Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Nitroreductase/metronidazol-gemedieerde ablatie en een MATLAB-platform (RpEGEN) voor het bestuderen van regeneratie van het retinale pigmentepitheel van de zebravis

Published: March 2, 2022 doi: 10.3791/63658
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Ophthalmology, Louis J. Fox Center for Vision Restoration, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Earth Research Institute, University of California, Santa Barbara, 3Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Dit protocol beschrijft de methodologie om het retinale pigmentepitheel (RPE) genetisch te aborteren met behulp van een transgeen zebravismodel. Het aanpassen van het protocol om signaleringsroutemodulatie met behulp van farmacologische verbindingen op te nemen, is uitgebreid gedetailleerd. Een MATLAB-platform voor het kwantificeren van RPE-regeneratie op basis van pigmentatie werd ontwikkeld en wordt gepresenteerd en besproken.

Abstract

Het retinale pigmentepitheel (RPE) bevindt zich aan de achterkant van het oog en vervult functies die essentieel zijn voor het behoud van de gezondheid en integriteit van aangrenzende retinale en vasculaire weefsels. Op dit moment heeft de beperkte herstelcapaciteit van RPE bij zoogdieren, die beperkt is tot kleine verwondingen, de vooruitgang in het begrijpen van in vivo RPE regeneratieve processen belemmerd. Hier wordt een gedetailleerde methodologie gegeven om de studie van in vivo RPE-reparatie met behulp van de zebravis te vergemakkelijken, een gewerveld model dat in staat is tot robuuste weefselregeneratie. Dit protocol beschrijft een transgeen nitroreductase/metronidazol (NTR/MTZ)-gemedieerd letselparadigma (rpe65a:nfsB-eGFP), dat resulteert in ablatie van de centrale tweederde van de RPE na 24 uur behandeling met MTZ, met daaropvolgend weefselherstel. De nadruk wordt gelegd op RPE-ablaties in larvale zebravissen en methoden voor het testen van de effecten van farmacologische verbindingen op RPE-regeneratie worden ook geschetst. Generatie en validatie van RpEGEN, een MATLAB-script dat is gemaakt om de kwantificering van RPE-regeneratie op basis van pigmentatie te automatiseren, wordt ook besproken. Naast actieve RPE-reparatiemechanismen kan dit protocol worden uitgebreid naar studies van RPE-degeneratie en letselresponsen, evenals de effecten van RPE-schade op aangrenzende retinale en vasculaire weefsels, naast andere cellulaire en moleculaire processen. Dit zebravissysteem is veelbelovend bij het identificeren van genen, netwerken en processen die RPE-regeneratie en RPE-ziektegerelateerde mechanismen aansturen, met het langetermijndoel om deze kennis toe te passen op zoogdiersystemen en, uiteindelijk, in de richting van therapeutische ontwikkeling.

Introduction

De hierin beschreven methodologie beschrijft een protocol om het retinale pigmentepitheel (RPE) genetisch te aborteren met behulp van larvale zebravissen. De RPE strekt zich uit over de achterkant van het oog en bevindt zich tussen de gelaagde lagen van het neurale netvlies en de laag vasculatuur die het vaatvlies vormt. Trofische ondersteuning, absorptie van fototoxisch licht en onderhoud van visuele cycluseiwitten zijn slechts enkele van de kritieke functies die de RPE uitvoert en die essentieel zijn voor het behoud van de gezondheid en integriteit van deze aangrenzende weefsels1. Schade aan RPE bij zoogdieren is te herstellen wanneer laesies klein zijn2; schade geleden door grotere verwondingen of progressieve degeneratieve ziekte is echter onomkeerbaar. Bij mensen leiden RPE-degeneratieve ziekten (bijv. leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) en de ziekte van Stargardt) tot permanent verlies van het gezichtsvermogen en, met weinig beschikbare behandelingsopties, verminderde kwaliteit van leven van de patiënt. Het beperkte vermogen van RPE bij zoogdieren om zichzelf te herstellen heeft een kenniskloof gecreëerd op het gebied van RPE-regeneratieve processen. Gezien het robuuste regeneratieve vermogen van de zebravis in veel verschillende weefseltypen, is dit protocol ontwikkeld om een in vivo gewerveld systeem op te zetten om studies naar intrinsiek regenererende RPE te vergemakkelijken en mechanismen bloot te leggen die die respons stimuleren. Met behulp van het hier geschetste ablatieparadigma zijn de canonieke Wnt-signaleringsroute3, de mTOR-route4 en immuungerelateerde responsen5 geïdentificeerd als kritieke mediatoren van RPE-regeneratie, waarschijnlijk met overlappende functies.

In dit genetische ablatieparadigma brengen Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 zebravissen het bacteriële nitroreductase (NTR/nfsB) gen6 tot expressie, gefuseerd met eGFP onder controle van het RPE-versterkerelement, rpe65a7. Ablatie wordt bereikt door de prodrug, metronidazol (MTZ), toe te voegen aan het systeemwater dat zebravissen huisvest. Intracellulaire activering van MTZ door nitroreductase resulteert in DNA-crosslinking en apoptose in NTR/nfsB-tot expressie brengende cellen 8,9. Deze technologie is veel gebruikt in zebravissen om cellen van het netvlies10,11,12,13 en andere weefsels te aborteren8. Samen maken deze elementen gerichte expressie (rpe65a) van een induceerbare celablatiemethodologie (NTR/MTZ)8,9 en een fluorescerende marker (eGFP) voor visualisatie mogelijk.

Er bestaan ook andere interessante in vivo modellen die kunnen worden gebruikt om het regeneratieve potentieel van de RPE14 te bestuderen. Deze zijn breed en omvatten RPE-naar-retina transdifferentiatie post-retinectomie bij amfibieën, waarbij RPE-cellen die verloren gaan aan retinale hergroei worden vervangen15,16; RPE restauratie na letsel in de "super healing" MRL/MpJ muis17; en exogene stimulatie van RPE-proliferatie in een rattenmodel van spontane RPE en retinale degeneratie18, onder anderen. Er zijn ook in vitro modellen ontwikkeld, zoals volwassen menselijke RPE-stamcellen (RPESCs)19. Deze modellen zijn allemaal waardevolle hulpmiddelen die werken aan het blootleggen van de cellulaire processen die verband houden met RPE-regeneratie (bijv. Proliferatie, differentiatie, enz.); de zebravis is echter uniek in zijn vermogen tot intrinsiek RPE-herstel na ablatie.

Hoewel de methodologie hier is geschreven om zich te concentreren op het begrijpen van de mechanismen die RPE-regeneratie aansturen, kunnen de Tg (rpe65a: nfsB-eGFP) - lijn en dit genetische ablatieprotocol worden gebruikt om andere cellulaire processen te bestuderen, zoals RPE-apoptose, RPE-degeneratie en het effect van RPE-letsel op aangrenzende retinale en vasculaire weefsels. Het ablatieprotocol kan ook worden gewijzigd om farmacologische manipulatie op te nemen, wat een handige voorlopige strategie is om signaalroutes van belang te screenen. Het blokkeren van de canonieke Wnt-route met behulp van Inhibitor of Wnt Response-1 (IWR-1)20, is bijvoorbeeld aangetoond dat het de RPE-regeneratie3 schaadt. Dit werd hier herhaald om gebruikers door een farmacologisch manipulatie-experiment te leiden en als proof-of-concept te dienen om een MATLAB-script (RpEGEN) te valideren dat is gemaakt om RPE-regeneratie te kwantificeren op basis van herstel van pigmentatie. Net als de transgene lijn en het ablatieprotocol zijn de RpEGEN-scripts aanpasbaar en kunnen ze worden gebruikt om andere markers / cellulaire processen binnen de RPE te kwantificeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle hierin beschreven methodologieën voldoen aan het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Pittsburgh.

1. Voorbereiding voorafgaand aan het verzamelen van zebravisembryo's

  1. Stel de embryo-incubator in op 28,5°C.
  2. Bereid een 25x stockoplossing van de melanogeneseremmer, N-fenylethiourea (PTU)21,22. Deze stamoplossing wordt geschaald op basis van een gangbaar recept22 en 1x is gelijk aan 0,003% gewicht per volume (% w/v) (bijv. 0,003 g PTU-poeder in 100 ml vloeibaar oplosmiddel).
    1. Om een grote 25x PTU-stamoplossing te maken, voegt u 0,75 g PTU-poeder toe aan 1 l gezuiverd gedeïoniseerd water (hierna dH2O genoemd) en mengt u grondig bij kamertemperatuur (~ 25 °C) met behulp van een roerstaaf en roerplaat. Bewaren bij 4°C gedurende maximaal 3 maanden beschermd tegen licht.
      OPMERKING: Het is moeilijk om PTU in waterige oplossing te krijgen en langdurig roeren 's nachts kan nodig zijn.
      LET OP: PTU is gevaarlijk en er moet voor worden gezorgd dat inname, inademing en / of contact met de huid of ogen worden voorkomen. PTU-poeder en alle PTU-vloeibare derivaten die hierin worden beschreven, moeten mogelijk worden verwijderd als chemisch afval, afhankelijk van de staats- en institutionele voorschriften. Bevestiging van de juiste PTU-afvalverwijderingsmethoden, indien aanwezig, wordt aanbevolen voorafgaand aan gebruik.
    2. Om een 1,5x PTU-werkoplossing (hierna 1,5x PTU genoemd) te maken, voegt u 60 ml 25x PTU-stamoplossing toe aan 940 ml water van de zebravishuisvesting (hierna systeemwater genoemd). Optimale waterkwaliteitsparameters voor zebravissen zijn beschreven23 en aquatische faciliteiten moeten standaard watermonitoringprocedures hebben. Bewaar 1,5x PTU bij 28,5°C gedurende 1-2 weken beschermd tegen licht.
      OPMERKING: Dit protocol wordt routinematig uitgevoerd met behulp van de PTU-concentraties, oplosmiddelen en opslagparameters die worden beschreven in stap 1.2. Uit voorzorg moeten embryo's/larven om de 1-2 dagen worden geobserveerd terwijl ze in PTU zijn om de werkzaamheid te valideren en aanhoudende depigmentatie te bevestigen. De oplossings- en/of bewaarcondities moeten worden geoptimaliseerd als een afname van de oplosbaarheid/werkzaamheid van PTU wordt vermoed.
  3. Bereid een stamoplossing van 0,05% w/v methyleenblauw, een schimmelgroeiremmer, door 0,05 g methyleenblauwpoeder toe te voegen aan 100 ml dH2O. Meng grondig met een roerstaaf en roerplaat. Bewaren bij 4°C.
  4. Bereid pipetten voor op manipulatie van embryo's/larven (bijv. het verplaatsen van embryo's/larven tussen petrischalen, het scheiden van larven tijdens fluorescentiescreening, het verzamelen van geëuthanaseerde larven in microcentrifugebuizen voor fixatie, enz.) door het taps toelopende uiteinde van een glazen Pasteur-pipet terug te snijden met behulp van een diamantpuntkrabbelpen. Ets rond de omtrek van de pipet met de diamantpen en trek of klik het uiteinde er voorzichtig af om een schone breuk te maken.
    OPMERKING: De mond van de pipet moet glad en breed genoeg zijn om gemakkelijk een embryo op te nemen dat zich nog in het chorion bevindt zonder te scheren. Gebruik als alternatief een bulb draw transfer pipet. Bereide pipetten kunnen ook worden gebruikt om vloeistof te verwijderen tijdens waterverversingen (in plaats van gieten) om het verlies van embryo's / larven te minimaliseren.
  5. Bereid een 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing in 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (voeg bijvoorbeeld 10 ml 16% PFA toe aan 4 ml 10x PBS en 26 ml dH2O). Bewaren bij 4°C gedurende maximaal 4 weken beschermd tegen licht.
    LET OP: Paraformaldehyde is een gevaarlijke chemische stof en moet in een chemische zuurkast worden behandeld en op de juiste manier worden weggegooid. Voorzichtigheid is geboden en persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) moeten worden gedragen om inname, inademing en/of contact met de huid of ogen te voorkomen.

2. Het verzamelen en onderhouden van embryo's van zebravissen voorafgaand aan genetische ablatie (0-5 dagen na de bevruchting)

  1. Houd volwassen zebravissen zoals eerder beschreven 3,4,5. De middag/avond voorafgaand aan het verzamelen van embryo's, scheid volwassen zebravissen in kweekbakken om te paaien.
  2. Verzamel de volgende ochtend (0 dagen na de bevruchting (dpf)) embryo's in petrischalen met een diameter van 10 cm in systeemwater en verwijder alle niet-levensvatbare of onbevruchte eieren, die ondoorzichtig lijken en / of onregelmatig cytoplasma en mislukte splitsing vertonen24.
    OPMERKING: Normale splitsings- en ontwikkelingsstadiëringsgebeurtenissen zullen zichtbaar zijn in gezonde embryo's zoals beschreven25. Petrischalen moeten gedurende het hele protocol voor driekwart vol worden gehouden (~ 30 ml voor een schaal met een diameter van 10 cm).
    1. Voeg twee druppels van 0,05% w/v methyleenblauw toe aan elke petrischaal, meng voorzichtig en bewaar embryo's bij 28,5 °C voor de rest van het protocol.
  3. Vervang ongeveer 6 uur na de bevruchting (hpf)4,5,26 het systeemwater in embryonale petrischalen door 1,5x PTU (werkoplossing gemaakt in stap 1.2.2) en vul methyleenblauw aan.
    OPMERKING: PTU moet aan embryo's worden toegevoegd vóór het begin van pigmentatie (d.w.z. vóór 24 hpf)25, omdat reeds gepigmenteerde weefsels niet zullen depigmenteren bij toevoeging van PTU21. Er moet echter worden opgemerkt dat verminderde ooggrootte, oculaire en craniofaciale tekorten en verstoring van sommige signaalroutes (bijv. Schildkliersignalering) zijn gemeld bij met PTU behandelde zebravissen 27,28,29. De ontwikkelingstoxiciteit van PTU lijkt afhankelijk te zijn van de concentratie en timing van PTU-toevoeging27,29. Zoals hierboven vermeld voor het valideren van de werkzaamheid van PTU (stap 1.2), moeten tekenen van PTU-toxiciteit ook zorgvuldig worden gecontroleerd en, indien vermoed, de werkconcentratie en/of het tijdstip van PTU-toevoeging worden geoptimaliseerd.
  4. Op 2-3 dpf, dechorionate embryo's met behulp van vers gemaakte pronase-oplossing.
    1. Los pronase op in 1,5x PTU in een concentratie van 2 mg/ml door vortexing.
      LET OP: Pronase is verpakt als een zeer fijn poeder en is irriterend. Neem maatregelen om inademing en/of contact met huid, ogen, etc. te voorkomen.
    2. Scheid uitgekomen embryo's van niet-gehate embryo's en pronase-behandel alleen niet-gehate embryo's.
    3. Vervang 1,5x PTU door 2 mg/ml pronase-oplossing gemaakt in stap 2.4.1 en laat niet-gehate embryo's gedurende 4-5 minuten zitten met zachte agitatie (bijv. op een tafelrotator / shaker of door handmatig te zwenken).
    4. Giet de pronase-oplossing af en spoel onmiddellijk af met verse 1,5x PTU. Triturateer voorzichtig 1,5x PTU spoel over embryo's met een bulb-draw transfer pipet.
    5. Herhaal een tweede 1,5x PTU-spoeling om alle chorionresten weg te gooien en vul vervolgens 1,5x PTU aan voor onderhoud.
      OPMERKING: Embryo's kunnen ook handmatig worden gedechorioneerd met behulp van een tang met fijne punt. In dit geval moet chorionresten worden verwijderd en 1,5x PTU worden aangevuld na handmatige dechorionatie.
  5. Controleer de gezondheid van embryo's / larven en vul elke 1-2 dagen 1,5x PTU aan. Embryo's/larven worden in 1,5x PTU gehouden tot ablatie bij 5 dpf.
    OPMERKING: Het belang van stap 2.3 en 2.4 wordt verder behandeld in de sectie Discussie.

3. Screening zebravislarven op rpe65a:nfsB-eGFP en genetische ablatie van het retinale pigmentepitheel (5-6 dagen na de bevruchting)

  1. Maak een verse 10 mM metronidazol (MTZ) oplossing op 5 dpf (dag van ablatie). Dit proces duurt 2 uur om te voltooien.
    1. Voeg MTZ-poeder toe aan systeemwater zonder PTU en meng grondig door krachtig schudden (bijv. 250 rotaties per minuut) gedurende 1 uur bij 37 °C.
    2. Koel de 10 mM MTZ-oplossing voor nog eens 1 uur bij kamertemperatuur op een tafelrotator / shaker en zorg voor volledige oplossing voordat u deze toevoegt aan petrischalen met larven.
      OPMERKING: Fluorescentiescreening en scheiding van eGFP+- larven (stap 3.2) kan worden uitgevoerd tijdens incubaties bij 37 °C en kamertemperatuur.
      LET OP: MTZ is gevaarlijk en er moet voor worden gezorgd dat inname, inademing en/of contact met de huid of ogen worden voorkomen. MTZ-poeder en alle hierin beschreven vloeibare derivaten moeten mogelijk worden verwijderd als chemisch afval, afhankelijk van de staats- en institutionele voorschriften. Bevestiging van de juiste MTZ-afvalverwijderingsmethoden, indien aanwezig, wordt aanbevolen vóór gebruik.
  2. Screen zebravislarven voor het rpe65a:nfsB-eGFP transgen.
    1. Verdoving larven met 0,168 g/l tricaïne (MS-222) en afzonderlijke transgene (eGFP+) larven (figuur 1) van niet-transgene (eGFP-) larven met behulp van een fluorescentie stereomicroscoop met een 488 nm excitatielaser/filter.
      OPMERKING: Tricaïne moet worden toegevoegd aan 1,5x PTU en/of farmacologische samengestelde oplossingen, omdat larven ondergedompeld moeten blijven in de behandeling terwijl ze worden gescreend op eGFP. Incubeer larven in tricaïne alleen voor de duur van de screening (bijvoorbeeld ≤10 min voor een enkele petrischaal van 10 cm met 50 larven).
    2. Wek gescreende larven onmiddellijk op door direct in een petrischaaltje te pipetteren met verse 1,5x PTU zonder tricaïne.
    3. Na voltooiing van de screening, verdeelt u de eGFP+ larven verder in twee groepen petrischalen: één groep om MTZ-behandeling te krijgen (ablated / MTZ +) en één groep om de niet-aangegeven (MTZ-) controle te zijn.
  3. Ablate het retinale pigmentepitheel.
    1. Verwijder 1,5x PTU uit de onopgeloste (MTZ-) controleschalen en voeg vers systeemwater toe zonder PTU.
    2. Verwijder 1,5x PTU uit de ablated (MTZ+) behandelingsschotels en voeg de vers gemaakte 10 mM MTZ-oplossing toe (stap 3.1.).
    3. Verwijder de 10 mM MTZ-oplossing na precies 24 uur (aangewezen 1 dag na het letsel (dpi)) en voeg vers systeemwater toe zonder PTU. Ververs het verse systeemwater zonder PTU op de MTZ-schotel (en). Larven zullen niet opnieuw worden blootgesteld aan PTU voor de rest van het protocol.
      OPMERKING: Het kan moeilijk zijn om alle 1,5x PTU (stappen 3.3.1 en 3.3.2) of 10 mM MTZ (stap 3.3.3) tussen oplossingsuitwisselingen te pipetten of af te gieten zonder larvenverlies, omdat dieren actief rondzwemmen. In dit geval kunnen was(en) van systeemwater zonder PTU worden toegevoegd om een succesvolle uitwisseling van oplossingen te garanderen.

4. Larvaal onderhoud post-genetische ablatie (6+ dagen na de bevruchting)

  1. Controleer larven en vul dagelijks het systeemwater zonder PTU aan tot euthanasie (stap 5.6) of keer terug naar de zebravishuisvesting.
  2. Monitor het succes en de mate van ablatie in vivo op 2 dpi (7 dpf) met behulp van doorgelaten lichtverlichting op een stereomicroscoop (figuur 2).

5. Integratie van farmacologische behandeling in het epiblatieprotocol voor retinale pigmentepitheel van zebravissen

OPMERKING: Zoals eerder uitgevoerd3, wordt de behandeling met 15 μM IWR-1 of volume-gematchte dimethylsulfoxide (DMSO) voertuigcontrole vanaf 4 dpf hier beschreven als een voorbeeldexperiment om RpEGEN te testen. Concentraties en tijdlijnen kunnen variëren met verschillende farmacologische verbindingen en aanbevelingen voor dosis-responsvalidatie, behandelingsduur, screening en andere aspecten van experimenteel ontwerp voor farmacologische manipulatiestudies worden behandeld in de sectie Discussie. Volg stap 6 en 7 als beeldanalyse vereist is.

  1. Verzamel en onderhoud embryo's zoals beschreven in stap 2. Dechorionaat embryo's op 2 dpf.
  2. Screen eGFP+ larven op 4 dpf zoals beschreven in stap 3.2. Plaats in plaats van petrischalen eGFP + -larven in 6-well-platen met een dichtheid van n ≤ 10 larven per 6-well voor farmacologische behandeling. Wijs aparte 6-putplaten aan voor larven die niet worden aangegeven (MTZ-) en larven die worden geableerd (MTZ +).
    OPMERKING: Het eGFP-signaal is zichtbaar op 4 dpf, maar lijkt zwakker dan de signaalintensiteit op 5 dpf.
  3. Voorbehandeling van 4 dpf eGFP+ larven met 15 μM IWR-1 of volume-gematchte DMSO voertuigcontrole gedurende precies 24 uur voorafgaand aan genetische ablatie met 10 mM MTZ-oplossing.
    OPMERKING: Vaak is er zeer weinig verbinding nodig voor farmacologische behandelingsexperimenten. Om te voorkomen dat kleine hoeveelheden IWR-1-poeder worden afgewogen, wordt deze farmacologische verbinding al gekocht in DMSO-oplossing, in een concentratie van 25 mM, en bij aankomst in kleinere volumes gealiquoteerd om herhaalde vries-dooicycli te voorkomen.
    1. Bepaal het volume van farmacologische en voertuigcontrolebehandelingen die nodig zijn en aliquot 1,5x PTU in conische buizen dienovereenkomstig. Een volume van 5 ml /put van een 6-well plaat wordt aanbevolen.
    2. Voeg IWR-1-voorraad toe aan 1,5x PTU voor een eindconcentratie van 15 μM IWR-1 (bijv. 3 μL van 25 mM IWR-1 per 5 ml van 1,5x PTU). Voeg een overeenkomend volume DMSO-voorraad toe aan 1,5x PTU (bijv. 3 μL ≥ 99,7% DMSO per 5 ml van 1,5x PTU). Hier levert dit uiteindelijk een eindconcentratie op van 0,06% volume/volume (% v/v) DMSO. Meng goed door vortexing en bevestig visueel het oplossen van verbindingen.
      LET OP: DMSO, IWR-1 en andere farmacologische verbindingen en oplosmiddelen moeten mogelijk worden verwijderd als chemisch afval, afhankelijk van de staats- en institutionele voorschriften. Bevestiging van het gevarenniveau en de juiste afvalverwijderingsmethoden voor deze verbindingen, indien aanwezig, wordt aanbevolen vóór gebruik.
    3. Verwijder 1,5x PTU uit de eGFP+ larven in 6-well platen en voeg 5 ml/put vers gemaakte 0,06% v/v DMSO of 15 μM IWR-1 behandelingen toe uit stap 5.3.2.
  4. Op 5 dpf, ablate de RPE. Naast de 24-uurs voorbehandeling (stap 5.3) blijven larven ondergedompeld in farmacologische en voertuigcontrolebehandelingen gedurende 24 uur genetische ablatie met 10 mM MTZ en tijdens herstel na ablatie, tot fixatie (bijv. van 4-9 dpf).
    1. Maak 10 mM MTZ-oplossing 2 uur voordat u genetische ablatie uitvoert (stap 3.1).
    2. Bepaal het volume van farmacologische en voertuigcontrolebehandelingen die nodig zijn voor zowel niet-geblazen (MTZ-) als ablated (MTZ+) 6-well platen en aliquot geschikte volumes van ofwel zoet systeemwater zonder PTU (MTZ-) of 10 mM MTZ-oplossing (MTZ +) in conische buizen. Dit levert vier behandelingsvoorwaarden op: 1) 0,06% v/v DMSO, MTZ-; 2) 15 μM IWR-1, MTZ-; 3) 0,06% v / v DMSO, MTZ +; en 4) 15 μM IWR-1, MTZ+.
    3. Voeg IWR-1- en DMSO-voorraadoplossingen toe aan de respectieve conische buizen zoals uitgevoerd in stap 5.3.2. Meng goed door vortexing en bevestig visueel het oplossen van verbindingen.
    4. Verwijder 0,06% v/v DMSO en 15 μM IWR-1 behandelingen in 1,5x PTU (stap 5.3.2) van aangewezen niet-aangegeven (MTZ-) en ablated (MTZ+) 6-well platen en vul aan met de juiste behandelingen in stap 5.4.3.
    5. Verwijder 0,06% v/v DMSO en 15 μM IWR-1 behandelingen in 10 mM MTZ oplossing na precies 24 uur en vul aan met behandelingen in vers systeemwater zonder PTU. Vul 0,06% v/v DMSO en 15 μM IWR-1 behandelingen aan in zoet systeemwater zonder PTU op de niet-aangegeven (MTZ-) 6-well plaat(en).
  5. Volg larvale onderhoudspost-ablatie zoals beschreven in stap 4 en vul dagelijks 0,06% v/v DMSO of 15 μM IWR-1 behandelingen aan in systeemwater zonder PTU.
  6. Euthanaseer larven op 9 dpf (4 dpi voor leeftijdsgematchte MTZ-behandelde broers en zussen) door dieren onder te dompelen in 0,3 g / L tricaïne-oplossing (dodelijke overdosis) in combinatie met snel koelen (bijv. Petrischalen op ijs plaatsen) gedurende ten minste 20 min30. Controleer of de larven niet reageren op aanraking en fixeer in 4% PFA (stap 1.5) gedurende 3 uur bij kamertemperatuur of bij 4 °C 's nachts.
  7. Verwerk post-fixatie larvaal weefsel voor z-stack beeldacquisitie op een confocale microscoop zoals eerder beschreven 5,31 en hier in de sectie Representatieve resultaten. Analyse in stap 6 en 7 vereist minimaal de verwerving van nucleaire marker (bijv. DAPI) en brightfield z-stack-afbeeldingen.

6. Confocale microscoop z-stack beeldvoorbewerking in FIJI (ImageJ)

  1. Importeer en formatteer confocale microscoop z-stack afbeeldingen met FIJI32.
    1. Open microscoopafbeeldingen met behulp van de importopties voor bio-indelingen die zijn ingesteld op Stapel weergeven met: Hyperstack en Kleurmodus: Grijswaarden.
    2. Genereer een maximale intensiteitsprojectie van het geïmporteerde microscoopbeeld door Afbeelding | Stapels | Z-project. Stel in het ZProjection-venster Slice starten en Slice stoppen in om alle segmenten voor die afbeelding op te nemen. Stel bijvoorbeeld Slice starten: 1 en Stop Slice: 18 in voor een z-stack met in totaal 18 slices. Kies Projectietype: Maximale intensiteit en klik op OK.
    3. Converteer het projectiebestand met maximale intensiteit naar een 8-bits afbeelding (indien nog niet) door Afbeelding | Soort | 8-bits.
    4. Heroriënteer de afbeelding zodat de dorsale zijde omhoog is en distale (d.w.z. de lens) wordt achtergelaten door Afbeelding | Transformeer | Horizontaal spiegelen (kies voor de laatste opdracht de optie die het beste past bij de richting die nodig is voor die afbeelding). Voor een meerkanaals afbeelding klikt u op Ja in de Process Stack? venster om alle kanalen te heroriënteren.
      OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang, maar niet nodig als de afbeelding zich al in de dorsale omhoog, distale linkeroriëntatie bevindt. Zie figuur 3A-D en figuur 4 voor afbeeldingen met ogen in de juiste richting voor verwerking.
    5. Sla de 8-bits projectie met maximale intensiteit op als een TIF-bestand (Tagged Image File Format) door Bestand | Opslaan als | Tiff....
  2. Genereer RPE-regio van belang (ROI) met FIJI.
    1. Open een 8-bits TIF-installatiekopie die is gegenereerd zoals beschreven in stap 6.1. Start de ROI Manager door | Gereedschap | ROI-manager.
    2. Afbeelding | gebruiken Zoom in en schakel tussen de DAPI- en brightfield-kanalen om het punt of de punten te identificeren waarop de apicale kant van de RPE grenst aan de punt van het buitenste limiterende membraan (OLM) (figuur 3B', B", D', D"; blauwe pijlpunten). Gebruik dit anatomische oriëntatiepunt als uitgangspunt voor de ROI.
    3. Maak de RPE ROI met het gereedschap Polygon Selections (in de FIJI-werkbalk) met behulp van zowel de DAPI- als brightfield-afbeeldingskanalen en de zoomfunctie (Image | Zoom) om apicale en basale RPE-grenzen te identificeren. Breng de dorsale en ventrale uiteinden van de ROI (d.w.z. waar de ROI overgaat van de apicale naar basale kant van de RPE) naar een scherp punt in plaats van af te stompen of af te ronden (Figuur 3B', B", D', D"; magenta-lijnen).
      OPMERKING: Het maken van een puntig ROI-einde is een cruciale stap voor het optimaliseren van eindpuntdetectie met behulp van RpEGEN en wordt behandeld in de sectie Discussie.
    4. Voeg de ROI toe door in de ROI Manager op Toevoegen te klikken. Pas de ROI indien nodig aan en klik op Update in de ROI Manager.
    5. Sla het ROI-bestand op door Meer>> | Redden... binnen de ROI Manager. Gebruik identieke namen voor overeenkomende ROI- en TIF-afbeeldingsbestanden (bijvoorbeeld [bestandsnaam].tif en [bestandsnaam].roi).
  3. Combineer 8-bits TIF- en ROI-bestanden voor elke voorwaarde in één map. De map, DMSO_9dpf, bevat bijvoorbeeld alle overeenkomende TIF- en ROI-bestanden voor de 9 dpf unablated (MTZ-) 0,06% v/v DMSO-behandelde larvale groep.

7. Kwantificering en visualisatie van RPE-regeneratie met behulp van RpEGEN-scripts

  1. Installeer en bereid RpEGEN-scripts voor.
    1. Download de nieuwste RpEGEN-scripts van de GitHub-repository (https://github.com/burchfisher/RpEGEN) door op Code | Zip downloaden.
    2. Pak de map uit en plaats deze op de gewenste werkruimtelocatie (bijvoorbeeld Desktop).
    3. Open MATLAB.
    4. Navigeer naar de map RpEGEN in het deelvenster Huidige map (meestal aan de linkerkant).
    5. Klik met de rechtermuisknop op de map RpEGEN en kies Toevoegen aan pad | Geselecteerde mappen en submappen. Hiermee wordt de map toegevoegd aan het MATLAB-pad, zodat deze automatisch alle scripts in de map kan vinden en uitvoeren.
    6. Dubbelklik op de map RpEGEN in het deelvenster Huidige map om alle submappen en M-bestanden weer te geven.
    7. Dubbelklik op het bestand RpEGEN.m om te openen in het deelvenster Editor .
    8. Voer in de sectie USER-DEFINED VARIABLES van het bestand RpEGEN.m de maplocaties in voor de mappen met de ROI-bestanden (.roi), afbeeldingsbestanden (.tif) en waar uitvoerbestanden moeten worden opgeslagen. Voer de groepsnaam in voor het MAT-bestand dat moet worden geëxporteerd (bijvoorbeeld DMSO_9dpf, DMSO_4dpi, enz.) en de locatie van het brightfield-kanaal in de TIF-afbeeldingsstapel (bijvoorbeeld 3, als brightfield het derde kanaal in een afbeeldingsstapel is). Als het afbeeldingsbestand alleen de brightfield-afbeelding bevat, moet dit gelijk zijn aan 1.
  2. Voer het RpEGEN.m-script uit en valideer de resultaten.
    OPMERKING: RpEGEN vereist dat de Image Processing Toolbox, de Curve Fitting Toolbox en de Statistics and Machine Learning Toolbox worden geactiveerd op de MATLAB-licentie van de gebruiker om te kunnen worden uitgevoerd. Daarnaast is de vrij beschikbare ReadImageJROI toolbox33 vereist om FIJI ROIs in MATLAB te importeren; het wordt echter geleverd in de map RpEGEN samen met andere functie M-bestanden die geen activering vereisen.
    1. Voer het script uit door op de knop Uitvoeren in het editormenu boven aan MATLAB te klikken.
      OPMERKING: Eenmaal gestart, biedt het opdrachtvenster uitgebreide uitvoer die de voortgang van het script aangeeft. Na het opslaan van het MAT-bestand met de geëxtraheerde gegevens, verschijnt er een figuur met drie panelen en wordt deze als PDF opgeslagen in de uitvoermap voor elke afbeeldingsrun. Dit zijn cijfers voor kwaliteitscontrole (QC) om ervoor te zorgen dat alles goed is verlopen en omvatten: 1) het brightfield-beeld bedekt met de ROI (figuur 4A); 2) de ROI met middellijn en bijbehorende hoekafstand (graden) (figuur 4G); en 3) de ROI met de mediaanintensiteitswaarden van de middellijn (0-255, 8-bits kleurenschaal) (figuur 4H). Wacht tot de QC-PDF's zijn opgeslagen in de uitvoermap en het laatste cijfer is verdwenen voordat u doorgaat naar de volgende stap.
    2. Open de afzonderlijke PDF's die zijn geëxporteerd naar de uitvoermap in een PDF-viewer en controleer of alle ROIs overeenkomen met de brightfield-afbeeldingen, dat de middellijnwaarden redelijke benaderingen zijn van het midden van de ROI's en of de mediane intensiteitswaarden op de juiste manier zijn gevuld met gegevens (d.w.z. niet allemaal dezelfde waarde over de hele middellijn).
      OPMERKING: Een gedetailleerde beschrijving en structuur van elke variabele die door RpEGEN.m in het MAT-bestand is opgeslagen, is te vinden in tabel 1.
  3. Voer het script RpEGEN_PermPlot.m. uit.
    OPMERKING: Het RpEGEN_PermPlot.m-script gebruikt de uitvoer van RpEGEN.m om statistische vergelijkingen uit te voeren met behulp van een permutatiesimulatie van de medianen van twee groepen en biedt ook de code voor het reproduceren van de plots in dit artikel met behulp van de vrij beschikbare GRAMM toolbox34, die ook is opgenomen in de RpEGEN-map.
    1. Dubbelklik op het RpEGEN_PermPlot.m-bestand om te openen in een nieuw editortabblad .
    2. Voer onder SECTIE 1 - DOOR DE GEBRUIKER GEDEFINIEERDE VARIABELEN in het bestand RpEGEN_PermPlot.m de maplocatie in voor de uitvoermap met de MAT-bestanden van het uitvoeren van RpEGEN.m en voer elke MAT-bestandsnaam in die moet worden geladen (bijvoorbeeld DMSO_4dpi.mat, IWR1_4dpi.mat).
    3. Voer dit gedeelte van het script uit door te klikken op de knop Sectie uitvoeren in het editormenu boven aan MATLAB.
    4. Voer in hoofdstuk 2 de namen van de twee groepen in voor statistische vergelijking in de data_A en data_B variabelen (dit zijn de groepen waaruit medianen worden afgeleid met behulp van de permutatiesimulatie). Voer in de variabele bin_sz het aantal graden in waarover de mediane intensiteitswaarden voor de gegevenssets moeten worden geïntegreerd (standaard is bakken van 1 graad).
      OPMERKING: De variabele reps geeft het aantal permutaties aan dat moet worden gebruikt om een kansverdeling op te bouwen en kan op elk getal worden ingesteld (standaardwaarde is 20.000). Over het algemeen zal een hoger aantal herhalingen statistisch robuuster zijn, maar zal de verwerkingstijd toenemen.
    5. Voer dit gedeelte van het script uit door te klikken op de knop Sectie uitvoeren in het editormenu boven aan MATLAB. Het kan enige tijd duren voordat deze sectie is voltooid, afhankelijk van het aantal opgegeven herhalingen, maar biedt wel een continue statusupdate in het opdrachtvenster.
    6. Voer de secties HEATMAP FIGURE EN GROUP RESULTS EN P-VALUES onafhankelijk van elkaar uit met de knop Sectie uitvoeren . Bewerk gegevensvariabelen in secties met de opmerking "VOER HIER GEGEVENS IN". PDF's van deze figuren worden automatisch voor elk opgeslagen en kunnen eenvoudig worden gewijzigd in elke vectorsoftware nabewerking.
      OPMERKING: De plots die in het RpEGEN_PermPlot.m-bestand worden gegenereerd, zijn ad hoc en vereisen waarschijnlijk wijzigingen op basis van de specifieke gegevens- en visualisatiebehoeften van elke gebruiker. De cijfers bieden echter een solide basis die gemakkelijk kan worden geïndividualiseerd met behulp van zowel MATLAB- als GRAMM-websites.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het is bekend dat het remmen van de canonieke Wnt-signaleringsroute de RPE-regeneratie van zebravissen aanzienlijk schaadt met behulp van het genetische ablatieparadigma (rpe65a: nfsB-eGFP) en farmacologische manipulatiemethodologie (IWR-1) beschreven in het protocol3. Dit experiment werd hier herhaald om een geautomatiseerde methode te valideren voor het kwantificeren van zebravis RPE-regeneratie op basis van pigmentatie. De hieronder samengevatte resultaten omvatten alle stappen van het protocol, van de dag van bevruchting (0 dpf) tot kwantificering van RPE-regeneratie met behulp van RpEGEN.

Implementatie van het RPE-ablatieprotocol (met farmacologische manipulatie) bij larvale zebravissen
Embryo's verzameld uit drie afzonderlijke oudergroepen (N = 3) begonnen de behandeling met 1,5x PTU rond 6 hpf en afwezigheid van pigmentatie in de RPE en oppervlaktemelanocyten werd visueel bevestigd op 1 dpf. Embryo's werden enzymatisch gedechorioneerd op 2 dpf met behulp van 2 mg / ml pronase (stap 2.4). Op 4 dpf werden larven verdoofd met tricaïne (MS-222) en gescreend op eGFP met behulp van een fluorescentie stereomicroscoop (stappen 3.2 en 5.2). eGFP+ larven werden verplaatst naar 6-putplaten (n = 10 larven/put) en werden behandeld met 0,06% v/v DMSO (voertuigcontrole) of 15 μM IWR-1 (stap 5.3). De hier gerapporteerde larvale dichtheid was aanvankelijk gebaseerd op de benadering van 1 larve/cm2 groeigebied en werd gevalideerd door zorgvuldige gezondheidsmonitoring (bijv. zwemblaasontwikkeling) in de loop van de tijd. De intensiteit van eGFP leek zwak op 4 dpf, dus larven werden opnieuw gescreend op 5 dpf om heldere eGFP-expressie te bevestigen (figuur 1). RPE65 (rpe65a bij zebravissen) is een marker van volwassen RPE7 en bij teleostvissen worden continu retinale en RPE-cellen gegenereerd uit de ciliaire marginale zone (CMZ), een stamcelniche aan de distale punt van het netvlies, grenzend aan de lens35. Dus, in de rpe65a:nfsB-eGFP transgene lijn, de meer onrijpe RPE bestaat aan de periferie en lijkt eGFP- (ongeveer een derde van het totale RPE-weefsel), terwijl de volwassen, centrale tweederde van de RPE eGFP uitdrukt (Figuur 1B; witte pijlpunten). Het transgen was ook zichtbaar in de pijnappelklier (figuur 1A; gele pijlpunt), die werd verwacht omdat rpe65a pijnappelklierexpressie vertoont bij zebravissen36. Relatief zwakke of eGFP-larven werden uit 6-putplaten getrokken en op 5 dpf geëuthanaseerd. Precies 24 uur na de behandeling met DMSO of IWR-1 werden 5 dpf-larven behandeld met 10 mM MTZ om de RPE af te breken (stappen 3.1, 3.3 en 5.4). MTZ werd na precies 24 uur (d.w.z. op 6 dpf/1 dpi) weggespoeld om RPE-regeneratie mogelijk te maken.

Larven werden dagelijks waargenomen op een stereomicroscoop met behulp van doorgelaten lichtverlichting van 6 dpf / 1 dpi tot het moment van euthanasie op 9 dpf / 4 dpi. Het succes van genetische ablatie werd in vivo bevestigd op 2 dpi door de afwezigheid van pigment in de centrale tweederde van het oog bij MTZ+-larven (figuur 2B; rode pijlpunten) in vergelijking met 7 dpf MTZ-controlebroers en -zussen (figuur 2A) (stap 4.2). Zoals verwacht, leek het gebied zonder pigment op 2 dpi analoog aan het gebied van rpe65a:nfsB-eGFP transgene expressie waargenomen op 5 dpf (figuur 1B). De beoordeling werd uitgevoerd op 2 dpi en niet eerder omdat RPE repigmentatie onderging na verwijdering van PTU en afhankelijk van het tijdstip van observatie in vivo, kan een duidelijk verschil tussen de geableerde centrale RPE en gespaarde (niet-gebleerde) perifere RPE moeilijk te onderscheiden zijn als de laatste niet volledig is gerepigmenteerd. Ondanks de mogelijkheid van macroscopische ambiguïteit, werd eerder aangetoond dat RPE-ablatie bij 1 dpi gemakkelijk zichtbaar was in gesegmenteerd weefsel, wat een verlies van centrale RPE en buitenste nucleaire laag (ONL; d.w.z. fotoreceptor) weefselintegriteit onthulde, samen met bewijs van celdood (pyknotische kernen) (figuur 5)3. Tegen weefselverlies in, werd vastgesteld dat robuuste proliferatie een belangrijke drijfveer was tijdens weefselregeneratie in de rpe65a:nfsB-eGFP zebravis model3. Zowel de vroege apoptotische respons, waarbij RPE-ablatie leidt tot degeneratie van aangrenzende weefsels (bijv. Fotoreceptoren en het membraan van Bruch; Figuur 6A-C), en de perifere naar centrale proliferatieve respons die volgt, die heterogene regeneratie "zones" oplevert die naar binnen bewegen in de verwondingsplaats (figuur 6D-F), zijn eerder uitgebreid gekarakteriseerd en besproken3.

Weefselvoorbereiding, confocale beeldacquisitie en beeldvoorbewerking voor geautomatiseerde kwantificering op basis van RPE-pigmentatie met behulp van RpEGEN
Op 9 dpf/4 dpi werden met DMSO en IWR-1 behandelde larven geëuthanaseerd door een overdosis tricaïne en gefixeerd in 4% PFA gedurende 3 uur bij kamertemperatuur (stap 5.6). Vier larven uit elke onafhankelijke oudergroep werden willekeurig gekozen voor latere weefselverwerking (N = 3; n = 12 larven per behandeling). Cryoprotectie, cryosectie (bij 12 μm dikte), nucleaire counterstaining met DAPI en coverslip montage werden uitgevoerd zoals vermeld in stap 5.7 5,31. Een centraal gedeelte, met zichtbare oogzenuw, van elke larve werd afgebeeld op een confocale laserscanmicroscoop met behulp van een 40x olie-onderdompelingsobjectief (numeriek diafragma = 1,30) om 512 x 512-pixel z-stack beelden te verkrijgen met een 1 μm z-stap interval. Elk beeld bevatte gegevens van drie kanalen: kanaal 1 = 405 nm excitatie voor DAPI, kanaal 2 = 488 nm excitatie voor eGFP, kanaal 3 = doorgelaten licht voor brightfield. Omdat de pixelintensiteit werd gekwantificeerd in brightfield-afbeeldingen, werden de instellingen voor de doorgelaten lichtlampspanning constant gehouden en werden alle gegevens die werden verzameld voor statistische vergelijkingen op dezelfde dag in beeld gebracht.

Confocale microscoop z-stack beelden werden voorbewerkt voor geautomatiseerde kwantificering zoals beschreven in stap 6, met behulp van FIJI. Afbeeldingen werden uitgesloten van voorbewerking en kwantificering als het weefsel was aangetast op een manier die het genereren van ROI moeilijk zou maken (bijvoorbeeld van scheuren (Figuur 7A; magenta pijlpunten) of landmark obstructie (Figuur 7B; magenta ovals)) of scheve ROI-intensiteitsmetingen (bijvoorbeeld door vouwing (Figuur 7C; magenta ovalen)). Ondanks het weglaten van enkele larven met deze uitsluitingscriteria, vertegenwoordigen alle datasets hierin N = 3 met het volgende aantal biologische replicaties (larven): n = 11, DMSO MTZ-; n = 10, IWR-1 MTZ-; n = 11, DMSO MTZ+; n = 12, IWR-1 MTZ+. Met behulp van het DAPI-kanaal werden RPE ROIs geïnitieerd door eerst het punt te identificeren waarop de dorsale apicale kant van de RPE (retina-facing) direct naast de dorsale punt van de OLM (Figuur 3B',D'; blauwe pijlpunten) (stap 6.2.2). Omdat distale RPE-extensie tussen secties kan variëren, werd de OLM gebruikt als een anatomisch oriëntatiepunt om RPE ROI-eindpunten te standaardiseren en hoekafstandsmetingen in MATLAB te normaliseren (waarbij 0 ° = dorsaal ROI-eindpunt en 180 ° = ventraal ROI-eindpunt). Bij het uitvoeren van RPE-ablaties met farmacologische manipulatie of in een gemuteerde achtergrond, moet een anatomisch oriëntatiepunt worden geïdentificeerd en gevalideerd voorafgaand aan de voorbewerking en kwantificering. Hier was de OLM zichtbaar in alle larven gekwantificeerd en werd niet aangetast door scheuren (zoals in Figuur 7B) of behandeling met DMSO of IWR-1. Na identificatie van het dorsale startpunt werden ROIs gegenereerd langs de apicale kant van de RPE (dorsaal-naar-ventraal) totdat het punt naast de punt van het ventrale OLM werd bereikt (Figuur 3B",D"; blauwe pijlpunten). Vervolgens werd een ventraal ROI-eindpunt gemaakt tussen de apicale en basale (vaatvliesgezijden) zijden van de RPE zoals besproken in stap 6.2.3 (Figuur 3B",D"; magenta lijn). De ROI werd voortgezet, waarbij de basale kant van de RPE (ventraal-naar-dorsaal) werd gevolgd totdat de basale kant naast het startpunt bij het dorsale OLM werd bereikt. De ROI werd vervolgens omsloten door een puntig dorsaal uiteinde te maken (Figuur 3B',D'; magenta lijn) zoals ventraal gedaan. Van genetische ablatie is aangetoond dat het resulteert in een verlies van centrale eGFP-expressie die wordt teruggewonnen naarmate de regeneratie vordert (samengevat in Figuur 6)3; dus, afhankelijk van de mate van regeneratie en de intensiteit van eGFP op het moment van interesse, kan het eGFP-kanaal alleen nuttig zijn voor het genereren van ROI in de MTZ- groep. Daarom, terwijl confocale acquisities ook eGFP-kanaalafbeeldingen bevatten, werd de ROI-generatie voltooid met behulp van de DAPI- en brightfield-kanalen zoals vermeld in stap 6.2.3. RPE ROI-generatie was eenvoudig in DMSO- en IWR-1-behandelde MTZ- larvale groepen en omvattende gebieden met zichtbaar gepigmenteerde apicale microvilli (Figuur 3B; rode pijlpunt) samen met de prominent gepigmenteerde cellichamen. Dezelfde parameters werden toegepast op MTZ+ larvale groepen (Figuur 3D; rode pijlpunt); vanwege resterend beschadigd weefsel op de verwondingsplaats waren apicale microvilli en pigmentatiegrenzen in sommige gevallen echter moeilijk af te bakenen in het brightfield-kanaal alleen. In deze gebieden werd het DAPI-kanaal ook gebruikt om cellulair puin binnen de RPE-verwondingsplaats te identificeren, dat was opgenomen in de ROI (Figuur 3C,D; voorbeelden van letselplaatsgelokaliseerd cellulair puin worden aangegeven met cyaan pijlpunten). Immunostaining met markers van onrijpe/volwassen RPE (bijv. ZPR2; Figuur 6D,E)37 en/of fotoreceptoren (bijv. ZPR1)37,38 kan ook worden gebruikt om het schetsen van RPE ROIs in geableerde larven te vergemakkelijken.

Eerder vertoonden geableerde larven behandeld met IWR-1 van 4 dpf tot 4 dpi een significante verslechtering van de RPE-regeneratie in vergelijking met met DMSO behandelde controles van broers en zussen (figuur 8C)3. Dit werd gerapporteerd als het percentage van centraal pigmentherstel, waarvoor aanzienlijke eerdere ervaring met het model en handmatige metingen van hoekafstand nodig was om regeneratiegrenzen aan te wijzen (figuur 8B; zwarte pijlpunten). RpEGEN is gemaakt om de kwantificering van RPE-regeneratie te automatiseren en intrinsieke vooroordelen te verminderen. Niet alleen dat, RpEGEN maakte ook het genereren van zeer robuuste datasets mogelijk; zo werden eerder 10 datapunten gegenereerd uit handmatige kwantificering van n = 10 dmso-behandelde MTZ+ -larven (figuur 8C; % pigmentterugwinning per sectiemetingen)3, terwijl 174.801 datapunten werden gegenereerd uit n = 11 met DMSO behandelde MTZ+ -larven/ROIs hier met behulp van RpEGEN (figuur 9C; pixelintensiteitsmetingen).

RpEGEN is ontwikkeld om regionale veranderingen in pigmentatie over het geheel van de RPE stapsgewijs te beoordelen door een geskeletiseerde middellijn (1 pixelbreedte) af te leiden van de oorspronkelijke ROI gegenereerd met FIJI (Figuur 4A, B). Om alle pixels in de ROI op te nemen voor analyse (d.w.z. niet alleen de middellijnpixels), werd een Euclidische afstandstransformatie uitgevoerd op elke pixel vanaf de middellijn om een kaart te maken van de dichtstbijzijnde middellijnindex voor elke pixel in het ROI-masker. Met deze kaart van indices kon elke pixel buiten de middellijn worden toegeschreven aan een enkele middellijnpixel, waardoor een uitgebreide dataset over de hele RPE voor elke larve ontstond (figuur 4E). De dorsale tot ventrale lengte van de RPE werd weergegeven door hoekafstand (figuur 4G; 0-180°) in tegenstelling tot genormaliseerde pixelafstand (figuur 4F; 0-1 willekeurige eenheden), omdat dit intuïtiever was op basis van eerdere metingen van RPE-regeneratie 3,4,5 en het feit dat de hoekafstand niet varieert met morfologische verschillen. Mediane intensiteiten afgeleid van 5-graden bins waren de metriek die werd gekozen om grootschalige trends te markeren en hoogfrequente variabiliteit waargenomen in de 1-graden binned-gegevens te minimaliseren (tabel 1, figuur 10A). Permutatiesimulatie werd gekozen om de nulhypothese te testen om te zien of de medianen van de twee behandelingsgroepen (hier DMSO MTZ + en IWR-1 MTZ + (beide 4 dpi), figuur 10B) vergelijkbaar zijn39. Deze resampling-techniek mist strikte aannames over de verdeling van de gegevens en kan worden gebruikt op een reeks teststatistieken (bijv. Gemiddelde, mediaan, enz.) om robuuste schattingen van de p-waarde te genereren. Een aantal van deze parameters (bijv. bingrootte van onbewerkte en mediane gegevens, permutatiesimulatieherhalingen, enz.) kan worden aangepast en aangepast aan de behoeften van de gebruiker. Voor de laatste werden 20.000 herhalingen gekozen om een statistisch robuuste vergelijking te genereren, maar er moet voor worden gezorgd dat rekenefficiëntie in evenwicht wordt gebracht met statistische robuustheid, omdat te weinig herhalingen onjuiste schattingen van de p-waarde kunnen produceren. Het wordt aanbevolen om meerdere herhalingswaarden uit te voeren (10.000, 20.000, enz.) om ervoor te zorgen dat de p-waardeverdeling en -waarden relatief stabiel zijn voordat met interpretaties wordt begonnen. Toenemende permutatieherhalingen zullen de statistische kracht vergroten (maar zullen ook langer duren om te draaien), wat gunstig kan zijn voor sommige datasets.

Confocale beeldgegevenssets werden gekwantificeerd met behulp van RpEGEN zoals beschreven in stap 7. De geannoteerde RpEGEN en ondersteuningsscripts zijn beschikbaar op GitHub (https://github.com/burchfisher/RpEGEN), samen met de 8-bits TIF en bijbehorende ROI-bestanden voor geïnteresseerde gebruikers om te testen. Heatmaps met ruwe gegevens van MTZ- larvale ROI's toonden een algemene verdeling van donkere pixelintensiteiten (waarbij 0 = zwart en 255 = wit, 8-bits kleurenschaal) de dorsale (0°) tot ventrale (180°) lengte van de RPE overspande, ongeacht de behandeling met 0,06% v/v DMSO of 15 μM IWR-1 (Figuur 9A,B). Het plotten van mediane pixelintensiteiten vergemakkelijkte visualisatie tussen alle groepen en toonde overeenkomsten tussen de MTZ-groepen over de RPE (figuur 10A; zwarte en grijze lijnen). Deze gegevens ondersteunden de aanwezigheid van een intacte gepigmenteerde RPE-monolaag (figuur 9E, F) en leverden baseline mediane pixelintensiteitswaarden (d.w.z. minder dan 150) voor niet-geobleerde RPE (figuur 10A; zwarte en grijze lijnen). Ter vergelijking: ruwe (figuur 9C,D) en mediane (figuur 10A; blauwe en rode lijnen) gegevens van MTZ+ larvale ROIs toonden een algemene verdeling van lichtere pixelintensiteiten in de centrale RPE, opnieuw, ongeacht de behandelingstoestand. Met DMSO behandelde larven vertoonden een gecentraliseerde verdeling van lichtpixels bij ongeveer 100° (± 15°) (figuur 9C; oranjerode bakken). Dit kwam overeen met een zichtbare afwezigheid van pigmentatie in de centrale RPE-verwondingsplaats in/rond de oogzenuw (figuur 9G; blauwe pijlpunten). Ablated IWR-1-behandelde larven vertoonden ook een gecentraliseerde verdeling van lichtpixels die zowel dorsaal (tot ongeveer 50 °) als ventraal (met ongeveer 5 °) werden uitgebreid in vergelijking met MTZ + DMSO-behandelde broers en zussen (figuur 9D; oranjerode bakken). De aanwezigheid van een uitgebreide verwondingsplaats was duidelijk zichtbaar in gesneden weefsel (figuur 9H; blauwe pijlpunten). Met uitzondering van twee bakken van 1 graad was het waargenomen verschil tussen de MTZ+-groepen statistisch significant in de centrale RPE (figuur 10B; lichtblauw gearceerd gebied tussen ~40-140°; p-waarde ≤ 0,05), wat wijst op significant minder centrale RPE-pigmentatie in MTZ+ IWR-1-behandelde larven in vergelijking met MTZ+ DMSO-behandelde broers en zussen. Interpretatie van deze ruwe (figuur 9C,D) en mediane (figuur 10A) gegevens met statistische vergelijking (figuur 10B) met behulp van RpEGEN werd niet alleen gevalideerd door gesegmenteerd weefsel te observeren (figuur 9G,H), maar ondersteunde ook eerdere bevindingen van handmatige kwantificering (figuur 8)3.

Figure 1
Figuur 1: rpe65a:nfsB-eGFP transgene expressie op 5 dagen na de bevruchting. (A-C) Wholemount beelden van een met PTU behandelde larve van 5 dpf met zwakke transgene expressie in de pijnappelklier (A; gele pijlpunt) en heldere transgene expressie in de RPE (B,C) op het moment van screening op genetische ablatie. (B) Transgene expressie is zichtbaar gelokaliseerd in de centrale tweederde van de RPE, en witte pijlpunten markeren de grens tussen perifere (onvolwassen) en centrale (volwassen) RPE. Groen = eGFP. Anterior is op. Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Verificatie van succesvolle genetische ablatie van de RPE in vivo. Wholemount beelden van (A) drie niet-geobleerde (MTZ-) 7 dpf-larven die RPE-pigmentatie door het hele oog vertonen en (B) drie ablated (MTZ+) 2 dpi larven die een ablatiezone vertonen waar er een afwezigheid van pigment is in de centrale tweederde van de RPE (rode pijlpunten). Anterior is op. Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: RPE-interessegebieden (ROI's) voor geautomatiseerde kwantificering met behulp van RpEGEN. Transversale cryosecties van (A,B) een niet-aangegeven (MTZ-) 9 dpf larve en (C,D) een ablated (MTZ+) 4 dpi larve met de RPE ROIs gemarkeerd in magenta. (B,D) Rode pijlpunten markeren gebieden waar zichtbaar gepigmenteerde apicale microvilli werden opgenomen in de ROI. (C,D) Cyaan pijlpunten wijzen naar voorbeeldgebieden van letselplaatsgelokaliseerd DAPI + -puin, dat werd gebruikt om RPE-celresten in de ROI op te nemen. (B',B",D',D") Digitale zooms van zowel de dorsale als de ventrale ROI-regio's (zwarte stippelvakken in B en D) tonen voorgestelde ROI-startpunten (blauwe pijlpunten) en de puntige ROI-uiteinden die cruciaal zijn voor eindpuntdetectie in MATLAB. Brightfield-afbeeldingen worden ook weergegeven in figuur 9E, G. Wit/grijs = kernen. Dorsal is op en distal is links. (A-D) Schaalbalken = 40 μm. (B',B",D',D") Schaalbalken = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: RpEGEN-verwerkingsworkflow. (A) Voorbeeld van een goed georiënteerde 8-bits brightfield-afbeelding en fiji-gegenereerde ROI (rood) geïmporteerd in MATLAB. Dorsal is op en distal is links. Kleurenbalk vertegenwoordigt 8-bits grijswaardenintensiteit waarbij 0 = zwart en 255 = wit. (B) Initiële binaire skeletvorming (wit) van het ROI-masker (rood) met de aanwezigheid van foutieve sporen en de afbakening van de begin- en eindpunten voor geodetische pixelafstandsafbakening zoals weergegeven in (C). De kleurenbalk in (C) staat voor de euclidische pixelafstand. (D) Sporen worden verwijderd met behulp van een vereenvoudigde goedkoopste route van de eindpixel terug naar de startpixel, wat resulteert in een continue middellijn zonder sporen (rood). (E) Dichtstbijzijnde lineaire middellijnindices op basis van een afstandstransformatie tussen alle pixels in het ROI-masker en de middellijnpixels (wit). Met deze indexwaarden kan elke afbeeldingspixel binnen het ROI-masker worden toegewezen aan de dichtstbijzijnde middellijnpixel voor analyse. De kleurenbalk vertegenwoordigt de lineaire pixelindexwaarden van de middellijn. (F) Een voorbeeld van de genormaliseerde pixelafstand langs de middellijn, waarbij 0 (blauwe, distale meest dorsale pixel) de beginpixel is en 1 (rode, distale ventrale pixel) de eindpixel. (G) Vergelijkbaar met (F), maar met behulp van de hoekafstand, waarbij 0 graden (blauw) de beginpixel is en 180 graden (rood) de eindpixel. (H) Voorbeeld van de mediane pixelintensiteitswaarden die voor elke middellijnpixel zijn berekend. De kleurenbalk vertegenwoordigt de mediane grijswaardenintensiteitswaarde van alle ROI-pixels die bijdragen aan elke gegeven middellijnpixel. Deze figuur toont beelden uit een testdataset en geen larven uit de 0,06% v/v DMSO of 15 μM IWR-1 behandelgroepen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Bewijs van RPE-ablatie en fotoreceptordegeneratie. (A) Transversale cryosecties van een niet-gebleerde larve van 6 dpf. (A,A') Na blootstelling aan PTU is transgenexpressie beperkt tot volwassen RPE-cellen, waarbij de helderste expressie beperkt is tot de centrale tweederde van de RPE. Pijlpunten geven apicale microvilli aan. (A") Differentiële interferentiecontrast (DIC) -beelden onthullen normale buitenste nucleaire laag (ONL; d.w.z. fotoreceptor) architectuur. (B,B') Transversale cryosecties van een larve van 1 dpi onthullen een significante verstoring van de morfologie van eGFP+ cellen en desorganisatie bij ONL-laminatie. Pijlen duiden op gelamineerde en pyknotische kernen. (B") DIC-beelden onthullen verder de duidelijke verstoring van de ONL-architectuur. Groen = eGFP, blauw = kernen, geel = ONL. Dorsal is op en distal is links. Schaalbalk in (A) vertegenwoordigt 40 μm en kan worden toegepast op (B). Schaalbalk in (A') vertegenwoordigt 40 μm en kan worden toegepast op (A",B',B"). Deze figuur en figuurlegendetekst zijn aangepast van Hanovice et al. 2019 (Figuur 1)3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Model van RPE-regeneratie bij larvale zebravissen. (A) nfsB-eGFP wordt uitgedrukt in volwassen RPE in de centrale tweederde van het oog. (B) Toepassing van MTZ leidt tot apoptose (TUNEL, rood) van RPE en fotoreceptoren. (C) RPE-ablatie leidt tot degeneratie van fotoreceptoren en het membraan van Bruch (stippellijn). (D) Niet-aangegeven RPE in de periferie begint zich te vermenigvuldigen en zich uit te breiden naar de plaats van het letsel (blauw). (E) Aangezien geregenereerde eGFP+ RPE in de periferie verschijnt, kan de RPE worden onderverdeeld in vier zones: perifere RPE (pRPE), gedifferentieerde RPE (dRPE), overgangszone (TZ) en verwondingsplaats (IS). (E, inzet) Geregenereerd gedifferentieerd RPE (groen) verschijnt in de periferie proximaal van de niet-aangegeven perifere RPE en bevat proliferatieve cellen grenzend aan de overgangszone. De overgangszone bestaat uit nog steeds differentiërende RPE-cellen (ZPR2, rood) en proliferatieve cellen (blauw). De verwondingsplaats bestaat uit ongepigmenteerde proliferatieve cellen die geen RPE-differentiatiemarkers tot expressie brengen. (F) Regeneratie van een functionele RPE-laag en het membraan van Bruch is voltooid met 14 dpi. Deze figuur en figuurlegendetekst zijn aangepast van Hanovice et al. 2019 (Figuur 14)3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Gecompromitteerde weefselsecties uitgesloten van beeldanalyse. (A-C) Transversale cryosecties van larven uit de 0,06% v/v DMSO en 15 μM IWR-1 datasets die voldeden aan de uitsluitingscriteria. Eén larve vertoont dorsaal RPE-weefselscheuren (A; magenta pijlpunten) en twee andere larven vertonen weefselvouwing die ofwel een anatomisch oriëntatiepunt (dorsale OLM) in het DAPI-kanaal (B; magenta gestippelde ovalen) belemmert of RPE-intensiteitsmetingen van het brightfield-kanaal kan scheeftrekken (C; magenta gestippelde ovalen). Wit/grijs = kernen. Dorsal is op en distal is links. Schaalbalken = 40 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: Farmacologische remming met IWR-1 schaadt de RPE-regeneratie. Transversale cryosecties van geableerde (MTZ+) 4 dpi larven uit (A) 0,06% v/v DMSO en (B) 15 μM IWR-1 behandelingsgroepen. Brightfield-beelden (A,B) en kwantificering van procent RPE-herstel/sectie (C) tonen een significante vertraging in het herstel van een gepigmenteerde monolaag in met IWR-1 behandelde larven (Student's ongepaarde t-test, *** p < 0,0001). (B) Zwarte pijlpunten geven de meest centrale rand van de regenererende RPE aan. Dorsal is op en distal is links. Schaalbalk in (B) vertegenwoordigt 40 μm en kan worden toegepast op (A). Deze figuur en figuurlegende tekst zijn aangepast van Hanovice et al. 2019 (figuur 13)3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 9
Figuur 9: Ruwe gegevensuitvoer van geautomatiseerde kwantificering van RPE-regeneratie in RpEGEN. (A-D) Heatmaps met brightfield pixelintensiteitsverdelingen gecompileerd uit het hele RPE ROI-gebied, van dorsaal (x-assen; hoekafstand = 0°) tot ventraal (x-assen; hoekafstand = 180°), voor alle larven in elke dataset: (A) n = 11, DMSO MTZ-; (B) n = 10, IWR-1 MTZ-; (C) n = 11, DMSO MTZ+; (D) n = 12, IWR-1 MTZ+ (van drie onafhankelijke oudergroepen, N = 3). (A) geeft bijvoorbeeld gegevens weer van 177.460 pixels over 11 ROI's. Op de y-assen wordt de pixelintensiteit weergegeven op basis van een 8-bits kleurenschaal waarbij 0 = zwart en 255 = wit. Onbewerkte gegevens worden weergegeven in 5-graden (x-as) door 5-8-bits intensiteitswaarde (y-as) bakken waarbij rood = maximaal aantal prullenbakken en donkerblauw = minimaal aantal bakken. (E-H) Transversale cryosecties van representatieve (E,F) niet-gebleerde (MTZ-) 9 dpflarven en (G,H) ablated (MTZ+) 4 dpi larve uit 0,06% v/v DMSO en 15 μM IWR-1 behandelgroepen. RPE ROIs zijn gemarkeerd in magenta en hoekafstandsextremen worden aangegeven (0° = dorsaal, 180° = ventraal). In grote lijnen tonen deze gegevens de verdeling van donkere pixels (intensiteitswaarden tussen 0-150) in (A, B, E, F) niet-aangegeven ROI's in vergelijking met (C, D, G, H) geableerde ROI's, ongeacht de behandeling. Gegevens van geableerde ROI's tonen (C,G) gecentraliseerde (100° ± 15°) verdeling van lichtere pixels (intensiteitswaarden tussen 150-250) in de DMSO-behandelingsgroep die (D,H) dorsaal (tot ~50°) en licht ventraal (met ~5°) uitzet bij met IWR-1 behandelde larven. (G,H) Deze centrale ablatiezones zonder pigment worden gemarkeerd door blauwe pijlpunten. Zwarte pijlen geven de locatie van de oogzenuw aan. Beelden van met DMSO behandelde larven zijn ook weergegeven in figuur 3. Schaalbalken = 40 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 10
Figuur 10: Groepsresultaten en statistische vergelijking afgeleid van geautomatiseerde kwantificering van RPE-regeneratie in RpEGEN. (A) 5-graden binned mediaanwaarden en 95% betrouwbaarheidsenveloppen afgeleid van de ruwe gegevens voor elke groep. De plot vertoont overeenkomsten tussen de MTZ-groepen (zwarte en grijze lijnen) over de dorsale (0°) tot ventrale (180°) lengte van de RPE met opmerkelijke verschillen tussen en tussen de MTZ+ groepen (blauwe en rode lijnen) in de centrale RPE (lichtblauw gearceerd gebied tussen ~40-140°). In het bijzonder lijkt de mediane pixelintensiteit lichter (0 = zwart en 255 = wit) in de IWR-1 MTZ + 4 dpi in vergelijking met elke andere behandelingsgroep, wat overeenkomt met verminderde centrale RPE-pigmentatie. (B) Een statistische vergelijking van de mediaanwaarden afgeleid van 1-graden bakken over de dorsale (0°) tot ventrale (180°) lengte van de RPE voor DMSO MTZ+ 4 dpi en IWR-1 MTZ+ 4 dpi versterkt de waarneming in (A). p-waarden werden berekend met behulp van een permutatiesimulatie met 20.000 herhalingen en een tweezijdige test voor elke 1-gradenbak. Onder de nulhypothese dat de twee groepen vergelijkbare mediaanwaarden hebben voor elke overeenkomstige 1-graden bin, duidt een p-waarde ≤ 0,05 op een statistisch significant verschil tussen de groepsmedianen (onderbroken zwarte lijn = 95% betrouwbaarheidsinterval (CI)). De aanwezigheid van p-waarden ≤ 0,05 over de centrale RPE (lichtblauw gearceerd gebied tussen ~ 40-140 °) duidt op aanzienlijk minder pigmentatie in geableerde (MTZ +) IWR-1-behandelde larven in vergelijking met ablated (MTZ +) DMSO-behandelde broertjes en zusjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Naam variabele Type variabele Variabele grootte Beschrijving van variabelen
ROInaam Cel {N x 1} Namen van de verwerkte ROI-bestanden
RoIxy Cel {N x 1} ROI-hoekpunten voor elk verwerkt ROI-bestand
IMGnaam Cel {N x 1} Namen van de verwerkte TIF-afbeeldingsbestanden
IMG Cel {N x 1} 8-bits brightfield-beeldgegevens voor elke verwerkte TIF
Roibw Cel {N x 1} Logisch (0 of 1) ROI-masker met dezelfde afmetingen als IMG-afbeeldingen
Cline Cel met tabellen {N x 1} (n x 16) Middellijngegevens voor afzonderlijke afbeeldingen, waaronder x, y, afstand, hoek, index, aantal punten en statistieken
CIdx Cel {N x 1} Centerline indice-gegevens met betrekking tot ROI-maskerpunten naar het dichtstbijzijnde middellijnpunt voor het berekenen van CLine
CLineBW Cel {N x 1} Logische (0 of 1) matrix met dezelfde afmetingen als IMG-afbeeldingen die de locatie van de middellijn aangeven (=1)
RAW_data Tafel N x 3 Tabel met alle onbewerkte gegevens voor elke pixel in de ROI's voor alle verschillende IMG-afbeeldingen
BIN_1_deg_all Tafel N x 9 Tabel met 1-graads binned data en statistieken met behulp van de data uit RAW_data
BIN_5_deg_all Tafel N x 9 Tabel met 5-graden binned data en statistieken met behulp van de data uit RAW_data
BIN_10_deg_all Tafel N x 9 Tabel met 10-graden binned data en statistieken met behulp van de data uit RAW_data

Tabel 1: Beschrijving van variabelen die vanuit het script RpEGEN.m naar het MAT-bestand zijn geëxporteerd. Definities zijn als volgt: ROI(s) = regio('s) van belang; TIF = gelabeld afbeeldingsbestandsformaat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol beschrijft methodologie om de RPE genetisch te aborteren en bestudeert mechanismen van degeneratie en regeneratie bij larvale-oude zebravissen. Dit protocol is ook met succes uitgevoerd bij volwassen zebravissen3, maar met minder uitgebreide karakterisering, daarom zijn larven hier de focus. Kritische aspecten van dit deel van het protocol (stappen 1-4) omvatten: 1) het toevoegen van 1,5x PTU aan embryo's voorafgaand aan het begin van melanogenese, 2) het dechorioneren van met PTU behandelde embryo's op 2-3 dpf, 3) zorgvuldige screening op eGFP en 4) timing van waterveranderingen tijdens genetische ablatie met MTZ. PTU remt melaninesynthese21,22 en is gebruikt in dit RPE-ablatieparadigma om screening op rpe65a:nfsB-eGFP transgenexpressie te vergemakkelijken en om karakterisering van RPE degeneratieve en regeneratieve processen mogelijk te maken op basis van respectievelijk de afwezigheid en daaropvolgende terugkeer van gepigmenteerd weefsel3. Omdat PTU verdere pigmentatie zal remmen, maar niet depigmentweefsels zodra melanogenese is begonnen21, moet PTU worden toegevoegd vóór het begin van pigmentatie, die begint rond 24 hpf bij zebravis25. Hier, en in eerdere studies 4,5, is PTU toegevoegd bij ongeveer 6 hpf26 om remming te garanderen voordat de melaninesynthese begint. Hoewel PTU visualisatie van belangrijke protocolstappen mogelijk maakt, kan PTU-behandeling sommige aspecten van ontwikkeling beïnvloeden (zoals besproken in stap 2.3) en het uitkomen van embryo's belemmeren. Het laatste proces kan, indien te lang vertraagd, leiden tot morfologie- en motiliteitstekorten en de levensvatbaarheid beïnvloeden40; dus het dechorioneren (uitkomen) van embryo's, hetzij enzymatisch met pronase of handmatig met behulp van een tang op 2-3 dpf, is belangrijk voor het handhaven en standaardiseren van de gezondheid van larven voorafgaand aan genetische ablatie. Een andere belangrijke overweging om problemen met de gezondheid en levensvatbaarheid van oudere larven te voorkomen (niet gerelateerd aan PTU-behandeling), is dat larven moeten beginnen met gestandaardiseerde voedingsregimes als ze buiten een aquatisch faciliteitssysteem blijven na 9 dpf / 4 dpi voor experimenten41.

Zoals uitgelegd, drijft rpe65a transgene expressie aan in volwassen RPE in de centrale tweederde van het achterste oog. Expressie van eGFP in met PTU behandelde 5 dpf-larven is normaal gesproken gemakkelijk te detecteren en zichtbaar intens (helder), zoals weergegeven in figuur 1. Larven die eGFP vaag uitdrukken bij 5 dpf in vergelijking met broers en zussen met heldere expressie kunnen ook worden waargenomen. Variatie in expressie-intensiteitsverhoudingen (d.w.z. helder versus zwak) tussen generaties kan ook bestaan, waarbij sommige generaties meer vaag tot expressie brengende larven hebben dan andere. In ieder geval vertegenwoordigen larven met een zwakke eGFP-expressie meestal een minderheid van de dieren in elk legsel. Hoewel het onbekend is of slecht tot expressie brengende larven minder ernstige RPE-letselfenotypen vertonen, zijn ablaties uitgevoerd in het heldere eGFP + -cohort van elke koppeling en zijn relatief zwakke broers en zussen bij screening geëuthanaseerd en uitgesloten van analyse. Evenzo is uitgebreide karakterisering van de zebravis RPE-ablatie- en regeneratiefenotypen uitgevoerd in larven heterozygoot voor het rpe65a:nfsB-eGFP transgen, door rpe65a:nfsB-eGFP heterozygote volwassenen te kruisen naar wildtype volwassenen3. Het is echter onwaarschijnlijk dat niet bekend is of larven homozygoot voor rpe65a:nfsB-eGFP ernstigere ablatiefenotypen vertonen. Andere inspanningen om het ablatieprotocol te standaardiseren omvatten het toevoegen van gelijke, gemeten volumes (bijv. 30 ml per petrischaal van 10 cm) aan MTZ- en MTZ + -schotels tijdens de 24-uurs genetische ablatieperiode. Evenzo hebben larven in farmacologische behandelingsschotels gelijke, gemeten volumes ontvangen (bijv. 5 ml per 6-well) en tijdige aanvulling van verse verbindingen (bijv. Elke 24 uur). Bij het hanteren van gerechten met verschillende MTZ- en/of farmacologische samengestelde behandelingen moeten zorgvuldige maatregelen worden genomen om morsen en onbedoelde kruisbesmetting tijdens transport en waterverversing te voorkomen.

Het RPE-ablatieprotocol van de zebravis kan worden aangepast om farmacologische manipulatie op te nemen (stap 5). Dit is eerder gedaan om immuunrespons5, mTOR4 en Wnt3 signaleringsroutes te identificeren als kritieke regulatoren van RPE-regeneratie; de laatste is hier herhaalbaar gebleken en werd gebruikt om RpEGEN te valideren. Naast het verlichten van kritieke RPE-regeneratieroutes, is farmacologische manipulatie op grote schaal gebruikt voor zebravis retinale regeneratiestudies 10,42,43,44,45,46,47. Voorafgaand aan opname in het RPE-ablatieprotocol moeten farmacologische middelen rigoureus worden geëvalueerd op toxiciteit, werkzaamheid en behandelingsduur. Dit kan worden gedaan door: het uitvoeren van dosisresponsexperimenten om de toxiciteit te beoordelen48; beoordeling van de expressie van bekende doelgenen/eiwitten 4,5; en het evalueren van bekende functionele gevolgen van farmacologische manipulatie, bijvoorbeeld uitputting van leukocyten met PLX3397 behandeling 48,49,50,51. Hier werden DMSO (vehicle control) en IWR-1 24 uur voorafgaand aan genetische ablatie toegevoegd en larven werden onmiddellijk voorafgaand aan farmacologische voorbehandeling gescreend op 4 dpf. Hoewel eGFP+ larven te onderscheiden zijn van eGFP-larven op 4 dpf, kan de intensiteit van eGFP vrij zwak lijken, daarom werden larven opnieuw gescreend op eGFP-expressie op 5 dpf (representatieve resultaten). Screening op eGFP vóór 4 dpf kan moeilijk zijn omdat de expressie zo laag kan zijn dat deze niet detecteerbaar is voor het oog. Zo kan voorbehandeling met farmacologische middelen voorafgaand aan 4 dpf (d.w.z. op 2 dpf)4 worden toegevoegd aan niet-gescreende larven die op 5 dpf worden gescheiden wanneer eGFP duidelijk zichtbaar is. In elk scenario waarin larven moeten worden gemanipuleerd (bijv. tijdens screening, inbedding voor beeldvorming, enz.), moeten farmacologische behandelingsomstandigheden worden gehandhaafd en, ongeacht de screeningleeftijd, moet RPE worden geableerd met MTZ op 5 dpf.

Naast het genetische ablatieprotocol worden stapsgewijze instructies voor confocale microscoopbeeldvoorbewerking en geautomatiseerde kwantificering van RPE-regeneratie met behulp van RpEGEN beschreven (stappen 6-7). RpEGEN is gemaakt om RPE-regeneratiekwantificering voor gebruikers te standaardiseren en de robuustheid van de uitvoergegevensset te vergroten, terwijl intrinsieke vooroordelen die gepaard kunnen gaan met de vervelende handmatige kwantificering die eerder is uitgevoerd, worden geminimaliseerd. Kritische aspecten van dit deel van het protocol worden uitgevoerd tijdens het genereren van ROI (stap 6). Ten eerste moet het beeld/oog zich in de dorsale omhoog, distale linkeroriëntatie bevinden (bijv. Figuur 3A-D, Figuur 4) omdat RpEGEN is geoptimaliseerd voor deze directionaliteit. Het is ook van cruciaal belang dat de dorsale en ventrale terminale uiteinden van de RPE ROIs taps toelopen tot een puntige punt zoals weergegeven in figuur 3B',B",D',D" (magentalijnen). Als deze uiteinden in plaats daarvan vierkant of afgerond zijn, kan het RpEGEN-script moeite hebben met het bepalen van de begin- en eindpixels van het middellijnskelet en kan het sporen genereren aan terminale ROI-uiteinden in plaats van een gecentraliseerde lijn (figuur 4B). Sporen aan de ROI-uiteinden van de terminal kunnen leiden tot verkorting van de middellijn tijdens het ontsporen (figuur 4D) en /of problemen met hoekafstandsmetingen in de perifere RPE (figuur 4G). Identieke naamgevingssystemen voor de TIF- en ROI-bestanden die overeenkomen met elke individuele larve is ook een belangrijke stap en noodzakelijk voor het koppelen van het 8-bits TIF-bestand met de juiste ROI in RpEGEN. Niet-overeenkomende TIF- en ROI-bestandsnamen zullen ertoe leiden dat de RpEGEN-verwerkingsworkflow die wordt beschreven in de sectie Representatieve resultaten (afbeelding 4) niet kan worden gegenereerd en dat uiteindelijk RPE-regeneratiekwantificering met behulp van dit script wordt voorkomen.

Gezamenlijk biedt dit protocol instructies om de RPE in larvale zebravissen met succes af te breken, om signaalroutes te manipuleren die van belang kunnen zijn voor, tijdens of na RPE-letsel, en om RPE-regeneratie op een gestandaardiseerde manier te kwantificeren met beperkte inherente vooroordelen. In de context van beschikbare in vivo en in vitro modellen om het regeneratieve potentieel van de RPE te bestuderen, is de zebravis uniek in zijn capaciteit voor intrinsieke RPE-regeneratie14. Dit is echter een acuut model van RPE-letsel, niet chronisch zoals de RPE-degeneratieve ziekten die gericht zijn op therapeutische ontwikkeling (bijv. AMD). Hoewel dit een beperking van het model is, blijft het een uitstekend platform om de mechanismen van RPE-regeneratie te bestuderen, die grotendeels onbekend zijn en in de toekomst kunnen worden aangepast om chronisch letsel en ziekte te bestuderen. De hierin beschreven hulpmiddelen en methodologie zijn veelzijdig en kunnen ook worden toegepast op studies van cellulaire processen die betrokken zijn bij de degeneratieve respons en om het lot van RPE-aangrenzende weefsels na ablatie te bestuderen. Evenzo kan het RpEGEN-script worden aangepast aan de behoeften van de uitvoer van gebruikersgegevens; bijvoorbeeld om ruimtelijke analyses uit te voeren van andere markers dan pigment (bijv. in situ hybridisatiesondes, eiwitexpressie, enz.).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

L.L.L. is de mede-uitvinder van US Patent #9,458,428, dat een versnelde methode beschrijft om retinaal pigmentepitheel af te leiden uit menselijke pluripotente stamcellen; dit staat los van de inhoud hiervan. J.M.G. en G.B.F. hebben niets te melden.

Acknowledgments

Het hierin beschreven werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (RO1-EY29410 tot J.M.G, en NIH CORE Grant P30-EY08098 tot de afdeling Oogheelkunde); het UPMC Immune Transplant & Therapy Center (aan L.L.L. en J.M.G.); en de E. Ronald Salvitti-leerstoel in oogheelkundig onderzoek (aan J.M.G.). Aanvullende steun werd ontvangen van de Wiegand Fellowship in Ophthalmology (aan L.L.L), de Eye & Ear Foundation of Pittsburgh, en een onbeperkte subsidie van Research to Prevent Blindness, New York, NY. Auteurs willen ook Amanda Platt bedanken voor technische assistentie en Dr. Hugh Hammer en het aquatische personeel voor uitstekende ondersteuning van de dierenverzorging.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lab Material/Equipment
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI) Millipore Sigma D9542
6-well plates Fisher Scientific 07-200-83
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 05-539-13 Catalog number is for 50 mL tubes
Diamond tip scribing pen Fisher Scientific 50-254-51 Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 % Fisher Scientific BP231 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Embryo incubator (large) Fisher Scientific 3720A
Embryo incubator (mini/tabletop) Labnet I5110A
Fluorescence stereo microscope Zeiss Axio Zoom.V16 Or similar, with 488 nm excitation laser/filter
Glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-4 Manufactured by Corning, non-sterile
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo Millipore Sigma 5.04462 Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements
Methylene blue (powder) Fisher Scientific BP117-100 Also available as a premade aqeuous solution
Metronidazole (MTZ) Millipore Sigma M3761 Check instiutional chemical waste disposal requirements
N-phenylthiourea (PTU) Millipore Sigma P7629 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free Fisher Scientific AA433689M Chemical waste, proper disposal required
Petri dishes Fisher Scientific FB0875712 10 cm diameter
Phosphate buffered saline (powder packets) Millipore Sigma P3813 Used to make 10 X PBS stock
Pronase Millipore Sigma PRON-RO
Shaking incubator Benchmark H2010 Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius
Stereo microscope Leica S9i Or similar, with transmitted light illumination
Student Dumont #5 forceps Fine Science Tools 91150-20 Fine-tipped forceps for manual dechorionation
Tabletop rotator/shaker Scilogex SK-D1807-E
Transfer pipette Millipore Sigma Z135003 3.2 mL bulb draw, non-sterile
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Pentair TRS1, TRS2, TRS5 Also available from Fisher Scientific (NC0342409)
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Software Material
FIJI (Fiji is Just ImageJ) FIJI (Fiji is Just ImageJ) https://imagej.net/software/fiji/ Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats
GRAMM examples and how-tos MathWorks https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.
MATLAB MathWorks https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox
MATLAB support MathWorks https://www.mathworks.com/support.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Grierson, I., et al. repair and regeneration of the retinal pigment epithelium. Eye. 8 (2), 255-262 (1994).
  3. Hanovice, N. J., et al. Regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium after widespread genetic ablation. PLoS Genetics. 15 (1), 1007939 (2019).
  4. Lu, F., Leach, L. L., Gross, J. M. mTOR activity is essential for retinal pigment epithelium regeneration in zebrafish. bioRxiv. , (2021).
  5. Leach, L. L., Hanovice, N. J., George, S. M., Gabriel, A. E., Gross, J. M. The immune response is a critical regulator of zebrafish retinal pigment epithelium regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (21), (2021).
  6. Zenno, S., Koike, H., Tanokura, M., Saigo, K. Gene cloning, purification, and characterization of nfsb, a minor oxygen-insensitive nitroreductase from escherichia coli, similar in biochemical properties to frase I, the major flavin reductase in vibrio fischeri. The Journal of Biochemistry. 120 (4), 736-744 (1996).
  7. Hamel, C. P., et al. Molecular cloning and expression of rpe65, a novel retinal pigment epithelium-specific microsomal protein that is post-transcriptionally regulated in vitro. Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15751-15757 (1993).
  8. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: A new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
  9. White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62 (3), 232-240 (2013).
  10. White, D. T., et al. Immunomodulation-accelerated neuronal regeneration following selective rod photoreceptor cell ablation in the zebrafish retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 3719-3728 (2017).
  11. Yoshimatsu, T., et al. Presynaptic partner selection during retinal circuit reassembly varies with timing of neuronal regeneration in vivo. Nature Communications. 7, 10590 (2016).
  12. Montgomery, J. E., Parsons, M. J., Hyde, D. R. A novel model of retinal ablation demonstrates that the extent of rod cell death regulates the origin of the regenerated zebrafish rod photoreceptors. The Journal of Comparative Neurology. 518 (6), 800-814 (2010).
  13. Hagerman, G. F., et al. Rapid recovery of visual function associated with blue cone ablation in zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0166932 (2016).
  14. George, S. M., Lu, F., Rao, M., Leach, L. L., Gross, J. M. The retinal pigment epithelium: Development, injury responses, and regenerative potential in mammalian and non-mammalian systems. Progress in Retinal and Eye Research. 85, 100969 (2021).
  15. Chiba, C., et al. Visual cycle protein rpe65 persists in new retinal cells during retinal regeneration of adult newt. The Journal of Comparative Neurology. 495 (4), 391-407 (2006).
  16. Yoshii, C., Ueda, Y., Okamoto, M., Araki, M. Neural retinal regeneration in the anuran amphibian xenopus laevis post-metamorphosis: Transdifferentiation of retinal pigmented epithelium regenerates the neural retina. Developmental Biology. 303 (1), 45-56 (2007).
  17. Xia, H., Krebs, M. P., Kaushal, S., Scott, E. W. Enhanced retinal pigment epithelium regeneration after injury in mrl/mpj mice. Experimental Eye Research. 93 (6), 862-872 (2011).
  18. McGill, T. J., et al. Subretinal transplantation of human central nervous system stem cells stimulates controlled proliferation of endogenous retinal pigment epithelium. Translational Vision Science and Technology. 8 (3), 43 (2019).
  19. Salero, E., et al. Adult human rpe can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
  20. Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nature Chemical Biology. 5 (2), 100-107 (2009).
  21. Whittaker, J. R. An analysis of melanogenesis in differentiating pigment cells of ascidian embryos. Developmental Biology. 14 (1), 1-39 (1966).
  22. Westerfield, M. Zebrafish Book, 5th Edition; A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregon, USA. (2007).
  23. Hammer, H. S. Water quality for zebrafish culture in The Zebrafish in Biomedical Research. , Elsevier. Amsterdam, Netherlands. 321-335 (2020).
  24. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
  25. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  26. Camp, E., Lardelli, M. Tyrosinase gene expression in zebrafish embryos. Development Genes and Evolution. 211 (3), 150-153 (2001).
  27. Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
  28. Li, Z., et al. Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size. PloS One. 7 (6), 40132 (2012).
  29. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and igf signaling. PLoS One. 6 (8), 22991 (2011).
  30. Leary, S., et al. Avma Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , American veterinary medical association. Schaumburg, Illinois, USA. (2020).
  31. Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on cryosections from embryonic and adult zebrafish eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, 4779 (2007).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Muir, D. GitHub - ReadImageJROI. , Available from: https://github.com/DylanMuir/ReadImageJROI (2021).
  34. Morel, P. Gramm: Grammar of graphics plotting in matlab. Journal of Open Source Software. 3 (23), 568 (2018).
  35. Reinhardt, R., et al. Sox2, tlx, gli3, and her9 converge on rx2 to define retinal stem cells in vivo. The EMBO Journal. 34 (11), 1572-1588 (2015).
  36. Schonthaler, H. B., et al. Evidence for rpe65-independent vision in the cone-dominated zebrafish retina. European Journal of Neuroscience. 26 (7), 1940-1949 (2007).
  37. Yazulla, S., Studholme, K. M. Neurochemical anatomy of the zebrafish retina as determined by immunocytochemistry. Journal of Neurocytology. 30 (7), 551-592 (2001).
  38. Larison, K. D., Bremiller, R. Early onset of phenotype and cell patterning in the embryonic zebrafish retina. Development. 109 (3), 567-576 (1990).
  39. Dwass, M. Modified randomization tests for nonparametric hypotheses. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (1), 181-187 (1957).
  40. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: A refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
  41. Hernandez, R. E., Galitan, L., Cameron, J., Goodwin, N., Ramakrishnan, L. Delay of initial feeding of zebrafish larvae until 8 days postfertilization has no impact on survival or growth through the juvenile stage. Zebrafish. 15 (5), 515-518 (2018).
  42. Meyers, J. R., et al. Β-catenin/wnt signaling controls progenitor fate in the developing and regenerating zebrafish retina. Neural Development. 7, 30 (2012).
  43. Tappeiner, C., et al. Inhibition of the tgfβ pathway enhances retinal regeneration in adult zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0167073 (2016).
  44. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, o-phospho-l-serine, suppresses müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Experimental Eye Research. 91 (5), 601-612 (2010).
  45. Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Ascl1a/dkk/beta-catenin signaling pathway is necessary and glycogen synthase kinase-3beta inhibition is sufficient for zebrafish retina regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (38), 15858-15863 (2011).
  46. Lemmens, K., et al. Matrix metalloproteinases as promising regulators of axonal regrowth in the injured adult zebrafish retinotectal system. The Journal of Comparative Neurology. 524 (7), 1472-1493 (2016).
  47. Elsaeidi, F., Bemben, M. A., Zhao, X. F., Goldman, D. Jak/stat signaling stimulates zebrafish optic nerve regeneration and overcomes the inhibitory actions of socs3 and sfpq. The Journal of Neuroscience. 34 (7), 2632-2644 (2014).
  48. Van Dyck, A., et al. Müller glia-myeloid cell crosstalk accelerates optic nerve regeneration in the adult zebrafish. Glia. 69 (6), 1444-1463 (2021).
  49. Conedera, F. M., Pousa, A. M. Q., Mercader, N., Tschopp, M., Enzmann, V. Retinal microglia signaling affects müller cell behavior in the zebrafish following laser injury induction. Glia. 67 (6), 1150-1166 (2019).
  50. Chen, S., Lathrop, K. L., Kuwajima, T., Gross, J. M. Retinal ganglion cell survival after severe optic nerve injury is modulated by crosstalk between jak/stat signaling and innate immune responses in the zebrafish retina. Development. 149 (8), (2022).
  51. de Preux Charles, A. S., Bise, T., Baier, F., Marro, J., Jaźwińska, A. Distinct effects of inflammation on preconditioning and regeneration of the adult zebrafish heart. Open Biology. 6 (7), 160102 (2016).

Tags

Biologie Nummer 181 zebravis retinaal pigmentepitheel nitroreductase metronidazol genetische ablatie regeneratie pigmentatie farmacologische verbindingen RpEGEN
Nitroreductase/metronidazol-gemedieerde ablatie en een MATLAB-platform (RpEGEN) voor het bestuderen van regeneratie van het retinale pigmentepitheel van de zebravis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Leach, L. L., Fisher, G. B., Gross,… More

Leach, L. L., Fisher, G. B., Gross, J. M. Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (181), e63658, doi:10.3791/63658 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter