Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Нитроредуктаза/метронидазол-опосредованная абляция и платформа MATLAB (RpEGEN) для изучения регенерации пигментного эпителия сетчатки рыбок данио

Published: March 2, 2022 doi: 10.3791/63658
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Ophthalmology, Louis J. Fox Center for Vision Restoration, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Earth Research Institute, University of California, Santa Barbara, 3Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Этот протокол описывает методологию генетической абляции пигментного эпителия сетчатки (RPE) с использованием трансгенной модели рыбок данио. Адаптация протокола для включения модуляции сигнального пути с использованием фармакологических соединений подробно описана. Была разработана и обсуждается платформа MATLAB для количественной оценки регенерации RPE на основе пигментации.

Abstract

Пигментный эпителий сетчатки (RPE) находится в задней части глаза и выполняет функции, необходимые для поддержания здоровья и целостности соседних тканей сетчатки и сосудов. В настоящее время ограниченная репаративная способность RPE млекопитающих, которая ограничена небольшими травмами, препятствует прогрессу в понимании регенеративных процессов RPE in vivo . Здесь представлена подробная методология, облегчающая изучение восстановления RPE in vivo с использованием рыбки данио, модели позвоночных, способной к надежной регенерации тканей. Этот протокол описывает трансгенную нитроредуктазу/метронидазол (NTR/MTZ)-опосредованную парадигму повреждения (rpe65a:nfsB-eGFP), которая приводит к абляции центральных двух третей RPE после 24-часового лечения MTZ с последующим восстановлением тканей. Основное внимание уделяется абляции RPE у личинок рыбок данио, а также изложены методы тестирования влияния фармакологических соединений на регенерацию RPE. Также обсуждается генерация и валидация RpEGEN, скрипта MATLAB, созданного для автоматизации количественной оценки регенерации RPE на основе пигментации. Помимо активных механизмов восстановления RPE, этот протокол может быть расширен до исследований дегенерации RPE и реакций на травмы, а также влияния повреждения RPE на соседние ткани сетчатки и сосудов, среди других клеточных и молекулярных процессов. Эта система рыбок данио имеет значительные перспективы в выявлении генов, сетей и процессов, которые управляют регенерацией RPE и механизмами, связанными с болезнью RPE, с долгосрочной целью применения этих знаний к системам млекопитающих и, в конечном счете, к терапевтическому развитию.

Introduction

Методология, описанная в настоящем описании, детализирует протокол генетической абляции пигментного эпителия сетчатки (RPE) с использованием личинок рыбок данио. RPE простирается над задней частью глаза и находится между стратифицированными слоями нервной сетчатки и слоем сосудистой системы, составляющим сосудистую оболочку. Трофическая поддержка, поглощение фототоксического света и поддержание белков зрительного цикла являются лишь некоторыми из критических функций, выполняемых RPE, которые необходимы для поддержания здоровья и целостности этих смежных тканей1. Повреждения РПЭ млекопитающих поддаются исправлению, когда поражения небольшие2; однако ущерб, нанесенный более крупными травмами или прогрессирующими дегенеративными заболеваниями, является необратимым. У людей дегенеративные заболевания RPE (например, возрастная макулярная дегенерация (ВМД) и болезнь Штаргардта) приводят к постоянной потере зрения и, при небольшом количестве доступных вариантов лечения, снижению качества жизни пациента. Ограниченная способность RPE млекопитающих к самовосстановлению создала пробел в знаниях в области регенеративных процессов RPE. Учитывая надежную регенеративную способность рыбок данио во многих различных типах тканей, этот протокол был разработан для создания системы позвоночных in vivo для облегчения исследований внутренне регенерирующего RPE и выявления механизмов, которые управляют этим ответом. Используя парадигму абляции, описанную здесь, канонический сигнальный путь Wnt3, путь mTOR4 и иммунные ответы5 были идентифицированы как критические медиаторы регенерации RPE, вероятно, с перекрывающимися функциями.

В этой парадигме генетической абляции Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 рыбки данио экспрессируют ген нитроредуктазы бактериального происхождения (NTR/nfsB)6, слитый с eGFP под контролем энхансерного элемента RPE, rpe65a7. Абляция достигается путем добавления пролекарства, метронидазола (MTZ), в систему воды, в которой содержатся рыбки данио. Внутриклеточная активация МТЗ нитроредуктазой приводит к сшиванию ДНК и апоптозу в NTR/nfsB-экспрессирующих клетках 8,9. Эта технология была широко использована у рыбок данио для удаления клеток сетчатки 10,11,12,13 и других тканей 8. Вместе эти элементы обеспечивают целенаправленную экспрессию (rpe65a) индуцируемой методологии абляции клеток (NTR/MTZ)8,9 и флуоресцентного маркера (eGFP) для визуализации.

Существуют и другие интересные модели in vivo, которые могут быть использованы для изучения регенеративного потенциала RPE14. Они являются широкими и включают трансдифференциацию RPE-to-retina после ретинэктомии у амфибий, при которой клетки RPE, потерянные при отрастании сетчатки, заменяются15,16; Восстановление РПЭ после травмы у «супер заживляющей» мыши MRL/MpJ17; и экзогенная стимуляция пролиферации RPE в крысиной модели спонтанной RPE и дегенерации сетчатки18, среди прочих. Также были разработаны модели in vitro, такие как взрослые стволовые клетки RPE человека (RPESCs)19. Все эти модели являются ценными инструментами, работающими над выявлением клеточных процессов, связанных с регенерацией RPE (например, пролиферация, дифференциация и т. Д.); тем не менее, рыбка данио уникальна своей способностью к внутреннему восстановлению RPE после абляции.

В то время как методология здесь написана, чтобы сосредоточиться на понимании механизмов, приводящих к регенерации RPE, линия Tg(rpe65a: nfsB-eGFP) и этот протокол генетической абляции могут быть использованы для изучения других клеточных процессов, таких как апоптоз RPE, дегенерация RPE и влияние повреждения RPE на соседние ткани сетчатки и сосудов. Протокол абляции также может быть модифицирован для включения фармакологических манипуляций, что является удобной предварительной стратегией для скрининга интересующих сигнальных путей. Например, было показано, что блокирование канонического пути Wnt с помощью ингибитора ответа Wnt-1 (IWR-1)20 ухудшает регенерацию RPE3. Это было повторено здесь, чтобы провести пользователей через фармакологический эксперимент манипуляции и служить доказательством концепции для проверки сценария MATLAB (RpEGEN), созданного для количественной оценки регенерации RPE на основе восстановления пигментации. Как и трансгенная линия и протокол абляции, скрипты RpEGEN адаптируются и могут быть использованы для количественной оценки других маркеров / клеточных процессов в RPE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все методологии, изложенные в настоящем документе, соответствуют требованиям Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Питтсбурга.

1. Подготовка перед сбором эмбрионов рыбок данио

  1. Установите инкубатор эмбрионов на 28,5°C.
  2. Готовят 25-кратный исходный раствор ингибитора меланогенеза N-фенилтиомочевины (ПТУ)21,22. Этот исходный раствор масштабируется по распространенной рецептуре22 и 1x равен 0,003% массы на объем (% мас./об.) (например, 0,003 г порошка ПТУ на 100 мл жидкого растворителя).
    1. Чтобы приготовить большой 25-кратный раствор PTU, добавьте 0,75 г порошка PTU в 1 л очищенной деионизированной воды (далее именуемой dH2O) и тщательно перемешайте при комнатной температуре (~25 °C), используя перемешивание и перемешиваемую пластину. Хранить при температуре 4°C до 3 месяцев под защитой от света.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Трудно заставить ПТУ перейти в водный раствор, и может потребоваться длительное перемешивание в течение ночи.
      ВНИМАНИЕ: ПТУ опасен, и следует соблюдать осторожность, чтобы предотвратить проглатывание, вдыхание и / или контакт с кожей или глазами. Порошок PTU и все жидкие производные PTU, описанные в настоящем описании, возможно, потребуется утилизировать как химические отходы в зависимости от государственных и институциональных правил. Подтверждение надлежащих методов удаления отходов PTU, если таковые имеются, рекомендуется перед использованием.
    2. Чтобы сделать 1,5-кратный рабочий раствор PTU (далее именуемый 1,5x PTU), добавьте 60 мл 25x PTU-раствора к 940 мл воды для содержания рыбок данио (далее именуемой системной водой). Оптимальные параметры качества воды для рыбок данио были описаны23 , и водные объекты должны иметь стандартные процедуры мониторинга воды. Храните 1,5x PTU при температуре 28,5°C в течение 1-2 недель, защищенных от света.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол обычно выполняется с использованием концентраций PTU, растворителей и параметров хранения, описанных на этапе 1.2. В качестве меры предосторожности эмбрионы / личинки должны наблюдаться каждые 1-2 дня во время пребывания в ПТУ для подтверждения эффективности и подтверждения устойчивой депигментации. Условия растворения и/или хранения должны быть оптимизированы при подозрении на снижение растворимости/эффективности ПТУ.
  3. Приготовьте готовый раствор 0,05% мас./об.метиленового синего, ингибитора роста грибов, добавив 0,05 г порошка метиленового синего в 100 мл dH2O. Тщательно перемешайте, используя перемешивание и перемешиваемую пластину. Хранить при температуре 4°C.
  4. Подготовьте пипетки для манипуляций с эмбрионами /личинками (например, перемещение эмбрионов / личинок между чашками Петри, разделение личинок во время флуоресцентного скрининга, сбор усыпленных личинок в микроцентрифужные трубки для фиксации и т. Д.), Разрезая конический конец стеклянной пипетки Пастера с помощью ручки для записи алмазного наконечника. Вытравите по окружности пипетки алмазной ручкой и осторожно потяните или защелкните конец, чтобы сделать чистый разрыв.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рот пипетки должен быть гладким и достаточно широким, чтобы легко взять эмбрион внутри хориона без стрижки. Используйте в качестве альтернативы ленточную пипетку для рисования ламп. Подготовленные пипетки также могут быть использованы для удаления жидкости во время подмены воды (а не для разлива), чтобы свести к минимуму потерю эмбриона / личинки.
  5. Приготовьте 4% раствор параформальдегида (PFA) в 1x фосфатном буферном физиологическом растворе (PBS) (например, добавьте 10 мл 16% PFA к 4 мл 10x PBS и 26 мл dH2O). Хранить при температуре 4°C в течение 4 недель, защищенных от света.
    ВНИМАНИЕ: Параформальдегид является опасным химическим веществом и должен обрабатываться в химической вытяжке и утилизироваться должным образом. Следует соблюдать осторожность и носить средства индивидуальной защиты (СИЗ), чтобы предотвратить проглатывание, вдыхание и / или контакт с кожей или глазами.

2. Сбор и поддержание эмбрионов рыбок данио до генетической абляции (0-5 дней после оплодотворения)

  1. Содержать взрослых рыбок данио, как описано ранее 3,4,5. Во второй половине дня / вечером перед сбором эмбрионов отделите взрослых рыбок данио в резервуары для размножения для нереста.
  2. На следующее утро (через 0 дней после оплодотворения (dpf)) соберите эмбрионы в чашки Петри диаметром 10 см в системной воде и удалите все нежизнеспособные или неоплодотворенные яйцеклетки, которые будут казаться непрозрачными и / или показывать неправильную цитоплазму и неудачное расщепление24.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нормальное расщепление и события стадии развития будут проявляться у здоровых эмбрионов, как описано25. Чашки Петри должны быть заполнены на три четверти (~ 30 мл для чашки диаметром 10 см) на протяжении всего протокола.
    1. Добавьте две капли 0,05% мас./об.метиленового синего в каждую чашку Петри, аккуратно перемешайте и храните эмбрионы при температуре 28,5°C в течение оставшейся части протокола.
  3. Примерно через 6 ч после оплодотворения (hpf)4,5,26 замените системную воду в чашках эмбриона Петри 1,5x PTU (рабочий раствор, сделанный на этапе 1.2.2) и восполните метиленовый синий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: PTU должен быть добавлен к эмбрионам до начала пигментации (т.е. до 24 hpf)25, так как уже пигментированные ткани не будут депигментироваться при добавлении PTU21. Следует, однако, отметить, что снижение размера глаз, глазного и черепно-лицевого дефицита и нарушение некоторых сигнальных путей (например, передачи сигналов щитовидной железы) были зарегистрированы у рыбок данио, обработанныхPTU 27,28,29. Токсичность PTU для развития, по-видимому, зависит от концентрации и сроков добавления PTU27,29. Как упоминалось выше для подтверждения эффективности ПТУ (этап 1.2), признаки токсичности ПТЕ также следует тщательно контролировать и, при подозрении, оптимизировать рабочую концентрацию и/или время добавления ПТУ.
  4. На 2-3 дпф дехорионат эмбрионов используют свежеприготовленный раствор проназы.
    1. Растворяют проназу в 1,5х ПТЕ в концентрации 2 мг/мл путем вихря.
      ВНИМАНИЕ: Проназа упакована в виде очень мелкого порошка и является раздражителем. Принимайте меры, чтобы избежать вдыхания и / или контакта с кожей, глазами и т. Д.
    2. Отделяйте вылупившиеся эмбрионы от невылупившихся эмбрионов и проназируйте только невылупившиеся эмбрионы.
    3. Замените 1,5x PTU раствором проназы 2 мг/мл, изготовленным на этапе 2.4.1, и оставьте на невылупившихся эмбрионах в течение 4-5 мин с мягким перемешиванием (например, на настольном ротаторе/шейкере или ручным закручиванием).
    4. Вылейте раствор проназы и немедленно промойте свежим 1,5x PTU. Аккуратно протритурируйте 1,5x PTU ополаскивайте эмбрионы с помощью переносной пипетки с колбой.
    5. Повторите второе промывание 1,5x PTU, чтобы выбросить весь мусор хориона, а затем пополните 1,5x PTU для обслуживания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы также могут быть дехорионированы вручную с помощью щипцов с мелким наконечником. В этом случае остатки хориона должны быть удалены и 1,5x PTU пополнены после ручной дехорионации.
  5. Следите за здоровьем эмбрионов / личинок и пополняйте 1,5x PTU каждые 1-2 дня. Эмбрионы/личинки содержатся в 1,5x PTU до абляции при 5 dpf.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важность шагов 2.3 и 2.4 более подробно рассматривается в разделе "Обсуждение".

3. Скрининг личинок рыбок данио на rpe65a:nfsB-eGFP и генетическая абляция пигментного эпителия сетчатки (5-6 дней после оплодотворения)

  1. Внесите свежий раствор метронидазола (МТЗ) 10 мМ на 5 dpf (день абляции). Этот процесс занимает 2 часа.
    1. Добавьте порошок МТЗ в системную воду без ПТУ и тщательно перемешайте путем энергичного встряхивания (например, 250 оборотов в минуту) в течение 1 ч при 37 °C.
    2. Охладите раствор МТЗ 10 мМт еще на 1 ч при комнатной температуре на настольном ротаторе/шейкере и обеспечьте полное растворение перед добавлением в чашки Петри личинок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентный скрининг и разделение личинок eGFP+ (этап 3.2) могут быть выполнены во время инкубации при температуре 37 °C и комнатной температуре.
      ВНИМАНИЕ: MTZ опасен, и следует соблюдать осторожность, чтобы предотвратить проглатывание, вдыхание и / или контакт с кожей или глазами. Порошок МТЗ и все жидкие производные, описанные в настоящем описании, возможно, потребуется утилизировать как химические отходы в зависимости от государственных и институциональных правил. Подтверждение надлежащих методов удаления отходов МТЗ, если таковые имеются, рекомендуется перед использованием.
  2. Экран личинок рыбок данио для трансгена rpe65a:nfsB-eGFP.
    1. Обезболивание личинок 0,168 г/л трикаина (MS-222) и отдельных трансгенных (eGFP+) личинок (рисунок 1) от нетрансгенных (eGFP-) личинок с помощью флуоресцентного стереомикроскопа с лазером возбуждения/фильтром 488 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Трикаин следует добавлять в 1,5-кратные растворы ПТУ и/или фармакологических соединений, поскольку личинки должны оставаться погруженными в обработку во время скрининга на eGFP. Инкубируйте личинок в трикане только на время скрининга (например, ≤10 мин для одной чашки Петри размером 10 см, содержащей 50 личинок).
    2. Немедленно отсеяли личинок, пипетировав их непосредственно в чашку Петри со свежим 1,5-кратным ПТУ без трикаина.
    3. По завершении скрининга дополнительно разделите личинок eGFP+ на две группы чашек Петри: одну группу для получения обработки MTZ (абляцию / MTZ +) и одну группу для неблаблированного (MTZ-) контроля.
  3. Абляция пигментного эпителия сетчатки.
    1. Удалите 1,5x PTU из неабляционной (MTZ-) контрольной посуды и добавьте пресную системную воду без PTU.
    2. Удалите 1,5x PTU из абляционной (MTZ+) посуды для обработки и добавьте свежеприготовленный раствор MTZ 10 мМ (шаг 3.1.).
    3. Удалите раствор МТЗ 10 мМ ровно через 24 ч (назначается через 1 день после травмы (dpi)) и добавьте пресную системную воду без ПТУ. Замените воду пресной системы без ПТУ на посуде (тарелках) МТЗ. Личинки не будут подвергаться воздействию PTU снова в течение оставшейся части протокола.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Может быть трудно пипетку или вылить все 1,5x PTU (шаги 3.3.1 и 3.3.2) или 10 мМ MTZ (шаг 3.3.3) между обменами раствора без потери личинок, поскольку животные активно плавают вокруг. В этом случае может быть добавлена промывка системной воды без ПТУ для обеспечения успешного обмена раствором.

4. Поддержание личинок постгенетической абляцией (6+ дней после оплодотворения)

  1. Проверяйте личинок и пополняйте систему воды без ПТУ ежедневно до эвтаназии (шаг 5.6) или возвращения в жилище для рыбок данио.
  2. Мониторинг успешности и степени абляции in vivo на 2 dpi (7 dpf) с помощью пропускаемой световой подсветки на стереомикроскопе (рисунок 2).

5. Включение фармакологического лечения в протокол абляции пигментного эпителия сетчатки рыбок данио

ПРИМЕЧАНИЕ: Как и ранее3, обработка 15 мкМ IWR-1 или соответствующим по объему диметилсульфоксидом (DMSO) управление транспортным средством, начиная с 4 dpf, описана здесь в качестве примера эксперимента по испытанию RpEGEN. Концентрации и сроки могут варьироваться в зависимости от различных фармакологических соединений, а рекомендации по валидации «доза-реакция», продолжительность лечения, скрининг и другие аспекты экспериментального дизайна для фармакологических исследований манипуляций рассматриваются в разделе «Обсуждение». Выполните шаги 6 и 7, если требуется анализ изображения.

  1. Собирайте и поддерживайте эмбрионы, как описано в шаге 2. Дехорионатные эмбрионы по 2 дпф.
  2. Экранирование личинок eGFP+ на 4 dpf, как описано в шаге 3.2. Вместо чашки Петри поместите личинки eGFP+ в 6-луночные пластины с плотностью n ≤ 10 личинок на 6 лунок для фармакологического лечения. Обозначьте отдельные 6-луночные пластины для личинок, которые будут неабляционными (MTZ-) и личинок, которые будут абляции (MTZ+).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сигнал eGFP виден на 4 dpf, но выглядит тусклее, чем интенсивность сигнала на 5 dpf.
  3. Предварительно обработать 4 dpf eGFP+ личинок с 15 мкМ IWR-1 или согласованным по объему DMSO контролем транспортного средства в течение ровно 24 ч до генетической абляции раствором МТЗ 10 мМТЗ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Часто для фармакологических экспериментов по лечению требуется очень мало соединения. Чтобы избежать взвешивания небольших количеств порошка IWR-1, это фармакологическое соединение приобретается уже в растворе DMSO, в концентрации 25 мМ, и аликвотируется в меньшие объемы по прибытии, чтобы избежать повторных циклов замораживания-оттаивания.
    1. Определите объем необходимых фармакологических и контрольных методов лечения и соответственно аликвотируйте 1,5x PTU в конические трубки. Рекомендуется объем 5 мл/лунка плиты из 6 скважин.
    2. Добавьте запас IWR-1 к 1,5x PTU для конечной концентрации 15 мкМ IWR-1 (например, 3 мкл 25 мМ IWR-1 на 5 мл 1,5x PTU). Добавьте соответствующий объем запаса DMSO к 1,5x PTU (например, 3 мкл ≥ 99,7% DMSO на 5 мл 1,5x PTU). Здесь это в конечном итоге приведет к конечной концентрации DMSO 0,06% объема / объема (% v / v). Хорошо перемешайте путем вихря и визуально подтвердите растворение соединений.
      ВНИМАНИЕ: DMSO, IWR-1 и другие фармакологические соединения и растворители, возможно, потребуется утилизировать как химические отходы в зависимости от государственных и институциональных правил. Подтверждение уровня опасности и надлежащих методов удаления отходов для этих соединений, если таковые имеются, рекомендуется перед использованием.
    3. Удалите 1,5x PTU из личинок eGFP+ в 6-луночных пластинах и добавьте 5 мл /лунку свежеприготовленного 0,06% v/v DMSO или 15 мкМ IWR-1 с этапа 5.3.2.
  4. На 5 dpf абляция RPE. В дополнение к 24-часовой предварительной обработке (стадия 5.3), личинки будут оставаться погруженными в фармакологическую и контрольную обработку транспортных средств в течение 24 ч генетической абляции с 10 мМТЗ и во время постабляционного восстановления, до фиксации (например, от 4-9 дПФ).
    1. Принимают раствор МТЗ 10 мМТЗ за 2 ч до выполнения генетической абляции (шаг 3.1).
    2. Определите объем фармакологических и контрольных обработок транспортных средств, необходимых как для неблатированных (MTZ-), так и для абляционных (MTZ+) 6-луночных пластин и аликвотных соответствующих объемов либо пресной системной воды без PTU (MTZ-), либо 10 мМ раствора MTZ (MTZ+) в конические трубки. Это даст четыре условия лечения: 1) 0,06% v/v DMSO, MTZ-; 2) 15 мкМ ИВР-1, МТЗ-; 3) 0,06% об/об ДМСО, МТЗ+; и 4) 15 мкМ IWR-1, MTZ+.
    3. Добавить растворы IWR-1 и DMSO в соответствующие конические трубы, как это выполнено на этапе 5.3.2. Хорошо перемешайте путем вихря и визуально подтвердите растворение соединений.
    4. Удалите 0,06% v/v DMSO и 15 мкМ IWR-1 в 1,5x PTU (этап 5.3.2) из назначенных неблэтированных (MTZ-) и абляционных (MTZ+) 6-луночных пластин и пополните их соответствующими обработками, выполненными на этапе 5.4.3.
    5. Удалите 0,06% v/v DMSO и 15 мкМ IWR-1 в 10 мМ растворе MTZ ровно через 24 ч и пополните обработкой в пресной системной воде без ПТУ. Восполняйте 0,06% v/v DMSO и 15 мкМ IWR-1 обработки в пресной системной воде без ПТУ на неабляционной (MTZ-) 6-луночной пластине (пластинах).
  5. Следуйте за поддержанием личинок после абляции, как описано в шаге 4, и ежедневно пополняйте 0,06% v/v DMSO или 15 мкМ IWR-1 в системной воде без PTU.
  6. Усыпляйте личинок на 9 dpf (4 dpi для братьев и сестер, обработанных MTZ в соответствии с возрастом), погружая животных в раствор трикаина 0,3 г / л (смертельная передозировка) в сочетании с быстрым охлаждением (например, поместите чашки Петри на лед) в течение не менее 20 мин30. Проверьте, чтобы убедиться, что личинки не реагируют на прикосновение, и зафиксируйте 4% PFA (шаг 1,5) в течение 3 ч при комнатной температуре или при 4 °C в течение ночи.
  7. Обработать постфиксационную личиночную ткань для получения изображения z-стека на конфокальном микроскопе, как описано ранее 5,31 и здесь, в разделе Репрезентативные результаты. Анализ на этапах 6 и 7 потребует, как минимум, получения ядерного маркера (например, DAPI) и изображений z-стека яркого поля.

6. Препроцессорная обработка изображений z-стека конфокальным микроскопом в FIJI (ImageJ)

  1. Импорт и форматирование изображений z-стека конфокального микроскопа с помощью FIJI32.
    1. Открывайте изображения микроскопа с помощью параметров импорта биоформатов , для которых установлено значение Просмотр стека с помощью: Гиперстек и Цветовой режим: Оттенки серого.
    2. Создайте проекцию максимальной интенсивности импортированного изображения микроскопа, выбрав Image | Стеки | Проект Z. В окне ZProjection задайте для параметров Начальный фрагмент и Стоп-фрагмент , чтобы включить все фрагменты для этого изображения. Например, задайте начальный фрагмент: 1 и стоп-фрагмент: 18 для z-стека, содержащего в общей сложности 18 фрагментов. Выберите Тип проекции: Максимальная интенсивность и нажмите OK.
    3. Преобразуйте файл проекции максимальной интенсивности в 8-битное изображение (если еще нет), выбрав Image | Тип | 8-бит.
    4. Переориентируйте изображение так, чтобы спинная сторона была вверху, а дистальная (т. е. объектив) оставалась, выбрав «Изображение | Трансформация | Отразить по горизонтали (для последней команды выберите параметр, который наилучшим образом соответствует направленности, необходимой для этого изображения). Чтобы получить многоканальное изображение, нажмите кнопку Да в стеке процессов? для переориентации всех каналов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является критическим, но не нужен, если изображение уже находится в дорсальной, дистальной левой ориентации. См. рисунки 3A-D и 4 для изображений с глазами в правильном направлении для обработки.
    5. Сохраните 8-битную проекцию максимальной интенсивности в виде TIF-файла с тегами, выбрав Файл | Сохранить как | Тифф....
  2. Создайте интересующую область RPE (ROI) с помощью FIJI.
    1. Откройте 8-разрядный TIF-образ, созданный, как описано в шаге 6.1. Запустите менеджер окупаемости инвестиций, выбрав Анализ | Инструменты | Менеджер по окупаемости инвестиций.
    2. Использование | изображений Масштабирование и переключение между каналами DAPI и Brightfield для определения точки (точек), в которой апикальная сторона RPE примыкает к кончику внешней ограничивающей мембраны (OLM) (рисунок 3B', B", D', D"; синие наконечники стрелок). Используйте этот анатомический ориентир в качестве отправной точки ROI.
    3. Создайте рентабельность инвестиций в RPE с помощью инструмента «Выделение полигонов» (на панели инструментов FIJI), используя каналы изображения DAPI и brightfield, а также функцию масштабирования (Image | Zoom) для определения апикальных и базальных границ RPE. Дорсальный и вентральный концы ROI (т. е. там, где ROI переходит с апикальной на базальную сторону RPE) в острую точку, а не притупление или округление (рисунок 3B', B", D', D"; пурпурные линии).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Создание заостренного конца окупаемости инвестиций является критическим шагом для оптимизации обнаружения конечных точек с помощью RpEGEN и рассматривается в разделе Обсуждение.
    4. Добавьте рентабельность инвестиций, нажав кнопку Добавить в менеджере ROI. Отрегулируйте рентабельность инвестиций по мере необходимости и нажмите «Обновить » в менеджере ROI.
    5. Сохраните файл окупаемости инвестиций, выбрав Дополнительно>> | Спасать... в рамках менеджера ROI. Используйте одинаковые имена для совпадающих файлов изображений ROI и TIF (например, [имя файла].tif и [имя файла].roi).
  3. Объедините 8-разрядные файлы TIF и ROI для каждого условия в одну папку. Например, папка DMSO_9dpf будет содержать все соответствующие файлы TIF и ROI для 9 dpf unablated (MTZ-) 0,06% v/v DMSO-обработанной личиночной группы.

7. Количественная оценка и визуализация регенерации RPE с помощью скриптов RpEGEN

  1. Установите и подготовьте скрипты RpEGEN.
    1. Загрузите последние скрипты RpEGEN из репозитория GitHub (https://github.com/burchfisher/RpEGEN), щелкнув Code | Скачать ZIP.
    2. Распакуйте папку и поместите ее в нужное место рабочей области (например, рабочий стол).
    3. Откройте MATLAB.
    4. Перейдите в папку RpEGEN на панели «Текущая папка » (обычно слева).
    5. Щелкните правой кнопкой мыши папку RpEGEN и выберите Добавить в путь | Выбранные папки и вложенные папки. Это добавит папку в путь MATLAB, чтобы она могла автоматически находить и запускать любые сценарии в папке.
    6. Дважды щелкните папку RpEGEN на панели «Текущая папка», чтобы отобразить все вложенные папки и M-файлы.
    7. Дважды щелкните файл RpEGEN.m , чтобы открыть его в области редактора .
    8. В разделе USER-DEFINED VARIABLES файла RpEGEN.m введите расположение каталогов для папок, содержащих файлы ROI (.roi), файлы изображений (.tif) и места, где должны быть сохранены выходные файлы. Введите имя группы для экспортируемого файла .mat (например, DMSO_9dpf, DMSO_4dpi и т. д.) и расположение канала brightfield в стеке изображений TIF (например, 3, если brightfield является третьим каналом в стеке изображений). Если файл изображения содержит только изображение яркого поля, то это должно быть равно 1.
  2. Запустите скрипт RpEGEN.m и проверьте результаты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: RpEGEN требует, чтобы инструментарий обработки изображений, инструментарий Curve Fitting Toolbox и инструментарий статистики и машинного обучения были активированы на пользовательской лицензии MATLAB для запуска. Кроме того, для импорта FIJI ROI в MATLAB требуется свободно доступный набор инструментов ReadImageJROI33 ; однако он предоставляется в папке RpEGEN вместе с другими файлами функции M, которые не требуют какой-либо активации.
    1. Запустите сценарий, нажав кнопку Выполнить в меню Редактор в верхней части MATLAB.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После запуска командное окно предоставит подробные выходные данные, указывающие на прогрессию скрипта. После сохранения файла MAT, содержащего извлеченные данные, появится трехпанельная фигура, которая будет сохранена в виде PDF в выходном каталоге для каждого запуска изображения. Это показатели контроля качества (QC), чтобы убедиться, что все работает правильно и включает: 1) изображение яркого поля, наложенное ROI (рисунок 4A); 2) ROI с осевой линией и связанным с ней угловым расстоянием (градусами) (рисунок 4G); и 3) ROI со средними значениями интенсивности осевой линии (0-255, 8-битная цветовая шкала) (рисунок 4H). Подождите, пока PDF-файлы QC не будут сохранены в выходной папке и последний рисунок исчезнет, прежде чем переходить к следующему шагу.
    2. Откройте отдельные PDF-файлы, экспортированные в выходную папку в любом средстве просмотра PDF, и убедитесь, что все ROI соответствуют ярким изображениям, что значения осевой линии являются разумными приближениями к центру ROI и что значения медианной интенсивности соответствующим образом заполнены данными (т. Е. Не все одинаковые значения по всей осевой линии).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подробное описание и структуру каждой переменной, сохраненной в файле MAT компанией RpEGEN.m, можно найти в таблице 1.
  3. Запустите сценарий RpEGEN_PermPlot.m.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скрипт RpEGEN_PermPlot.m использует выходные данные RpEGEN.m для выполнения статистических сравнений с использованием перестановочного моделирования медиан двух групп, а также предоставляет код для воспроизведения графиков в этой статье с использованием свободно доступного набора инструментов GRAMM34, который также был включен в папку RpEGEN.
    1. Дважды щелкните файл RpEGEN_PermPlot.m , чтобы открыть его в новой вкладке редактора .
    2. В разделе РАЗДЕЛ 1 - ОПРЕДЕЛЯЕМЫЕ ПОЛЬЗОВАТЕЛЕМ ПЕРЕМЕННЫЕ в файле RpEGEN_PermPlot.m введите расположение каталога выходной папки, содержащей файлы MAT из запущенного RpEGEN.m, и введите имя каждого загружаемого файла MAT (например, DMSO_4dpi.mat, IWR1_4dpi.mat).
    3. Запустите этот раздел скрипта, нажав на кнопку Выполнить раздел в меню Редактор в верхней части MATLAB.
    4. В разделе 2 введите названия двух групп для статистического сравнения в data_A и data_B переменных (это группы, из которых будут выведены медианы с помощью моделирования перестановок). В переменной bin_sz введите количество градусов, по которым необходимо интегрировать медианные значения интенсивности для наборов данных (по умолчанию — 1 градусные корзины).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Переменная reps указывает количество перестановок, используемых для построения распределения вероятностей, и может быть установлена на любое число (значение по умолчанию 20 000). В целом, большее количество повторений будет более статистически устойчивым, но увеличит время обработки.
    5. Запустите этот раздел скрипта, нажав на кнопку Выполнить раздел в меню Редактор в верхней части MATLAB. Выполнение этого раздела может занять некоторое время в зависимости от указанного количества повторений, но обеспечивает непрерывное обновление состояния в командном окне.
    6. Запустите разделы HEATMAP FIGURE и GROUP RESULTS И P-VALUES независимо друг от друга с помощью кнопки Run Section . Редактируйте переменные данных в любых разделах, закомментированных с помощью "ENTER DATA HERE". PDF-файлы этих рисунков автоматически сохраняются для каждого и могут быть легко изменены в любом векторном программном постобработке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Графики, сгенерированные в файле RpEGEN_PermPlot.m , являются специальными и, вероятно, потребуют модификации на основе конкретных данных и потребностей каждого пользователя в визуализации. Тем не менее, цифры обеспечивают прочную основу, которую можно легко индивидуализировать с помощью веб-сайтов MATLAB и GRAMM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Известно, что ингибирование канонического сигнального пути Wnt значительно ухудшает регенерацию RPE рыбок данио с использованием парадигмы генетической абляции (rpe65a: nfsB-eGFP) и методологии фармакологических манипуляций (IWR-1), описанной в протоколе3. Этот эксперимент был повторен здесь, чтобы проверить автоматизированный метод количественной оценки регенерации RPE рыбок данио на основе пигментации. Результаты, обобщенные ниже, охватывали все этапы протокола, от дня оплодотворения (0 dpf) до количественной оценки регенерации RPE с использованием RpEGEN.

Внедрение протокола абляции RPE (с фармакологическими манипуляциями) у личинок рыбок данио
Эмбрионы, собранные из трех отдельных родительских групп (N = 3), начали лечение с 1,5x PTU около 6 hpf, и отсутствие пигментации в RPE и поверхностных меланоцитах было визуально подтверждено на 1 dpf. Эмбрионы ферментативно дехорионировали на 2 dpf с использованием 2 мг/мл проназы (стадия 2.4). На 4 dpf личинок анестезировали с использованием трикаина (MS-222) и проверяли на eGFP с помощью флуоресцентного стереомикроскопа (шаги 3.2 и 5.2). Личинки eGFP+ перемещали в 6-луночные пластины (n = 10 личинок/лунку) и обрабатывали либо 0,06% v/v DMSO (управление транспортным средством), либо 15 мкМ IWR-1 (этап 5.3). Плотность личинок, о которой сообщалось здесь, первоначально была основана на приближении площади роста 1 личинки /см2 и была подтверждена тщательным мониторингом здоровья (например, развитие плавательного пузыря) с течением времени. Интенсивность eGFP казалась тусклой на 4 dpf, поэтому личинки были повторно проверены на 5 dpf для подтверждения яркой экспрессии eGFP (рисунок 1). RPE65 (rpe65a у рыбок данио) является маркером зрелого RPE7, и у телеостных рыб клетки сетчатки и RPE постоянно генерируются из цилиарной маргинальной зоны (CMZ), ниши стволовых клеток на дистальном кончике сетчатки, прилегающей к хрусталику35. Таким образом, в трансгенной линии rpe65a:nfsB-eGFP тем более незрелые RPE существуют на периферии и появляются eGFP- (примерно одна треть от общей ткани RPE), в то время как зрелые, центральные две трети RPE экспрессируют eGFP (рисунок 1B; белые наконечники стрелок). Трансген также был виден в шишковидной железе (рисунок 1A; желтый наконечник стрелы), что было ожидаемо, поскольку rpe65a показывает шишковидную экспрессию у рыбок данио36. Сравнительно тусклых или eGFP-личинок вытаскивали из 6-луночных пластин и усыпляли на 5 dpf. Ровно через 24 ч после обработки DMSO или IWR-1 5 личинок dpf обрабатывали 10 мМТЗ для абляции RPE (этапы 3.1, 3.3 и 5.4). МТЗ вымывали ровно через 24 ч (т.е. на 6 dpf/1 dpi), чтобы обеспечить регенерацию RPE.

Личинки наблюдались ежедневно на стереомикроскопе с использованием проходящего светового освещения от 6 dpf/1 dpi до момента эвтаназии на 9 dpf/4 dpi. Успешность генетической абляции была подтверждена in vivo на 2 dpi отсутствием пигмента в центральных двух третях глаза у личинок MTZ+ (Рисунок 2B; красные наконечники стрел) по сравнению с 7 dpf MTZ-контрольными братьями и сестрами (Рисунок 2A) (шаг 4.2). Как и ожидалось, область, лишенная пигмента на 2 dpi, оказалась аналогичной области трансгенной экспрессии rpe65a:nfsB-eGFP, наблюдаемой на 5 dpf (рисунок 1B). Оценку проводили на 2 dpi и не ранее, так как RPE подвергаются репигментации после удаления PTU и в зависимости от времени наблюдения in vivo, заметную разницу между абляционной центральной RPE и сохраненной (небляционной) периферийной RPE может быть трудно различить, если последняя не полностью репигировала. Несмотря на возможность макроскопической неоднозначности, ранее было показано, что абляция RPE при 1 dpi легко проявляется в разрезанной ткани, выявляя потерю целостности ткани центрального RPE и внешнего ядерного слоя (ONL; т.е. фоторецептор) наряду с доказательствами гибели клеток (пикнотические ядра) (рисунок 5)3. В противовес потере тканей было определено, что надежная пролиферация является ключевым фактором во время регенерации тканей в модели3 рыбок данио rpe65a: nfsB-eGFP. Как ранний апоптотический ответ, где абляция RPE приводит к дегенерации соседних тканей (например, фоторецепторов и мембраны Бруха; Рисунок 6A-C) и последующий пролиферативный ответ периферического центра, который дает гетерогенные «зоны» регенерации, движущиеся внутрь в место повреждения (рисунок 6D-F), были широко охарактеризованы и обсуждены ранее3.

Подготовка тканей, получение конфокальных изображений и предварительная обработка изображений для автоматизированной количественной оценки на основе пигментации RPE с использованием RpEGEN
На 9 dpf/4 dpi личинки, обработанные DMSO- и IWR-1, усыпляли при передозировке трицина и фиксировали в 4% PFA в течение 3 ч при комнатной температуре (стадия 5.6). Четыре личинки из каждой независимой родительской группы были случайным образом выбраны для последующей обработки тканей (N = 3; n = 12 личинок за обработку). Криозащита, криосечение (при толщине 12 мкм), ядерное контрокрашивание с помощью DAPI и монтаж крышки были выполнены, как указано в шаге 5.7 5,31. Центральный участок с видимым зрительным нервом от каждой личинки был изображен на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе с использованием 40-кратного масляного погружного объектива (числовая апертура = 1,30) для получения изображений z-стека 512 x 512 пикселей с интервалом z-шага 1 мкм. Каждое изображение содержало данные из трех каналов: канал 1 = возбуждение 405 нм для DAPI, канал 2 = возбуждение 488 нм для eGFP, канал 3 = проходящий свет для яркого поля. Поскольку интенсивность пикселей количественно оценивалась на изображениях яркого поля, настройки напряжения лампы пропускаемого света оставались постоянными, и все данные, собранные для статистических сравнений, были получены в тот же день.

Изображения z-стека конфокального микроскопа были предварительно обработаны для автоматической количественной оценки, как описано на этапе 6, с использованием FIJI. Изображения были исключены из предварительной обработки и количественной оценки, если ткань была скомпрометирована таким образом, что это затруднило бы генерацию ROI (например, от разрыва (Рисунок 7А; пурпурные наконечники стрел) или обструкция ориентира (Рисунок 7B; пурпурные овалы)) или перекос измерений интенсивности ROI (например, от складывания (Рисунок 7C; пурпурные овалы)). Несмотря на отсутствие нескольких личинок с этими критериями исключения, все наборы данных в настоящем документе представляют N = 3 со следующим числом биологических реплик (личинок): n = 11, DMSO MTZ-; n = 10, ИВР-1 МТЗ-; n = 11, ДМСО МТЗ+; n = 12, ИВР-1 МТЗ+. Используя канал DAPI, ROI RPE были инициированы путем первого определения точки, в которой дорсальная апикальная сторона RPE (обращенная к сетчатке) непосредственно примыкала к дорсальной кончику OLM (Рисунок 3B',D'; синие наконечники стрелок) (шаг 6.2.2). Поскольку дистальное расширение RPE может варьироваться между секциями, OLM использовался в качестве анатомического ориентира для стандартизации конечных точек ROI RPE и нормализации измерений углового расстояния в MATLAB (где 0 ° = конечная точка ROI дорсальной и 180 ° = конечная точка ROI вентральной окраски). При выполнении абляции RPE с фармакологическими манипуляциями или на мутантном фоне анатомический ориентир должен быть идентифицирован и подтвержден до предварительной обработки и количественной оценки. Здесь OLM был очевиден во всех личинках, количественно оцененных и не был скомпрометирован разрывом (как в Рисунок 7B) или лечение ДМСО или IWR-1. После идентификации дорсальной начальной точки ROI генерировались вслед за апикальной стороной RPE (дорсально-вентральной) до тех пор, пока не была достигнута точка, прилегающая к кончику вентрального OLM (Рисунок 3B",D"; синие наконечники стрел). Затем была сделана вентральная конечная точка ROI между апикальной и базальной (обращенной к сосудистой) сторонами RPE, как обсуждалось на этапе 6.2.3 (Рисунок 3B",D"; пурпурная линия). ROI продолжался, следуя за базальной стороной RPE (вентрально-дорсальная) до достижения базальной стороны, прилегающей к начальной точке в дорсальном OLM. Затем ROI был заключен путем создания заостренного дорсального конца (Рисунок 3B',D'; пурпурная линия), как сделано вентрально. Было показано, что генетическая абляция приводит к потере центральной экспрессии eGFP, которая восстанавливается по мере продолжения регенерации (резюмируется в Рисунок 6)3; таким образом, в зависимости от степени регенерации и интенсивности eGFP в интересующую точку времени, канал eGFP может быть полезен только для генерации ROI в MTZ- группа. Таким образом, в то время как конфокальные приобретения также содержали изображения каналов eGFP, генерация ROI была завершена с использованием каналов DAPI и brightfield, как упоминалось в шаге 6.2.3. Генерация ROI RPE была простой в DMSO- и IWR-1-обработанных MTZ- личиночные группы и охваченные области с заметно пигментированными апикальными микроворсинками (Рисунок 3B; красный наконечник стрелы) вместе с заметно пигментированными телами клеток. Те же параметры были применены к МТЗ+ личиночные группы (Рисунок 3D; красный наконечник стрелки); однако из-за остаточной поврежденной ткани в месте повреждения границы апикальных микроворсинок и пигментации было трудно очертить только в канале Брайтфилда в некоторых случаях. В этих областях канал DAPI также использовался для идентификации клеточного мусора в месте повреждения RPE, который был включен в ROI (Рисунок 3C,D; примеры повреждения места локализации клеточного мусора обозначены голубыми наконечниками стрел). Иммуноокрашивание маркерами незрелой/зрелой RPE (например, ZPR2; Рисунок 6D,Э)37 и/или фоторецепторы (например, ZPR1)37,38 может быть также использован для облегчения определения ROI RPE в аблированных личинках.

Ранее абляционные личинки, обработанные IWR-1 от 4 dpf до 4 dpi, показали значительное ухудшение регенерации RPE по сравнению с контрольными группами братьев и сестер, обработанных DMSO (рисунок 8C)3. Это было сообщено как процент восстановления центрального пигмента, что потребовало значительного предварительного опыта работы с моделью и ручных измерений углового расстояния для обозначения границ регенерации (рисунок 8B; черные наконечники стрел). RpEGEN был создан для автоматизации количественной оценки регенерации RPE и уменьшения внутренних смещений. Мало того, RpEGEN также позволил генерировать высоконадежные наборы данных; например, 10 точек данных были ранее сгенерированы из ручной количественной оценки n = 10 личинок MTZ+ , обработанных DMSO (рисунок 8C; % восстановления пигмента на сечение)3, тогда как 174 801 точка данных была сгенерирована из n = 11 личинок MTZ+ , обработанных DMSO, с использованием RpEGEN (рисунок 9C; измерения интенсивности пикселей).

RpEGEN был разработан для постепенной оценки региональных изменений пигментации по всему RPE путем получения скелетонизированной осевой линии (ширина 1 пиксель) из исходной рентабельности инвестиций, сгенерированной с использованием FIJI (рисунок 4A, B). Чтобы включить все пиксели в ROI для анализа (т. е. не только пиксели осевой линии), на каждом пикселе от осевой линии было выполнено евклидово преобразование расстояния от осевой линии для создания карты ближайшего индекса осевой линии для каждого пикселя в маске ROI. Эта карта индексов позволяла отнести каждый пиксель за пределами осевой линии к одному пикселю осевой линии, создавая полный набор данных по всему RPE для каждой личинки (рисунок 4E). Дорсально-вентральная длина RPE была представлена угловым расстоянием (Рисунок 4G; 0-180°) в отличие от нормализованного пиксельного расстояния (Рисунок 4F; 0-1 произвольные единицы), так как это было более интуитивно на основе предыдущих измерений регенерации RPE 3,4,5 и того факта, что угловое расстояние не изменяется в зависимости от морфологических различий. Медианные интенсивности, полученные из 5-градусных бункеров, были метрикой, выбранной для освещения крупномасштабных тенденций и минимизации высокочастотной изменчивости, наблюдаемой в 1-градусных бинтированных данных (таблица 1, рисунок 10A). Моделирование перестановок было выбрано для проверки нулевой гипотезы, чтобы увидеть, похожи ли медианы двух групп лечения (здесь DMSO MTZ+ и IWR-1 MTZ+ (оба 4 dpi), рисунок 10B)39. Этот метод ресамплинга не имеет строгих предположений о распределении данных и может быть использован для ряда тестовых статистических данных (например, среднее, медианное и т.д.) для получения надежных оценок p-значения. Некоторые из этих параметров (например, размер бункера необработанных и медианных данных, повторения перестановочного моделирования и т. д.) могут быть адаптированы и изменены в соответствии с потребностями пользователя. Для последнего было выбрано 20 000 повторений для получения статистически достоверного сравнения, однако следует позаботиться о том, чтобы сбалансировать вычислительную эффективность со статистической надежностью, поскольку слишком мало повторений может привести к ошибочным оценкам p-значения. Рекомендуется выполнить несколько значений повторения (10 000, 20 000 и т.д.), чтобы убедиться, что распределение и значения p-значений относительно стабильны до начала интерпретаций. Увеличение повторений перестановок увеличит статистическую мощность (но также займет больше времени), что может быть полезно для некоторых наборов данных.

Наборы данных конфокальных изображений были количественно определены с использованием RpEGEN, как описано в шаге 7. Аннотированные сценарии RpEGEN и поддержки доступны на GitHub (https://github.com/burchfisher/RpEGEN) вместе с 8-битными файлами TIF и соответствующими файлами ROI для тестирования заинтересованными пользователями. Тепловые карты, отображающие необработанные данные из MTZ-личиночных ROI, показали общее распределение более темных интенсивностей пикселей (где 0 = черный и 255 = белый, 8-битный цветовой масштаб), охватывающий дорсальную (0°) до вентральную (180°) длину RPE, независимо от обработки 0,06% v/v DMSO или 15 мкМ IWR-1 (рисунок 9A, B). Построение медианных интенсивностей пикселей облегчило визуализацию среди всех групп и показало сходство между MTZ-группами по всему RPE (рисунок 10A; черные и серые линии). Эти данные подтвердили наличие неповрежденного пигментированного монослоя RPE (рисунок 9E, F) и обеспечили базовые средние значения интенсивности пикселей (т.е. ниже 150) для неабляционного RPE (рисунок 10A; черные и серые линии). Для сравнения, необработанные (рисунок 9C, D) и медианные (рисунок 10A; синие и красные линии) данные из ROI личинок MTZ+ показали общее распределение более легких интенсивностей пикселей в центральном RPE, опять же, независимо от условий лечения. Личинки, обработанные абляцией DMSO, показали централизованное распределение световых пикселей примерно на 100° (± 15°) (рисунок 9C; оранжево-красные бункеры). Это соответствовало видимому отсутствию пигментации в центральном месте повреждения RPE в / вокруг зрительного нерва (рисунок 9G; синие наконечники стрел). Личинки, обработанные абляцией IWR-1, также показали централизованное распределение световых пикселей, которые были расширены как дорсально (примерно до 50°), так и вентрально (примерно на 5°) по сравнению с MTZ+ DMSO-обработанными элементами управления братьями и сестрами (рисунок 9D; оранжево-красные бункеры). Наличие расширенного места повреждения было хорошо видно в разрезанной ткани (рисунок 9H; синие наконечники стрел). За исключением двух 1-градусных бункеров, наблюдаемая разница между группами MTZ+ была статистически значимой в центральном RPE (рисунок 10B; светло-синяя затененная область между ~40-140°; p-значение ≤ 0,05), что указывает на значительно меньшую центральную пигментацию RPE у личинок, обработанных MTZ+ IWR-1, по сравнению с контрольными группами братьев и сестер, обработанных MTZ+ DMSO. Интерпретация этих необработанных (Рисунок 9C,D) и медианных (Рисунок 10A) данных со статистическим сравнением (Рисунок 10B) с использованием RpEGEN была подтверждена не только путем наблюдения за секционированной тканью (Рисунок 9G,H), но и подтвердила предыдущие результаты ручной количественной оценки (Рисунок 8)3.

Figure 1
Рисунок 1: экспрессия трансгена rpe65a:nfsB-eGFP через 5 дней после оплодотворения. (А-С) Цельные изображения личинки 5 dpf, обработанной PTU, показывающие тусклую трансгенную экспрессию в шишковидной железе (A; желтый наконечник стрелки) и яркую трансгенную экспрессию в RPE (B, C) во время скрининга на генетическую абляцию. (B) Трансгенная экспрессия заметно локализуется в центральных двух третях RPE, и белые наконечники стрелок подчеркивают границу между периферической (незрелой) и центральной (зрелой) RPE. Зеленый = eGFP. Передняя часть поднята. Шкала = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Верификация успешной генетической абляции РПЭ in vivo. Цельные изображения (A) трех неблаблированных (MTZ-) личинок 7 dpf, показывающих пигментацию RPE по всему глазу, и (B) трех абляционных (MTZ+) 2 dpi личинок, показывающих зону абляции, где отсутствует пигмент в центральных двух третях RPE (красные наконечники стрелок). Передняя часть поднята. Шкала = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Интересующие регионы RPE (ROI) для автоматизированной количественной оценки с использованием RpEGEN. Поперечные криосекции (A,B) неабляционной (MTZ-) 9 dpf личинки и (C,D) абляционной (MTZ+) 4 dpi личинки с RPE ROI, выделенными пурпурным цветом. (Б,Г) Красные наконечники стрелок выделяют области, где заметно пигментированные апикальные микроворсинки были включены в ROI. (С,Г) Голубые наконечники стрел указывают на примеры областей повреждения локализованных обломков DAPI+, которые использовались для включения обломков клеток RPE в ROI. (Б',Б",Д',Д") Цифровые зумы как дорсальной, так и вентральной областей ROI (черные пунктирные поля в B и D) показывают предлагаемые начальные точки ROI (синие наконечники стрелок) и заостренные концы ROI, которые имеют решающее значение для обнаружения конечных точек в MATLAB. Изображения Brightfield также показаны на рисунке 9E,G. Белый/серый = ядра. Спинной сустав поднят, а дисталь остается. (А-Д) Шкала стержней = 40 мкм. (B',B",D',D") Шкала стержней = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Рабочий процесс обработки RpEGEN. (A) Пример правильно ориентированного 8-битного изображения яркого поля и сгенерированного FIJI ROI (красный), импортированного в MATLAB. Спинной сустав поднят, а дисталь остается. Цветовая полоса представляет 8-битные значения интенсивности оттенков серого, где 0 = черный и 255 = белый. (B) Начальная двоичная скелетонизация (белый) маски ROI (красный), показывающая наличие ошибочных шпор и разграничение начальной и конечной точек для геодезического разграничения расстояний пикселей, как показано в (C). Цветовая полоса в (C) представляет евклидово расстояние до пикселя. (D) Шпоры удаляются с использованием упрощенного наименее затратного пути от конечного пикселя обратно к начальному пикселю, что приводит к непрерывной осевой линии, лишенной шпор (красный). (E) Ближайшие линейные индексы осевой линии, основанные на преобразовании расстояния между всеми пикселями в маске ROI и пикселями осевой линии (белыми). Эти значения индекса позволяют назначить каждый пиксель изображения в маске ROI ближайшему пикселю осевой линии для анализа. Цветовая шкала представляет линейные значения индекса пикселей осевой линии. (F) Пример нормализованного расстояния пикселей вдоль осевой линии, где 0 (синий, дистальный дорсальный пиксель) — начальный пиксель, а 1 (красный, дистальный вентральный пиксель) — конечный пиксель. (G) Аналогично (F), но использует угловое расстояние, где 0 градусов (синий) - начальный пиксель, а 180 градусов (красный) - конечный пиксель. (H) Пример средних значений интенсивности пикселей, рассчитанных для каждого пикселя осевой линии. Цветовая шкала представляет среднее значение интенсивности оттенков серого всех пикселей ROI, вносящих вклад в каждый заданный пиксель осевой линии. На этом рисунке показаны изображения из тестового набора данных, а не личинки из групп обработки 0,06% v/v DMSO или 15 мкМ IWR-1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Доказательства абляции RPE и дегенерации фоторецепторов. (A) Поперечные криосекции неабляционной личинки 6 dpf. (А,А') После воздействия PTU экспрессия трансгенов ограничивается зрелыми клетками RPE, причем самая яркая экспрессия ограничивается центральными двумя третями RPE. Наконечники стрел указывают на апикальные микроворсинки. (А") Изображения дифференциального интерференционного контраста (DIC) показывают нормальную архитектуру внешнего ядерного слоя (ONL; т.е. фоторецептор). (Б,Б') Поперечные криосекции личинки 1 dpi выявляют значительное нарушение морфологии клеток eGFP+ и дезорганизацию в ламинировании ONL. Стрелки указывают на расслоенные и пикнотические ядра. (Б") Изображения DIC также показывают заметное нарушение архитектуры ONL. Зеленый = eGFP, синий = ядра, желтый = ONL. Спинной сустав поднят, а дисталь остается. Шкала в (A) представляет 40 мкм и может быть применена к (B). Шкала в (A') представляет 40 мкм и может быть применена к (A", B', B"). Этот рисунок и текст легенды рисунка были изменены из Hanovice et al. 2019 (Рисунок 1)3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Модель регенерации RPE у личинок рыбок данио. (A) nfsB-eGFP экспрессируется в зрелом RPE в центральных двух третях глаза. (B) Применение МТЗ приводит к апоптозу (ТУНЕЛ, красный) РПЭ и фоторецепторов. (C) Абляция RPE приводит к дегенерации фоторецепторов и мембраны Бруха (пунктирная линия). (D) Неабляционная RPE на периферии начинает распространяться и распространяться в место повреждения (синий). (E) По мере появления регенерированных eGFP+ RPE на периферии RPE можно разделить на четыре зоны: периферическая RPE (pRPE), дифференцированная RPE (dRPE), переходная зона (TZ) и место повреждения (IS). (Е, вставка) Регенерированный дифференцированный RPE (зеленый) появляется на периферии, близкой к неблаблированной периферической RPE, и содержит пролиферативные клетки, прилегающие к переходной зоне. Переходная зона состоит из все еще дифференцирующихся RPE-клеток (ZPR2, красный) и пролиферативных клеток (синий). Место повреждения содержит непигментированные пролиферативные клетки, которые не экспрессируют никаких маркеров дифференцировки RPE. (F) Регенерация функционального слоя RPE и мембраны Бруха завершена на 14 dpi. Этот рисунок и текст легенды рисунка были изменены из Hanovice et al. 2019 (Рисунок 14)3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Скомпрометированные участки тканей, исключенные из анализа изображений. (A-C) Поперечные криосекции личинок из 0,06% v/v DMSO и 15 мкМ IWR-1 наборов данных, которые соответствовали критериям исключения. Одна личинка показывает разрыв дорсальной ткани RPE (A; пурпурные наконечники стрел), а две другие личинки показывают складчатость ткани, которая либо препятствует анатомическому ориентиру (дорсальный OLM) в канале DAPI (B; пурпурные пунктирные овалы), либо может искажать измерения интенсивности RPE из канала brightfield (C; пурпурные пунктирные овалы). Белый/серый = ядра. Спинной сустав поднят, а дисталь остается. Шкала = 40 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8: Фармакологическое ингибирование с использованием IWR-1 ухудшает регенерацию RPE. Поперечные криосекции абляционных (MTZ+) 4 dpi личинок из групп лечения (A) 0,06% v/v DMSO и (B) 15 мкМ IWR-1. Изображения Брайтфилда (A,B) и количественная оценка процента восстановления/сечения RPE (C) показывают значительную задержку восстановления пигментированного монослоя в личинках, обработанных IWR-1 (непарный t-тест Стьюдента, *** p < 0,0001). (B) Черные наконечники стрел обозначают самый центральный край регенерирующего RPE. Спинной сустав поднят, а дисталь остается. Шкала в (B) представляет 40 мкм и может быть применена к (A). Этот рисунок и текст легенды рисунка были изменены из Hanovice et al. 2019 (Рисунок 13)3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 9
Рисунок 9: Необработанные данные, полученные из автоматизированной количественной оценки регенерации RPE в RpEGEN. (A-D) Тепловые карты, показывающие распределения интенсивности пикселей яркого поля, составленные из всей области ROI RPE, от дорсальной (x-оси; угловое расстояние = 0°) до вентральной (x-оси; угловое расстояние = 180°), для всех личинок в каждом наборе данных: (A) n = 11, DMSO MTZ-; (B) n = 10, IWR-1 МТЗ-; (C) n = 11, ДМСО МТЗ+; (D) n = 12, IWR-1 MTZ+ (из трех независимых родительских групп, N = 3). Например, (A) отображает данные из 177 460 пикселей в 11 ROI. На осях Y интенсивность пикселей отображается на основе 8-битной цветовой шкалы, где 0 = черный и 255 = белый. Необработанные данные отображаются в 5-градусных (ось x) 5-8-битных значениях интенсивности (ось Y), где красный = максимальное количество контейнеров, а темно-синий = минимальное количество контейнеров. (Э-Н) Поперечные криосекции репрезентативных (E,F) небляционных (MTZ-) 9 личинок dpf и (G,H) абляционной (MTZ+) 4 dpi личинки из 0,06% v/v DMSO и 15 мкМ IWR-1. ROI RPE подсвечиваются пурпурным цветом, а крайние значения углового расстояния указаны (0° = дорсальный, 180° = вентральный). В целом, эти данные показывают распределение более темных пикселей (значения интенсивности между 0-150) в (A, B, E, F) небляционными ROI по сравнению с (C, D, G, H) абляционными ROI, независимо от лечения. Данные из абляционных ROI показывают (C,G) централизованное (100° ± 15°) распределение более легких пикселей (значения интенсивности между 150-250) в группе лечения DMSO, которое (D,H) расширяется дорсально (до ~50°) и слегка вентрально (на ~5°) в личинках, обработанных IWR-1. (Г,Ч) Эти центральные зоны абляции, в которых отсутствует пигмент, подсвечиваются синими наконечниками стрел. Черные стрелки указывают на расположение зрительного нерва. Изображения личинок, обработанных DMSO, также показаны на рисунке 3. Шкала = 40 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 10
Рисунок 10: Групповые результаты и статистическое сравнение, полученное из автоматизированной количественной оценки регенерации RPE в RpEGEN. (A) 5-градусные биндированные медианные значения и 95% доверительные оболочки, полученные из необработанных данных для каждой группы. График показывает сходство между MTZ-группами (черные и серые линии) через дорсальную (0°) до вентральной (180°) длину RPE с заметными различиями между группами MTZ+ (синие и красные линии) в центральной RPE (светло-синяя затененная область между ~ 40-140 °). В частности, медиана интенсивности пикселей кажется более светлой (0 = черный и 255 = белый) в IWR-1 MTZ+ 4 dpi по сравнению с любой другой группой лечения, что соответствует снижению центральной пигментации RPE. (B) Статистическое сравнение медианных значений, полученных от 1-градусных бункеров через дорсальную (0°) до вентральной (180°) длину RPE для DMSO MTZ+ 4 dpi и IWR-1 MTZ+ 4 dpi, усиливает наблюдение в (A). p-значения были рассчитаны с использованием моделирования перестановок с 20 000 повторений и двустороннего теста для каждого 1-градусного бункера. Согласно нулевой гипотезе о том, что две группы имеют сходные медианные значения для любого соответствующего 1-градусного бина, p-значение ≤ 0,05 указывает на статистически значимую разницу между медианами группы (пунктирная черная линия = 95% доверительный интервал (CI)). Наличие p-значений ≤ 0,05 в центральной RPE (светло-голубая затененная область между ~ 40-140 °) указывает на значительно меньшую пигментацию у абляционных (MTZ+) личинок, обработанных IWR-1, по сравнению с абляционными (MTZ+) DMSO-обработанными регуляторами братьев и сестер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Имя переменной Тип переменной Переменный размер Описание переменной
ROIname Ячейка {N x 1} Имена обрабатываемых файлов окупаемости инвестиций
RoIxy Ячейка {N x 1} Вершины ROI для каждого обработанного файла ROI
ImGname Ячейка {N x 1} Имена обрабатываемых файлов изображений TIF
ИМГ Ячейка {N x 1} 8-битные данные изображения яркого поля для каждого обработанного TIF
РОИБВ Ячейка {N x 1} Логическая (0 или 1) маска ROI с теми же размерами, что и изображения IMG
Клайн Ячейка ж / Таблицы {N x 1} (n x 16) Данные осевой линии для отдельных изображений, включая x, y, расстояние, угол, индекс, количество точек и статистику
CIdx Ячейка {N x 1} Данные индексов осевой линии, относящиеся к маске ROI, указывают на ближайшую центральную точку для расчета CLine
CLineBW Ячейка {N x 1} Логическая (0 или 1) матрица с теми же размерами, что и изображения IMG, с указанием местоположения осевой линии (=1)
RAW_data Стол Ш x 3 Таблица, объединяющая все необработанные данные для каждого пикселя в ROI для всех различных изображений IMG
BIN_1_deg_all Стол Ш x 9 Таблица, содержащая 1-градусные данные и статистику с использованием данных из RAW_data
BIN_5_deg_all Стол Ш x 9 Таблица, содержащая 5-градусные привязанные данные и статистику с использованием данных из RAW_data
BIN_10_deg_all Стол Ш x 9 Таблица, содержащая 10-градусные биндированные данные и статистику с использованием данных из RAW_data

Таблица 1: Описание переменных, экспортированных из скрипта RpEGEN.m в файл MAT. Определения следующие: ROI(s) = регион(ы), представляющий интерес; TIF = формат файла изображения с тегами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол описывает методологию генетической абляции RPE и изучает механизмы дегенерации и регенерации у личиночных рыбок данио. Этот протокол также был успешно выполнен у взрослых рыбок данио3, но с менее обширной характеристикой, поэтому личинки находятся в центре внимания. Критические аспекты этой части протокола (этапы 1-4) включают: 1) добавление 1,5x PTU к эмбрионам до начала меланогенеза, 2) дехорионирование обработанных PTU эмбрионов на 2-3 dpf, 3) тщательный скрининг на eGFP и 4) время изменения воды во время генетической абляции с MTZ. PTU ингибирует синтез меланина21,22 и был использован в этой парадигме абляции RPE для облегчения скрининга экспрессии трансгена rpe65a:nfsB-eGFP и для определения характеристик дегенеративных и регенеративных процессов RPE на основе отсутствия и последующего возвращения, соответственно, пигментированной ткани3. Поскольку PTU будет ингибировать дальнейшую пигментацию, но не депигментировать ткани после того, как меланогенез начнется21, PTU должен быть добавлен до начала пигментации, которая начинается около 24 hpf у рыбок данио25. Здесь, как и в предыдущих исследованиях 4,5, PTU был добавлен примерно на 6 hpf26, чтобы обеспечить ингибирование до начала синтеза меланина. В то время как PTU позволяет визуализировать ключевые этапы протокола, лечение PTU может влиять на некоторые аспекты развития (как обсуждалось в шаге 2.3) и ухудшать вылупление эмбриона. Последний процесс, если он затягивается слишком долго, может привести к дефициту морфологии и моторики и повлиять на жизнеспособность40; таким образом, дехорионирование (вылупление) эмбрионов либо ферментативно проназой, либо вручную с использованием щипцов на 2-3 дПФ имеет важное значение для поддержания и стандартизации здоровья личинок до генетической абляции. Другим важным соображением, чтобы избежать проблем со здоровьем и жизнеспособностью старых личинок (не связанных с PTU-обработкой), является то, что личинки должны начать стандартизированные режимы кормления, если они остаются вне системы водных объектов после 9 dpf / 4 dpi для экспериментов41.

Как объясняется, rpe65a управляет экспрессией трансгенов в зрелом RPE в центральных двух третях заднего глаза. Экспрессия eGFP в личинках 5 dpf, обработанных PTU, обычно легко обнаруживается и заметно интенсивна (яркая), как показано на рисунке 1. Также могут наблюдаться личинки, которые смутно экспрессируют eGFP при 5 dpf по сравнению с братьями и сестрами с яркой экспрессией. Также могут существовать различия в соотношении интенсивности экспрессии (т.е. яркие и тусклые) между поколениями, причем некоторые поколения имеют более тускло экспрессирующие личинки, чем другие. В любом случае, личинки с тусклой экспрессией eGFP обычно представляют меньшинство животных в каждой кладке. Хотя неизвестно, показывают ли тускло экспрессирующие личинки менее серьезные фенотипы повреждения RPE, абляции были выполнены в яркой когорте eGFP + из каждой кладки, а сравнительно тусклые братья и сестры были усыплены при скрининге и исключены из анализа. Аналогичным образом, обширная характеристика фенотипов RPE рыбок данио была выполнена у личинок гетерозиготных для трансгена rpe65a: nfsB-eGFP путем пересечения rpe65a: nfsB-eGFP гетерозиготных взрослых особей с диким типом3. Маловероятно, однако, неизвестно, показывают ли личинки гомозиготные для rpe65a:nfsB-eGFP более тяжелые фенотипы абляции. Другие усилия по стандартизации протокола абляции включают добавление равных, измеренных объемов (например, 30 мл на чашку Петри 10 см) к чашкам MTZ- и MTZ+ в течение 24-часового периода генетической абляции. Аналогичным образом, личинки в фармакологических лечебных блюдах получили равные, измеренные объемы (например, 5 мл на 6 лунок) и своевременное пополнение свежими соединениями (например, каждые 24 ч). При обращении с посудой с различными MTZ и/или фармакологическими соединениями следует принимать осторожные меры для предотвращения разлива и непреднамеренного перекрестного загрязнения во время транспортировки и подмены воды.

Протокол абляции RPE рыбок данио может быть модифицирован для включения фармакологических манипуляций (этап 5). Это было сделано ранее для идентификации сигнальных путей иммунного ответа5, mTOR4 и Wnt3 в качестве критических регуляторов регенерации RPE; последнее, как было показано, является повторяемым здесь и использовалось для проверки RpEGEN. В дополнение к освещению критических путей регенерации RPE, фармакологические манипуляции широко используются для исследований регенерации сетчатки рыбок данио 10,42,43,44,45,46,47. Перед включением в протокол абляции RPE фармакологические агенты должны быть тщательно оценены на токсичность, эффективность и продолжительность лечения. Это может быть сделано путем: проведения экспериментов с реакцией на дозу для оценки токсичности48; оценка экспрессии известных генов-мишеней/белков 4,5; и оценка известных функциональных последствий фармакологических манипуляций, например, истощения лейкоцитов при лечении PLX3397 48,49,50,51. Здесь DMSO (контроль транспортного средства) и IWR-1 были добавлены за 24 ч до генетической абляции, а личинки были проверены непосредственно перед фармакологической предварительной обработкой на 4 dpf. В то время как личинки eGFP+ отличаются от eGFP-личинок на 4 dpf, интенсивность eGFP может казаться довольно тусклой, поэтому личинки были повторно проверены на экспрессию eGFP на 5 dpf (репрезентативные результаты). Скрининг на eGFP до 4 dpf может быть затруднен, поскольку экспрессия может быть настолько низкой, что не обнаруживается глазом. Таким образом, предварительная обработка фармакологическими средствами до 4 dpf (т.е. на 2 dpf)4 может быть добавлена к неэкранированным личинкам, которые будут отделены на 5 dpf, когда eGFP хорошо виден. В любом сценарии, где личинками необходимо манипулировать (например, во время скрининга, встраивания для визуализации и т. Д.), Фармакологические условия лечения должны поддерживаться и, независимо от возраста скрининга, RPE должен быть абляционным с MTZ на 5 dpf.

В дополнение к протоколу генетической абляции изложены пошаговые инструкции по предварительной обработке изображений конфокального микроскопа и автоматической количественной оценке регенерации RPE с использованием RpEGEN (шаги 6-7). RpEGEN был создан для стандартизации количественной оценки регенерации RPE среди пользователей и повышения надежности выходного набора данных, сводя к минимуму внутренние предубеждения, которые могут возникнуть при утомительной ручной количественной оценке, выполненной ранее. Критические аспекты этой части протокола выполняются во время генерации ROI (шаг 6). Во-первых, изображение/глаз должно находиться в дорсальной верхней, дистальной левой ориентации (например, рисунок 3A-D, рисунок 4), поскольку RpEGEN был оптимизирован для этой направленности. Также важно, чтобы дорсальный и вентральный концевые концы ROI RPE сужались к заостренному кончику, как показано на рисунке 3B', B", D', D" (пурпурные линии). Если эти концы вместо этого квадратные или округленные, скрипт RpEGEN может испытывать трудности с определением начальных и конечных пикселей скелета осевой линии и может генерировать шпоры на концах ROI терминала, а не централизованную линию (рисунок 4B). Шпоры на концах концевой ROI могут привести к укорочению осевой линии во время снятия шпор (рисунок 4D) и / или проблемам с измерениями углового расстояния в периферийном RPE (рисунок 4G). Идентичные системы именования для файлов TIF и ROI, соответствующих каждой отдельной личинке, также являются важным шагом и императивом для сопряжения 8-битного файла TIF с правильной рентабельностью инвестиций в RpEGEN. Несоответствие имен файлов TIF и ROI приведет к неспособности генерировать рабочий процесс обработки RpEGEN, описанный в разделе Репрезентативные результаты (рисунок 4), и, в конечном счете, предотвратит количественную оценку регенерации RPE с помощью этого скрипта.

В совокупности этот протокол предоставляет инструкции по успешному удалению RPE у личинок рыбок данио, манипулированию сигнальными путями, которые могут представлять интерес до, во время или после повреждения RPE, и количественной оценке регенерации RPE стандартизированным способом с ограниченными врожденными предубеждениями. В контексте имеющихся моделей in vivo и in vitro , в которых можно изучать регенеративный потенциал RPE, рыбка данио уникальна своей способностью к внутренней регенерации RPE14. Тем не менее, это острая модель повреждения RPE, а не хроническая, как дегенеративные заболевания RPE, предназначенные для терапевтического развития (например, AMD). Хотя это ограничение модели, она остается отличной платформой для изучения механизмов регенерации RPE, которые в значительной степени неизвестны и могут быть адаптированы в будущем для изучения хронических травм и заболеваний. Инструменты и методология, описанные в настоящем описании, являются универсальными и также могут быть применены для исследований клеточных процессов, участвующих в дегенеративном ответе, и для изучения судьбы RPE-смежных тканей после абляции. Аналогичным образом, скрипт RpEGEN может быть модифицирован в соответствии с потребностями пользователя в выводе данных; например, для выполнения пространственного анализа маркеров, отличных от пигмента (например, зонды гибридизации in situ , экспрессия белка и т.д.).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

L.L.L. является соавтором патента США No 9,458,428, который описывает ускоренный метод получения пигментного эпителия сетчатки из плюрипотентных стволовых клеток человека; это не связано с содержанием настоящего документа. J.M.G. и G.B.F. нечего раскрывать.

Acknowledgments

Работа, описанная здесь, была поддержана Национальными институтами здравоохранения (RO1-EY29410 для J.M.G и грант NIH CORE P30-EY08098 для департамента офтальмологии); Центр иммунной трансплантации и терапии UPMC (для L.L.L. и J.M.G.); и кафедра офтальмологических исследований Э. Рональда Сальвитти (дж.м.г.). Дополнительная поддержка была получена от стипендии Виганда в области офтальмологии (L.L.L.), Фонда глаз и ушей Питтсбурга и неограниченного гранта от Research to Prevent Blindness, New York, NY. Авторы также хотели бы поблагодарить Аманду Платт за техническую помощь и доктора Хью Хаммера и персонал водных видов спорта за отличную поддержку по уходу за животными.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lab Material/Equipment
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI) Millipore Sigma D9542
6-well plates Fisher Scientific 07-200-83
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 05-539-13 Catalog number is for 50 mL tubes
Diamond tip scribing pen Fisher Scientific 50-254-51 Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 % Fisher Scientific BP231 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Embryo incubator (large) Fisher Scientific 3720A
Embryo incubator (mini/tabletop) Labnet I5110A
Fluorescence stereo microscope Zeiss Axio Zoom.V16 Or similar, with 488 nm excitation laser/filter
Glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-4 Manufactured by Corning, non-sterile
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo Millipore Sigma 5.04462 Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements
Methylene blue (powder) Fisher Scientific BP117-100 Also available as a premade aqeuous solution
Metronidazole (MTZ) Millipore Sigma M3761 Check instiutional chemical waste disposal requirements
N-phenylthiourea (PTU) Millipore Sigma P7629 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free Fisher Scientific AA433689M Chemical waste, proper disposal required
Petri dishes Fisher Scientific FB0875712 10 cm diameter
Phosphate buffered saline (powder packets) Millipore Sigma P3813 Used to make 10 X PBS stock
Pronase Millipore Sigma PRON-RO
Shaking incubator Benchmark H2010 Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius
Stereo microscope Leica S9i Or similar, with transmitted light illumination
Student Dumont #5 forceps Fine Science Tools 91150-20 Fine-tipped forceps for manual dechorionation
Tabletop rotator/shaker Scilogex SK-D1807-E
Transfer pipette Millipore Sigma Z135003 3.2 mL bulb draw, non-sterile
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Pentair TRS1, TRS2, TRS5 Also available from Fisher Scientific (NC0342409)
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Software Material
FIJI (Fiji is Just ImageJ) FIJI (Fiji is Just ImageJ) https://imagej.net/software/fiji/ Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats
GRAMM examples and how-tos MathWorks https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.
MATLAB MathWorks https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox
MATLAB support MathWorks https://www.mathworks.com/support.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Grierson, I., et al. repair and regeneration of the retinal pigment epithelium. Eye. 8 (2), 255-262 (1994).
  3. Hanovice, N. J., et al. Regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium after widespread genetic ablation. PLoS Genetics. 15 (1), 1007939 (2019).
  4. Lu, F., Leach, L. L., Gross, J. M. mTOR activity is essential for retinal pigment epithelium regeneration in zebrafish. bioRxiv. , (2021).
  5. Leach, L. L., Hanovice, N. J., George, S. M., Gabriel, A. E., Gross, J. M. The immune response is a critical regulator of zebrafish retinal pigment epithelium regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (21), (2021).
  6. Zenno, S., Koike, H., Tanokura, M., Saigo, K. Gene cloning, purification, and characterization of nfsb, a minor oxygen-insensitive nitroreductase from escherichia coli, similar in biochemical properties to frase I, the major flavin reductase in vibrio fischeri. The Journal of Biochemistry. 120 (4), 736-744 (1996).
  7. Hamel, C. P., et al. Molecular cloning and expression of rpe65, a novel retinal pigment epithelium-specific microsomal protein that is post-transcriptionally regulated in vitro. Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15751-15757 (1993).
  8. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: A new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
  9. White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62 (3), 232-240 (2013).
  10. White, D. T., et al. Immunomodulation-accelerated neuronal regeneration following selective rod photoreceptor cell ablation in the zebrafish retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 3719-3728 (2017).
  11. Yoshimatsu, T., et al. Presynaptic partner selection during retinal circuit reassembly varies with timing of neuronal regeneration in vivo. Nature Communications. 7, 10590 (2016).
  12. Montgomery, J. E., Parsons, M. J., Hyde, D. R. A novel model of retinal ablation demonstrates that the extent of rod cell death regulates the origin of the regenerated zebrafish rod photoreceptors. The Journal of Comparative Neurology. 518 (6), 800-814 (2010).
  13. Hagerman, G. F., et al. Rapid recovery of visual function associated with blue cone ablation in zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0166932 (2016).
  14. George, S. M., Lu, F., Rao, M., Leach, L. L., Gross, J. M. The retinal pigment epithelium: Development, injury responses, and regenerative potential in mammalian and non-mammalian systems. Progress in Retinal and Eye Research. 85, 100969 (2021).
  15. Chiba, C., et al. Visual cycle protein rpe65 persists in new retinal cells during retinal regeneration of adult newt. The Journal of Comparative Neurology. 495 (4), 391-407 (2006).
  16. Yoshii, C., Ueda, Y., Okamoto, M., Araki, M. Neural retinal regeneration in the anuran amphibian xenopus laevis post-metamorphosis: Transdifferentiation of retinal pigmented epithelium regenerates the neural retina. Developmental Biology. 303 (1), 45-56 (2007).
  17. Xia, H., Krebs, M. P., Kaushal, S., Scott, E. W. Enhanced retinal pigment epithelium regeneration after injury in mrl/mpj mice. Experimental Eye Research. 93 (6), 862-872 (2011).
  18. McGill, T. J., et al. Subretinal transplantation of human central nervous system stem cells stimulates controlled proliferation of endogenous retinal pigment epithelium. Translational Vision Science and Technology. 8 (3), 43 (2019).
  19. Salero, E., et al. Adult human rpe can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
  20. Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nature Chemical Biology. 5 (2), 100-107 (2009).
  21. Whittaker, J. R. An analysis of melanogenesis in differentiating pigment cells of ascidian embryos. Developmental Biology. 14 (1), 1-39 (1966).
  22. Westerfield, M. Zebrafish Book, 5th Edition; A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregon, USA. (2007).
  23. Hammer, H. S. Water quality for zebrafish culture in The Zebrafish in Biomedical Research. , Elsevier. Amsterdam, Netherlands. 321-335 (2020).
  24. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
  25. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  26. Camp, E., Lardelli, M. Tyrosinase gene expression in zebrafish embryos. Development Genes and Evolution. 211 (3), 150-153 (2001).
  27. Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
  28. Li, Z., et al. Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size. PloS One. 7 (6), 40132 (2012).
  29. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and igf signaling. PLoS One. 6 (8), 22991 (2011).
  30. Leary, S., et al. Avma Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , American veterinary medical association. Schaumburg, Illinois, USA. (2020).
  31. Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on cryosections from embryonic and adult zebrafish eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, 4779 (2007).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Muir, D. GitHub - ReadImageJROI. , Available from: https://github.com/DylanMuir/ReadImageJROI (2021).
  34. Morel, P. Gramm: Grammar of graphics plotting in matlab. Journal of Open Source Software. 3 (23), 568 (2018).
  35. Reinhardt, R., et al. Sox2, tlx, gli3, and her9 converge on rx2 to define retinal stem cells in vivo. The EMBO Journal. 34 (11), 1572-1588 (2015).
  36. Schonthaler, H. B., et al. Evidence for rpe65-independent vision in the cone-dominated zebrafish retina. European Journal of Neuroscience. 26 (7), 1940-1949 (2007).
  37. Yazulla, S., Studholme, K. M. Neurochemical anatomy of the zebrafish retina as determined by immunocytochemistry. Journal of Neurocytology. 30 (7), 551-592 (2001).
  38. Larison, K. D., Bremiller, R. Early onset of phenotype and cell patterning in the embryonic zebrafish retina. Development. 109 (3), 567-576 (1990).
  39. Dwass, M. Modified randomization tests for nonparametric hypotheses. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (1), 181-187 (1957).
  40. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: A refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
  41. Hernandez, R. E., Galitan, L., Cameron, J., Goodwin, N., Ramakrishnan, L. Delay of initial feeding of zebrafish larvae until 8 days postfertilization has no impact on survival or growth through the juvenile stage. Zebrafish. 15 (5), 515-518 (2018).
  42. Meyers, J. R., et al. Β-catenin/wnt signaling controls progenitor fate in the developing and regenerating zebrafish retina. Neural Development. 7, 30 (2012).
  43. Tappeiner, C., et al. Inhibition of the tgfβ pathway enhances retinal regeneration in adult zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0167073 (2016).
  44. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, o-phospho-l-serine, suppresses müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Experimental Eye Research. 91 (5), 601-612 (2010).
  45. Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Ascl1a/dkk/beta-catenin signaling pathway is necessary and glycogen synthase kinase-3beta inhibition is sufficient for zebrafish retina regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (38), 15858-15863 (2011).
  46. Lemmens, K., et al. Matrix metalloproteinases as promising regulators of axonal regrowth in the injured adult zebrafish retinotectal system. The Journal of Comparative Neurology. 524 (7), 1472-1493 (2016).
  47. Elsaeidi, F., Bemben, M. A., Zhao, X. F., Goldman, D. Jak/stat signaling stimulates zebrafish optic nerve regeneration and overcomes the inhibitory actions of socs3 and sfpq. The Journal of Neuroscience. 34 (7), 2632-2644 (2014).
  48. Van Dyck, A., et al. Müller glia-myeloid cell crosstalk accelerates optic nerve regeneration in the adult zebrafish. Glia. 69 (6), 1444-1463 (2021).
  49. Conedera, F. M., Pousa, A. M. Q., Mercader, N., Tschopp, M., Enzmann, V. Retinal microglia signaling affects müller cell behavior in the zebrafish following laser injury induction. Glia. 67 (6), 1150-1166 (2019).
  50. Chen, S., Lathrop, K. L., Kuwajima, T., Gross, J. M. Retinal ganglion cell survival after severe optic nerve injury is modulated by crosstalk between jak/stat signaling and innate immune responses in the zebrafish retina. Development. 149 (8), (2022).
  51. de Preux Charles, A. S., Bise, T., Baier, F., Marro, J., Jaźwińska, A. Distinct effects of inflammation on preconditioning and regeneration of the adult zebrafish heart. Open Biology. 6 (7), 160102 (2016).

Tags

Биология выпуск 181 рыбки данио пигментный эпителий сетчатки нитроредуктаза метронидазол генетическая абляция регенерация пигментация фармакологические соединения RpEGEN
Нитроредуктаза/метронидазол-опосредованная абляция и платформа MATLAB (RpEGEN) для изучения регенерации пигментного эпителия сетчатки рыбок данио
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Leach, L. L., Fisher, G. B., Gross,… More

Leach, L. L., Fisher, G. B., Gross, J. M. Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (181), e63658, doi:10.3791/63658 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter