embryos. Developmental Biology. 14 (1), 1-39 (1966).
  22. Westerfield, M. Zebrafish Book, 5th Edition; A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregon, USA. (2007).
  23. Hammer, H. S. Water quality for zebrafish culture in The Zebrafish in Biomedical Research. , Elsevier. Amsterdam, Netherlands. 321-335 (2020).
  24. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
  25. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  26. Camp, E., Lardelli, M. Tyrosinase gene expression in zebrafish embryos. Development Genes and Evolution. 211 (3), 150-153 (2001).
  27. Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
  28. Li, Z., et al. Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size. PloS One. 7 (6), 40132 (2012).
  29. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and igf signaling. PLoS One. 6 (8), 22991 (2011).
  30. Leary, S., et al. Avma Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , American veterinary medical association. Schaumburg, Illinois, USA. (2020).
  31. Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on cryosections from embryonic and adult zebrafish eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, 4779 (2007).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Muir, D. GitHub - ReadImageJROI. , Available from: https://github.com/DylanMuir/ReadImageJROI (2021).
  34. Morel, P. Gramm: Grammar of graphics plotting in matlab. Journal of Open Source Software. 3 (23), 568 (2018).
  35. Reinhardt, R., et al. Sox2, tlx, gli3, and her9 converge on rx2 to define retinal stem cells in vivo. The EMBO Journal. 34 (11), 1572-1588 (2015).
  36. Schonthaler, H. B., et al. Evidence for rpe65-independent vision in the cone-dominated zebrafish retina. European Journal of Neuroscience. 26 (7), 1940-1949 (2007).
  37. Yazulla, S., Studholme, K. M. Neurochemical anatomy of the zebrafish retina as determined by immunocytochemistry. Journal of Neurocytology. 30 (7), 551-592 (2001).
  38. Larison, K. D., Bremiller, R. Early onset of phenotype and cell patterning in the embryonic zebrafish retina. Development. 109 (3), 567-576 (1990).
  39. Dwass, M. Modified randomization tests for nonparametric hypotheses. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (1), 181-187 (1957).
  40. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: A refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
  41. Hernandez, R. E., Galitan, L., Cameron, J., Goodwin, N., Ramakrishnan, L. Delay of initial feeding of zebrafish larvae until 8 days postfertilization has no impact on survival or growth through the juvenile stage. Zebrafish. 15 (5), 515-518 (2018).
  42. Meyers, J. R., et al. Β-catenin/wnt signaling controls progenitor fate in the developing and regenerating zebrafish retina. Neural Development. 7, 30 (2012).
  43. Tappeiner, C., et al. Inhibition of the tgfβ pathway enhances retinal regeneration in adult zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0167073 (2016).
  44. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, o-phospho-l-serine, suppresses müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Experimental Eye Research. 91 (5), 601-612 (2010).
  45. Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Ascl1a/dkk/beta-catenin signaling pathway is necessary and glycogen synthase kinase-3beta inhibition is sufficient for zebrafish retina regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (38), 15858-15863 (2011).
  46. Lemmens, K., et al. Matrix metalloproteinases as promising regulators of axonal regrowth in the injured adult zebrafish retinotectal system. The Journal of Comparative Neurology. 524 (7), 1472-1493 (2016).
  47. Elsaeidi, F., Bemben, M. A., Zhao, X. F., Goldman, D. Jak/stat signaling stimulates zebrafish optic nerve regeneration and overcomes the inhibitory actions of socs3 and sfpq. The Journal of Neuroscience. 34 (7), 2632-2644 (2014).
  48. Van Dyck, A., et al. Müller glia-myeloid cell crosstalk accelerates optic nerve regeneration in the adult zebrafish. Glia. 69 (6), 1444-1463 (2021).
  49. Conedera, F. M., Pousa, A. M. Q., Mercader, N., Tschopp, M., Enzmann, V. Retinal microglia signaling affects müller cell behavior in the zebrafish following laser injury induction. Glia. 67 (6), 1150-1166 (2019).
  50. Chen, S., Lathrop, K. L., Kuwajima, T., Gross, J. M. Retinal ganglion cell survival after severe optic nerve injury is modulated by crosstalk between jak/stat signaling and innate immune responses in the zebrafish retina. Development. 149 (8), (2022).
  51. de Preux Charles, A. S., Bise, T., Baier, F., Marro, J., Jaźwińska, A. Distinct effects of inflammation on preconditioning and regeneration of the adult zebrafish heart. Open Biology. 6 (7), 160102 (2016).

Tags

علم الأحياء ، العدد 181 ، الزرد ، ظهارة صبغة الشبكية ، النتروريدوكتاز ، ميترونيدازول ، الاستئصال الجيني ، التجديد ، التصبغ ، المركبات الدوائية ، RpEGEN
الاستئصال بوساطة النيتروكتاز / ميترونيدازول ومنصة MATLAB (RpEGEN) لدراسة تجديد صبغة شبكية الزرد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Leach, L. L., Fisher, G. B., Gross,… More

Leach, L. L., Fisher, G. B., Gross, J. M. Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (181), e63658, doi:10.3791/63658 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter