Summary
このプロトコルは、トランスジェニックゼブラフィッシュモデルを用いて網膜色素上皮(RPE)を遺伝的にアブレーションする方法論を記載している。薬理学的化合物を用いたシグナル伝達経路調節を組み込むようにプロトコルを適応させることは、広範囲に詳述されている。色素沈着に基づいてRPE再生を定量化するためのMATLABプラットフォームが開発され、提示され、議論される。
Abstract
網膜色素上皮(RPE)は、眼の後ろに存在し、隣接する網膜および血管組織の健康と完全性を維持するために不可欠な機能を果たす。現在、哺乳類RPEの修復能力は小さく、小さな傷害に限定されているため、 in vivoRPE 再生プロセスの理解が進んでいません。ここでは、堅牢な組織再生が可能な脊椎動物モデルであるゼブラフィッシュを利用した in vivo RPE修復の研究を容易にするために詳細な方法論が提供される。このプロトコルは、トランスジェニックニトロレダクターゼ/メトロニダゾール(NTR/MTZ)媒介性傷害パラダイム(rpe65a:nfsB-eGFP)を記述しており、MTZによる24時間治療後にRPEの中央3分の2がアブレーションされ、その後の組織が回復する。ゼブラフィッシュの幼虫におけるRPEアブレーションに焦点が当てられ、RPE再生に対する薬理学的化合物の効果をテストするための方法も概説されている。色素沈着に基づくRPE再生の定量化を自動化するために作成されたMATLABスクリプトであるRpEGENの生成と検証についても説明します。能動的RPE修復機構を超えて、このプロトコルは、RPE変性および傷害応答の研究、ならびに隣接する網膜および血管組織に対するRPE損傷の影響、とりわけ他の細胞および分子プロセスの研究に拡張することができる。このゼブラフィッシュシステムは、RPE再生およびRPE疾患関連メカニズムを駆動する遺伝子、ネットワーク、およびプロセスの同定において大きな可能性を秘めており、この知識を哺乳類系に適用し、最終的には治療開発に応用するという長期的な目標を掲げています。
Introduction
本明細書に記載の方法論は、ゼブラフィッシュの幼虫を利用して網膜色素上皮(RPE)を遺伝的にアブレーションするためのプロトコールを詳述する。RPEは眼の後ろに延び、神経網膜の層状層と脈絡膜を構成する血管系の層の間に存在する。栄養サポート、光毒性光の吸収、および視覚サイクルタンパク質の維持は、RPEが果たす重要な機能の一部に過ぎず、これらの隣接組織の健康および完全性を維持するために不可欠である1。哺乳類RPEへの損傷は、病変が小さい場合に回復可能である2;しかし、より大きな傷害または進行性変性疾患によって被る損傷は不可逆的である。ヒトでは、RPE変性疾患(加齢黄斑変性症(AMD)やスターガルト病など)は、永久的な視力喪失をもたらし、利用可能な治療選択肢がほとんどなく、患者の生活の質を低下させる。哺乳類のRPEが自己修復する能力が限られているため、RPE再生プロセスの分野で知識のギャップが生じています。多くの異なる組織タイプにわたるゼブラフィッシュの堅牢な再生能力を考慮して、このプロトコルは、本質的に再生RPEに関する研究を容易にし、その応答を駆動するメカニズムを明らかにするために 、in vivo 脊椎動物システムを確立するために開発されました。ここで概説したアブレーションパラダイムを用いて、標準的なWntシグナル伝達経路3、mTOR経路4、および免疫関連応答5 が、RPE再生の重要なメディエーターとして同定され、重複する機能を有する可能性が高い。
この遺伝子アブレーションパラダイムにおいて、Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3ゼブラフィッシュは、RPEエンハンサーエレメントrpe65a7の制御下でeGFPに融合した細菌由来ニトロレダクターゼ(NTR/nfsB)遺伝子6を発現する。アブレーションは、プロドラッグであるメトロニダゾール(MTZ)をゼブラフィッシュを収容する系水に添加することによって達成される。ニトロレダクターゼによるMTZの細胞内活性化は、NTR/nfsB発現細胞においてDNA架橋およびアポトーシスをもたらす8,9。この技術は、網膜10、11、12、13および他の組織8の細胞をアブレーションするためにゼブラフィッシュにおいて広く使用されている。これらの要素を組み合わせることで、誘導性細胞アブレーション法(NTR/MTZ)8,9の標的発現(rpe65a)と蛍光マーカー(eGFP)を可視化することができます。
RPE14の再生可能性を研究するために使用できる他の興味深いインビボモデルも存在する。これらは広範であり、両生類における網膜切除術後のRPEから網膜への分化転換を含み、網膜再増殖によって失われたRPE細胞が置き換えられる15,16;「スーパーヒーリング」MRL/MpJマウスにおける損傷後のRPE回復17;とりわけ、自発的RPEおよび網膜変性のラットモデルにおけるRPE増殖の外因性刺激18が挙げられる。成体ヒトRPE幹細胞(RPESC)19などのインビトロモデルも開発されている。これらのモデルはすべて、RPE再生に関連する細胞プロセス(例えば、増殖、分化など)を明らかにするのに役立つ貴重なツールです。しかし、ゼブラフィッシュは、アブレーション後の固有のRPE修復能力においてユニークです。
ここでの方法論はRPE再生を駆動するメカニズムの理解に焦点を当てるために書かれていますが、 Tg(rpe65a:nfsB-eGFP) ラインとこの遺伝子アブレーションプロトコルは、RPEアポトーシス、RPE変性、および隣接する網膜および血管組織に対するRPE損傷の影響などの他の細胞プロセスを研究するために利用することができます。アブレーションプロトコルはまた、薬理学的操作を含むように改変することもでき、これは、目的のシグナル伝達経路をスクリーニングするための便利な予備的戦略である。例えば、Wnt応答−1の阻害剤(IWR−1)20を用いて標準的なWnt経路を遮断することは、RPE再生3を損なうことが示されている。これは、薬理学的操作実験を通してユーザーを導き、色素沈着の回復に基づいてRPE再生を定量化するために作成されたMATLABスクリプト(RpEGEN)を検証するための概念実証として機能するためにここで繰り返されました。トランスジェニックラインおよびアブレーションプロトコルと同様に、RpEGENスクリプトは適応性があり、RPE内の他のマーカー/細胞プロセスを定量するために使用できます。
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Protocol
ここに概説されているすべての方法論は、ピッツバーグ大学の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)に準拠しています。
1. ゼブラフィッシュ胚採取前の準備
- 胚培養器を28.5°Cに設定します。
- メラニン生成阻害剤であるN-フェニルチオ尿素(PTU)21,22の25倍の原液を調製する。この原液は、一般的なレシピ22からスケーリングされ、1xは、体積当たり0.003%重量(%w / v)に等しい(例えば、0.003gのPTU粉末を100mLの液体溶媒に入れる)。
- 大きな25xPTU原液を作るには、精製脱イオン水1LにPTU粉末0.75g(以下、dH2Oと記す)を加え、攪拌子と攪拌板を用いて室温(~25°C)で十分に混合する。光から保護され、最大3ヶ月間4°Cで保管してください。
注:PTUを水溶液に入れることは困難であり、一晩の長時間の攪拌が必要な場合があります。
注意: PTUは危険であり、摂取、吸入、および/または皮膚や目との接触を防ぐために注意する必要があります。PTU粉末および本明細書に記載されるすべてのPTU液体誘導体は、州および機関の規制に応じて化学廃棄物として処分される必要があるかもしれない。PTU廃棄物処理方法がある場合は、使用前に適切な方法を確認することをお勧めします。 - 1.5x PTU作業液(以下、1.5x PTU)を作るには、ゼブラフィッシュ収容施設用水940mL(以下、システム水)に25x PTU原液60mLを加えます。ゼブラフィッシュの最適な水質パラメータは23 で説明されており、水生施設には標準的な水監視手順が整備されている必要があります。1.5x PTUを28.5°Cで1〜2週間光から保護して保管してください。
メモ: このプロトコルは、ステップ 1.2 で説明した PTU 濃度、溶媒、および保存パラメータを使用して日常的に実行されます。予防措置として、PTUにいる間、胚/幼虫を1〜2日ごとに観察して、有効性を検証し、持続的な色素沈着を確認する必要があります。溶解および/または保存条件は、PTU溶解度/有効性の低下が疑われる場合、最適化されるべきである。
- 大きな25xPTU原液を作るには、精製脱イオン水1LにPTU粉末0.75g(以下、dH2Oと記す)を加え、攪拌子と攪拌板を用いて室温(~25°C)で十分に混合する。光から保護され、最大3ヶ月間4°Cで保管してください。
- dH2O100mLにメチレンブルー粉末0.05gを加えて、真菌増殖抑制剤であるメチレンブルー0.05%w/vの原液を調製し、攪拌子及び攪拌板を用いて十分に混合する。4°Cで保存してください。
- ダイヤモンドチップスクライブペンを使用してガラスパスツールピペットのテーパーエンドを切断して、胚/幼虫操作(例えば、ペトリ皿間で胚/幼虫を移動する、蛍光スクリーニング中に幼虫を分離する、固定のために安楽死させた幼虫を微量遠心チューブに集めるなど)用のピペットを準備します。ダイヤモンドペンでピペットの周囲をエッチングし、端を軽く引っ張るかカチッと音を立ててきれいに壊します。
注:ピペットの口は、剪断することなく絨毛膜の内側にある胚を簡単に取り込むのに十分なほど滑らかで広くなければなりません。代替として電球ドロー転送ピペットを使用してください。調製されたピペットは、胚/幼虫の損失を最小限に抑えるために、水交換中に(注ぐのではなく)液体を除去するためにも使用できます。 - 1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液を調製する(例えば、10mLの16%PFAを4mLの10x PBSおよび26mLのdH2Oに加える)。4°Cで最大4週間、光から保護して保管してください。
警告: パラホルムアルデヒドは危険な化学物質であり、化学ヒュームフード内で取り扱い、適切に廃棄してください。摂取、吸入、および/または皮膚や目との接触を防ぐために、注意を払い、個人用保護具(PPE)を着用する必要があります。
2.遺伝子切除前のゼブラフィッシュ胚の収集と維持(受精後0〜5日)
- 前述のように成体のゼブラフィッシュを維持する 3,4,5.胚収集の前の午後/夕方、成体のゼブラフィッシュを繁殖タンクに分けて産卵させます。
- 翌朝(受精後0日(dpf))、胚をシステム水中の直径10cmのペトリ皿に集め、不透明に見える、および/または不規則な細胞質および切断の失敗を示す生存不能または未受精卵をすべて除去する24。
注:正常な切断および発生ステージング事象は、25に記載されるように健康な胚において明らかであろう。ペトリ皿は、プロトコル全体を通して4分の3(直径10cmの皿の場合は〜30mL)をいっぱいに保たなければなりません。- 各ペトリ皿に0.05%w/vメチレンブルーを2滴加え、穏やかに混ぜ合わせ、残りのプロトコルで胚を28.5°Cで保存します。
- 受精後約6時間(hpf)4,5,26で、胚ペトリ皿のシステム水を1.5x PTU(ステップ1.2.2で作られた作業溶液)で置き換え、メチレンブルーを補充する。
注:PTU 21の添加時に既に色素沈着した組織は脱色素化しないため、色素沈着の開始前(すなわち、24馬力前)25にPTUを胚に添加しなければならない。しかしながら、眼の大きさの減少、眼および頭蓋顔面の欠損、およびいくつかのシグナル伝達経路の破壊(例えば、甲状腺シグナル伝達)がPTU処置ゼブラフィッシュにおいて報告されていることに留意すべきである27、28、29。PTUの発生毒性は、PTU添加の濃度およびタイミングに依存するようである27、29。PTUの有効性を検証するために上で述べたように(ステップ1.2)、PTU毒性の徴候も注意深く監視し、疑わしい場合は、PTU添加の作業濃度および/または時間を最適化する必要があります。 - 2〜3dpf上で、新たに作製されたプロナーゼ溶液を用いて胚を脱絨毛する。
- ボルテックス処理により、プロナーゼを1.5x PTUに2mg/mLの濃度で溶解させる。
警告: プロナーゼは非常に微粉末として包装されており、刺激物です。吸入や皮膚、目などとの接触を避けるための対策を講じる。 - 孵化した胚を孵化していない胚から分離し、孵化していない胚のみをプロナーゼ処理する。
- 1.5x PTUをステップ2.4.1で作成した2mg/mLのプロナーゼ溶液と交換し、孵化していない胚の上に穏やかな攪拌(例えば、卓上回転子/振とう機上または手動旋回)で4〜5分間放置する。
- プロナーゼ溶液を注ぎ、すぐに新鮮な1.5x PTUですすいでください。1.5倍のPTUを穏やかに粉砕し、球根引き転写ピペットで胚をすすいでください。
- 2回目の1.5x PTUリンスを繰り返してすべての絨毛膜破片を捨て、メンテナンスのために1.5x PTUを補充します。
注:胚は、先端の細かい鉗子を使用して手動で絨毛を切除することもできます。この場合、絨毛膜の破片を除去し、手動の絨毛除去後に1.5倍のPTUを補充する必要があります。
- ボルテックス処理により、プロナーゼを1.5x PTUに2mg/mLの濃度で溶解させる。
- 胚/幼虫の健康状態を監視し、1〜2日ごとに1.5倍のPTUを補充する。胚/幼虫は、5dpfでアブレーションされるまで1.5倍のPTUに保持される。
注: ステップ 2.3 および 2.4 の重要性については、「ディスカッション」セクションで詳しく説明します。
3. ゼブラフィッシュ幼虫の rpe65a:nfsB-eGFPのスクリーニングと網膜色素上皮の遺伝子切除(受精後5~6日)
- 新鮮な10mMメトロニダゾール(MTZ)溶液を5dpf(アブレーションの日)で作る。このプロセスは完了するまでに2時間かかります。
- PTUを含まないシステム水にMTZ粉末を加え、37°Cで1時間激しく振とう(例えば、毎分250回転)することによって十分に混合する。
- 卓上回転子/シェーカー上で10mM MTZ溶液を室温でさらに1時間冷却し、幼虫でペトリ皿に加える前に完全な溶解を確実にする。
注:eGFP+ 幼虫の蛍光スクリーニングおよび分離(ステップ3.2)は、37°Cおよび室温のインキュベーション中に行うことができる。
警告: MTZ は危険であり、摂取、吸入、および/または皮膚や目との接触を防ぐように注意する必要があります。MTZ粉末および本明細書に記載されるすべての液体誘導体は、州および機関の規制に応じて化学廃棄物として処分する必要があるかもしれない。MTZ廃棄物処理方法がある場合は、使用前に確認することをお勧めします。
- ゼブラフィッシュの幼虫を rpe65a:nfsB-eGFP導入遺伝子用にスクリーニングする。
- 0.168 g/Lのトリカイン(MS-222)で幼虫を麻酔し、488nm励起レーザー/フィルターを備えた蛍光実体顕微鏡を用いて、トランスジェニック(eGFP+)幼虫(図1)を非トランスジェニック(eGFP−)幼虫から分離する。
注:幼虫はeGFPのスクリーニング中も治療に没頭したままにしておく必要があるため、トリカインを1.5x PTUおよび/または薬理学的化合物溶液に添加する必要があります。スクリーニングの期間中のみ、幼虫をトリカイン中で孵化させる(例えば、50匹の幼虫を含む単一の10cmペトリ皿に対して≤10分間)。 - スクリーニングされた幼虫を、トリカインを含まない新鮮な1.5倍のPTUを含むペトリ皿に直接ピペッティングすることによって直ちに起こす。
- スクリーニングが完了したら、eGFP+幼虫をさらに2つのペトリ皿のグループに分ける:MTZ処置を受ける1つのグループ(アブレーション/MTZ+)およびアブレーションなし(MTZ−)対照である1つのグループ。
- 0.168 g/Lのトリカイン(MS-222)で幼虫を麻酔し、488nm励起レーザー/フィルターを備えた蛍光実体顕微鏡を用いて、トランスジェニック(eGFP+)幼虫(図1)を非トランスジェニック(eGFP−)幼虫から分離する。
- 網膜色素上皮をアブレーションする。
- アブレーションされていない(MTZ-)コントロールディッシュから1.5倍のPTUを取り出し、PTUなしで新鮮なシステム水を追加します。
- アブレーション(MTZ +)処理皿から1.5倍のPTUを取り出し、作りたての10mM MTZ溶液を加えます(ステップ3.1)。
- 10 mM MTZ 溶液をちょうど 24 時間後 (傷害後 1 日(dpi)と指定)で除去し、PTU なしで淡いシステム水を追加します。MTZ- 皿のPTUなしで新鮮なシステム水を交換してください。幼虫は、プロトコルの残りの部分で再びPTUに曝露されることはない。
注:動物が活発に泳いでいるので、幼虫の損失なしに溶液交換の間にすべての1.5x PTU(ステップ3.3.1および3.3.2)または10mM MTZ(ステップ3.3.3)をピペットまたは注ぎ取ることは難しいかもしれません。この場合、PTUを使用しないシステム水の洗浄を追加して、溶液交換を成功させることができます。
4.遺伝的アブレーション後の幼虫維持(受精後6日以上)
- 幼虫をチェックし、安楽死(ステップ5.6)までPTUなしで毎日システム水を補充するか、ゼブラフィッシュの飼育施設に戻ります。
- 実体顕微鏡上の透過光照明を用いて、2dpi( 7dpf)上のインビボでの アブレーションの成功と程度をモニターする(図2)。
5. ゼブラフィッシュ網膜色素上皮アブレーションプロトコールへの薬理学的治療の組み込み
注:以前に行ったように、3、15μM IWR-1または4dpfから始まる体積整合ジメチルスルホキシド(DMSO)ビヒクルコントロールによる処理は、RpEGENを試験するための実験例として概説されています。濃度およびタイムラインは薬理学的化合物によって異なる場合があり、用量反応検証、治療期間、スクリーニング、および薬理学的操作研究のための実験計画の他の側面に関する推奨事項については、ディスカッションセクションで説明します。画像解析が必要な場合は、手順 6 と 7 に従います。
- ステップ2で説明したように胚を収集して維持する。2 dpf上のデコリオネート胚。
- ステップ3.2で説明されているように、4 dpfでeGFP+ 幼虫をスクリーニングする。ペトリ皿ではなく、薬理学的治療のために、eGFP+ 幼虫を6ウェルあたりn≤10幼虫の密度で6ウェルプレートに入れる。アブレーションされない幼虫(MTZ−)とアブレーションされる幼虫(MTZ+)のための別々の6ウェルプレートを指定する。
メモ: eGFP 信号は 4 dpf で見ることができますが、5 dpf の信号強度よりも暗く見えます。 - 4 dpf eGFP+ 幼虫を 15 μM IWR-1 または容積適合 DMSO ビヒクルコントロールで 10 mM MTZ 溶液で遺伝子アブレーションする前に正確に 24 時間前処理します。
注:多くの場合、薬理学的治療実験にはほとんど化合物は必要ありません。少量のIWR-1粉末の計量を避けるために、この薬理学的化合物は、DMSO溶液中で25mMの濃度で既に購入され、到着時により少ない容量に小分けされ、凍結融解サイクルの繰り返しを避ける。- 必要な薬理学的およびビヒクル制御治療の量を決定し、それに応じて1.5倍のPTUを円錐形チューブにアリコートします。6ウェルプレートの容量が5mL/ウェルです。
- IWR-1ストックを1.5x PTUに加え、最終濃度15 μM IWR-1(例えば、1.5x PTUの5 mLあたり3 μLの25 mM IWR-1)にする。一致した量のDMSOストックを1.5x PTUに加える(例えば、1.5x PTUの5mLあたり3μL≥99.7%DMSOを含む)。ここで、これは0.06%の体積/体積(% v/v)DMSOの最終濃度をもたらすことになる。ボルテックス処理によりよく混合し、化合物の溶解を目視で確認する。
注意:DMSO、IWR-1、およびその他の薬理学的化合物および溶媒は、州および機関の規制によっては、化学廃棄物として処分する必要がある場合があります。これらの化合物の危険レベルと適切な廃棄物処理方法(もしあれば)を、使用前に確認することをお勧めします。 - 6ウェルプレートのeGFP+ 幼虫から1.5x PTUを除去し、ステップ5.3.2から新たに作製した0.06% v/v DMSOまたは15μM IWR-1処理を5mL/ウェル加える。
- 5 dpf で、RPE をアブレーションします。24時間前処理(ステップ5.3)に加えて、幼虫は、10mM MTZによる24時間の遺伝子アブレーションの間およびアブレーション後の回収中、固定まで(例えば、4〜9dpfから)薬理学的およびビヒクルコントロール治療に浸漬されたままである。
- 遺伝子アブレーションを行う2時間前に10mM MTZ溶液を作る(ステップ3.1)。
- 非アブレーション(MTZ-)およびアブレーション(MTZ+)6ウェルプレートの両方に必要な薬理学的およびビヒクルコントロール治療の量を決定し、PTU(MTZ-)または10mM MTZ溶液(MTZ+)を含まない淡水のいずれかの適切な容量を円錐形チューブにアリコートします。これにより、4つの処理条件が得られます:1)0.06%v / v DMSO、MTZ - ;2) 15μM IWR-1, MTZ-;3) 0.06% v/v DMSO, MTZ+;4) 15 μM IWR-1, MTZ+.
- IWR-1 および DMSO ストック溶液を、ステップ 5.3.2 で実行したように、それぞれの円錐管に追加します。ボルテックス処理によりよく混合し、化合物の溶解を目視で確認する。
- 指定された非アブレーション(MTZ-)およびアブレーション(MTZ+)6ウェルプレートから、1.5x PTU(ステップ5.3.2)の0.06%v/v DMSOおよび15μM IWR-1処理を除去し、ステップ5.4.3で行った適切な処理を補充します。
- 10 mM MTZ 溶液中の 0.06% v/v DMSO および 15 μM IWR-1 処理を 24 時間後に除去し、PTU を含まない淡水で処理を補充します。0.06% v/v DMSOおよび15 μM IWR-1処理を、アブレーションされていない(MTZ-)6ウェルプレート上のPTUを含まない淡水に補充します。
- ステップ4で概説したアブレーション後の幼虫維持に従い、PTUを含まないシステム水に毎日0.06% v/v DMSOまたは15μM IWR-1処理を補充します。
- 動物を0.3 g/Lのトリカイン溶液(致死的な過剰摂取)に浸し、急速冷却(例えば 、ペトリ皿を氷の上に置く)を少なくとも20分間30分間行うことによって、9dpf(年齢が一致したMTZ処理兄弟の場合は4dpi)で幼虫を安楽死させる。幼虫が触って触ることに反応しないことを確認し、室温または4°Cで一晩3時間(ステップ1.5)固定する。
- zスタック画像取得のための固定後幼虫組織を、前述のように共焦点顕微鏡上で処理する5、31 およびここの代表結果のセクションで説明した。ステップ6および7の分析では、少なくとも核マーカー(DAPIなど)および明視野zスタック画像の取得が必要となる。
6. フィジーにおける共焦点顕微鏡zスタック画像前処理(ImageJ)
- FIJI32を使用して共焦点顕微鏡zスタック画像をインポートしてフォーマットします。
- [ バイオフォーマットのインポートオプション ]で[スタックの表示方法]に設定された[ ハイパースタック ]および[ カラーモード:グレースケール]を使用して顕微鏡画像を開きます。
- 「画像」を選択して、インポートした顕微鏡画像の最大強度投影を生成|スタック|Z プロジェクト。「ZProjection」ウィンドウで、「スライスの開始」と「スライスの停止」を設定して、そのイメージのすべてのスライスを含めます。たとえば、合計 18 個のスライスを持つ Z スタックに対して、「スライスの開始: 1」と「スライスの停止: 18」を設定します。投影タイプ:最大強度を選択し、[OK]をクリックします。
- 「画像」を選択して、最大強度投影ファイルを 8 ビット画像(まだ変換していない場合) |タイプ |8 ビット。
- [画像]を選択して、背側が上向きで遠位(つまり、レンズ)が残るように画像の向き を変え|変換|「水平方向に反転」( 最後のコマンドでは、その画像に必要な方向性に最も適したオプションを選択します)。マルチチャンネル画像の場合は、プロセススタックで [はい ]をクリックします か? ウィンドウは、すべてのチャンネルの向きを変更します。
注: この手順は重要ですが、画像が既に背側上、遠位左向きになっている場合は不要です。処理のために正しい方向にある目を持つ画像については、図3A-Dおよび図4を参照してください。 - 「ファイル」を選択して、8 ビットの最大強度投影をタグ付き画像ファイル形式 (TIF) ファイルとして保存 ||として保存ティフ...。
- FIJIを使用してRPE関心領域(ROI)を生成します。
- 手順 6.1 の説明に従って生成された 8 ビットの TIF イメージを開きます。ROI マネージャを起動して、[ |の分析] を選択します。ツールの|ROI マネージャー。
- 画像|を使用するDAPI チャンネルと明視野チャンネルをズームおよび切り替えて、RPE の頂端側が外側制限膜 (OLM) の先端に隣接する点を特定します (図 3B'、B"、D'、D"、青い矢印)。この解剖学的ランドマークをROIの出発点として使用します。
- DAPIと明視野の両方の画像チャンネルとズーム機能を使用して、ポリゴン選択ツール(FIJIツールバー内)でRPE ROIを作成します(画像|ズーム)を使用して、頂端と基底RPEの境界を特定します。ROIの背側端と腹側端(すなわち、ROIがRPEの頂端から基底側に移行する場所)を、鈍くしたり丸めたりするのではなく、鋭い点に持っていきます(図3B'、B"、D'、D";マゼンタ線)。
注: ポイントされた ROI エンドの作成は、RpEGEN を使用してエンドポイント検出を最適化するための重要な手順であり、「ディスカッション」セクションで説明します。 - ROI マネージャの [ 追加 ] をクリックして、ROI を追加します。必要に応じてROIを調整し、ROIマネージャの[ 更新 ]をクリックします。
- [その他] を選択して ROI ファイルを保存 >> |セーブ。。。 ROIマネージャ内。一致した ROI イメージ ファイルと TIF イメージ ファイル ([ファイル名].tif と [ファイル名].roi など) には同じ名前を使用します。
- 各条件の 8 ビット TIF ファイルと ROI ファイルを 1 つのフォルダーに結合します。たとえば、 DMSO_9dpfのフォルダには、9 dpf unablated (MTZ-) 0.06% v/v DMSO 処理幼虫群の一致した TIF ファイルと ROI ファイルがすべて含まれます。
7. RpEGENスクリプトを用いたRPE再生の定量化と可視化
- RpEGEN スクリプトをインストールして準備します。
- GitHubリポジトリ(https://github.com/burchfisher/RpEGEN)から最新のRpEGENスクリプトをダウンロードするには、[コード|]をクリックします。 ZIPをダウンロードしてください。
- フォルダを解凍し、目的のワークスペースの場所(デスクトップなど)に配置します。
- MATLAB を開きます。
- [現在のフォルダ]ペイン(通常は左側)で RpEGENフォルダ に移動します。
- RpEGENフォルダを右クリックし、[パスに追加]|選択します。選択したフォルダとサブフォルダ。これにより、フォルダーが MATLAB パスに追加され、フォルダー内のスクリプトを自動的に検索して実行できるようになります。
- [現在のフォルダ]ペインで RpEGEN フォルダをダブルクリックすると、すべてのサブ フォルダ とM個のファイルが表示されます。
- RpEGEN.mファイルをダブルクリックして、[エディタ]ペインで開きます。
- RpEGEN.m ファイルの [ユーザー定義変数 ] セクションで、ROI ファイル (.ROI)、イメージ ファイル (.tif)、および出力ファイルの保存場所を含むフォルダーのディレクトリの場所を入力します。エクスポートする .mat ファイルのグループ名 (DMSO_9dpf、DMSO_4dpiなど) と、TIF イメージスタック内の明視野チャンネルの位置 (たとえば、ブライトフィールドが画像スタックの 3 番目のチャンネルの場合は 3) を入力します。画像ファイルに明視野画像のみが含まれている場合は、1 に等しくなければなりません。
- RpEGEN.m スクリプトを実行し、結果を検証します。
メモ: RpEGEN を実行するには、画像処理ツールボックス、カーブフィッティングツールボックス、および統計および機械学習ツールボックスをユーザー MATLAB ライセンスでアクティブ化する必要があります。さらに、FIJI ROIをMATLAB にインポートするには、無料で利用可能なReadImageJROIツールボックス33が必要です。ただし、RpEGEN フォルダには、アクティブ化を必要としない他の関数 M ファイルと共に用意されています。- MATLAB の上部にある [エディター] メニューの [実行] ボタンをクリックしてスクリプトを実行します。
注: 開始されると、 コマンド ウィンドウにスクリプトの進行状況を示す詳細な出力が表示されます。抽出されたデータを含むMATファイルを保存すると、3パネルの図が表示され、各画像実行の出力ディレクトリにPDFとして保存されます。これらは、すべてが適切に実行されていることを確認するための品質管理(QC)の数値であり、1)ROIによってオーバーレイされた明視野画像(図4A)が含まれます。2)中心線および関連する角度距離(度)を有するROI(図4G)。3)中心線中央値強度値(0〜255、8ビットカラースケール)を有するROIを有する(図4H)。QC PDFが出力フォルダに保存され、最後の図が消えるまで待ってから、次の手順に進みます。 - 出力フォルダに書き出された個々のPDFを任意のPDFビューアで開き、すべてのROIが明視野画像と一致すること、中心線値がROIの中心の妥当な近似値であること、および中央値強度値にデータが適切に設定されていることを確認します(つまり、中心線全体ですべて同じ値ではない)。
メモ: RpEGEN.m によって MAT ファイルに保存された各変数の詳細な説明と構造については、 表 1 を参照してください。
- MATLAB の上部にある [エディター] メニューの [実行] ボタンをクリックしてスクリプトを実行します。
- RpEGEN_PermPlot.m スクリプトを実行します。
注: RpEGEN_PermPlot.m スクリプトは、RpEGEN.m の出力を使用して、2 つのグループの中央値の順列シミュレーションを使用して統計的比較を実行し、また、RpEGEN フォルダーに含まれている、無料で入手できる GRAMM ツールボックス34 を使用して、このホワイト ペーパーのプロットを再現するためのコードも提供します。- RpEGEN_PermPlot.mファイルをダブルクリックして、新しいエディタタブで開きます。
- セクション 1 - RpEGEN_PermPlot.m ファイルの ユーザー定義変数 で、RpEGEN.m を実行してから MAT ファイルを含む出力フォルダーのディレクトリの場所を入力し、ロードする各 MAT ファイル名 (DMSO_4dpi.mat、IWR1_4dpi.mat など) を入力します。
- スクリプトのこのセクションを実行するには、MATLAB の上部にある [エディター] メニューの [セクションの実行] ボタンをクリックします。
- セクション2で、統計的比較のために2つのグループの名前をdata_A変数とdata_B変数に入力します(これらは順列シミュレーションを使用して中央値が導出されるグループです)。bin_sz 変数に、データセットの強度の中央値を積分する度数を入力します (デフォルトは 1 度のビンです)。
メモ: reps 変数は、確率分布の構築に使用する順列の数を示し、任意の数に設定できます (デフォルト値は 20,000)。一般に、繰り返し回数が多いほど統計的に堅牢になりますが、処理時間は長くなります。 - スクリプトのこのセクションを実行するには、MATLAB の上部にある [エディター] メニューの [セクションの実行] ボタンをクリックします。このセクションは、指定された繰り返しの数によっては完了するまでに時間がかかる場合がありますが、コマンド ウィンドウで継続的に状態を更新します。
- ヒート マップ図 セクションと グループ結果セクションとP値 セクションを個別に実行し、[ セクションの実行] ボタンを使用します。「ここにデータを入力」とコメントされたセクションのデータ変数を編集します。これらの図のPDFは、それぞれについて自動的に保存され、任意のベクトルソフトウェアの後処理で簡単に変更することができます。
注: RpEGEN_PermPlot.m ファイルで生成されるプロットは アドホック であり、各ユーザーの特定のデータと視覚化のニーズに基づいて変更が必要になる可能性があります。しかし、この数字は、MATLABとGRAMMの両方のWebサイトを使用して簡単に個別化できる強固な基盤を提供します。
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Representative Results
標準的なWntシグナル伝達経路を阻害することは、プロトコル3に記載されている遺伝子アブレーションパラダイム(rpe65a:nfsB-eGFP)および薬理学的操作方法論(IWR-1)を用いたゼブラフィッシュRPE再生を著しく損なうことが知られている。色素沈着に基づいてゼブラフィッシュRPE再生を定量するための自動化された方法を検証するために、この実験をここで繰り返した。以下に要約した結果は、受精日(0dpf)からRpEGENを用いたRPE再生の定量化まで、プロトコルのすべてのステップを網羅していた。
ゼブラフィッシュの幼虫におけるRPEアブレーションプロトコル(薬理学的操作を伴う)の実施
3つの別々の親群(N = 3)から採取された胚は、6 hpf付近で1.5x PTUによる処理を開始し、RPEおよび表面メラノサイトにおける色素沈着の不在が1dpfで目視で確認された。胚を、2mg/mLのプロナーゼを用いて2dpf上で酵素的に脱絢した(ステップ2.4)。4dpf上で、幼虫をトリカイン(MS-222)を用いて麻酔し、蛍光実体顕微鏡を用いてeGFPについてスクリーニングした(ステップ3.2および5.2)。eGFP+ 幼虫を6ウェルプレート(n = 10幼虫/ウェル)に移動させ、0.06%v/v DMSO(ビヒクルコントロール)または15μM IWR-1(ステップ5.3)のいずれかで処理した。ここで報告された幼虫密度は、当初、1幼虫/cm2 の成長面積の近似に基づいており、時間の経過とともに慎重な健康モニタリング(例えば、水泳膀胱の発達)によって検証された。eGFPの強度は4dpfで薄暗く見えたので、幼虫を5dpfで再スクリーニングして明るいeGFP発現を確認した(図1)。RPE65(ゼブラフィッシュではrpe65a)は成熟RPE7 のマーカーであり、テレオスト魚では、網膜およびRPE細胞は、レンズ35に隣接する網膜の遠位先端にある幹細胞ニッチである毛様体辺縁帯(CMZ)から連続的に生成される。したがって、 rpe65a:nfsB-eGFPトランスジェニックラインでは、より未成熟なRPEが周囲に存在し、eGFP− (全RPE組織の約3分の1)に現れるが、成熟した中央のRPEの3分の2はeGFPを表す(図1B;白い矢印)。導入遺伝子は松果体でも見え(図1A;黄色の矢印)、 rpe65a がゼブラフィッシュ36における松果体発現を示すと予想された。比較的薄暗いまたはeGFP− 幼虫を6ウェルプレートから引き抜き、5dpfで安楽死させた。DMSOまたはIWR-1による処理後正確に24時間で、5dpf幼虫を10mM MTZで処理してRPEをアブレーションした(ステップ3.1、3.3、および5.4)。MTZは、RPE再生が行われるように、正確に24時間後(すなわち、6dpf/1dpi上)に洗い流された。
幼虫は、6dpf/1dpiから9dpf/4dpiの安楽死時までの透過光照明を用いて、実体顕微鏡で毎日観察した。遺伝子アブレーションの成功は、7dpf MTZ-対照兄弟(図2A)と比較して、MTZ+幼虫(図2B;赤い矢じり)の眼の中央3分の2に色素がないことによって、2dpiのインビボで確認された(ステップ4.2)。予想通り、2dpi上の色素を欠く領域は、5dpfで観察されたrpe65a:nfsB-eGFP導入遺伝子発現の領域に類似しているように見えた(図1B)。評価は2dpiで行われ、RPEはPTUの除去後に再色素沈着を受け、インビボでの観察時間によっては、アブレーションされた中央RPEとスペア(アブレーションされていない)末梢RPEとの間の顕著な差は、後者が完全に再着色されていない場合、識別が困難な場合がある。巨視的な曖昧さの可能性にもかかわらず、1dpiでのRPEアブレーションは、切片組織において容易に明らかであることが以前に示されており、細胞死(ピクトーシス核)の証拠とともに、中枢RPEおよび外顆粒層(ONL;すなわち、光受容体)組織の完全性の喪失を明らかにした(図5)3。組織喪失とは対照的に、rpe65a:nfsB-eGFPゼブラフィッシュモデル3において、組織再生中の重要な促進因子として、ロバストな増殖が決定された。両方の初期のアポトーシス応答は、RPEアブレーションが隣接する組織(例えば、光受容体およびブルッフ膜;図6A−C)、およびそれに続く末梢から中央への増殖応答は、損傷部位に内側に移動する不均一な再生「ゾーン」(図6D−F)をもたらし、広範囲に特徴付けられ、以前に議論されている3。
RpEGENを用いたRPE色素沈着に基づく自動定量化のための組織調製、共焦点画像取得、画像前処理
9dpf/4dpiで、DMSOおよびIWR-1処理幼虫をトリカイン過剰摂取により安楽死させ、室温で3時間4%PFA中で固定した(ステップ5.6)。各独立した親群から4匹の幼虫を、その後の組織処理のために無作為に選択した(N=3;n=12匹の幼虫を処置につき)。凍結保護、凍結切除(厚さ12μm)、DAPIによる核対比染色、およびカバースリップ取り付けを、ステップ5.7 5、31で参照されるように実施した。各幼虫の視神経が見える中央部を、40倍油浸対物レンズ(開口数=1.30)を用いて共焦点レーザー走査顕微鏡で撮像し、1μmのzステップ間隔で512×512ピクセルのzスタック画像を取得しました。各画像には、DAPIのチャンネル1 = 405 nm励起、eGFPのチャンネル2 = 488 nm励起、チャンネル3 = 明視野の透過光の3つのチャンネルからのデータが含まれていました。明視野画像でピクセル強度を定量化するため、透過光ランプの電圧設定を一定に保ち、統計的比較のために収集されたすべてのデータを同日に画像化しました。
共焦点顕微鏡zスタック画像は、FIJIを使用して、ステップ6で説明したように自動定量化のために前処理された。画像は、組織がROI生成を困難にするような方法で損なわれた場合(例えば、引き裂き(図 7A;マゼンタの矢印)またはランドマークの障害物(図 7B;マゼンタ楕円形))またはスキューROI強度測定(例えば、折り畳み(図7C;マゼンタ楕円形))。これらの除外基準でいくつかの幼虫を省略しているにもかかわらず、本明細書のすべてのデータセットは、以下の生物学的反復数(幼虫)を有するN=3を表す:n=11、DMSO MTZ-;n = 10、IWR-1 MTZ-;n = 11、DMSO MTZ+;n = 12、IWR-1 MTZ+.DAPIチャネルを用いて、RPE ROIは、RPEの背頂側(網膜に面している)がOLMの背側先端に直接隣接している点を最初に特定することによって開始された(図 3B',D';青い矢印) (ステップ 6.2.2)。遠位RPE伸長はセクション間で異なる可能性があるため、OLMはRPE ROIエンドポイントを標準化し、MATLAB(0° = 背側ROIエンドポイントおよび180° = 腹側ROIエンドポイント)で角度距離測定値を正規化するための解剖学的ランドマークとして使用されました。薬理学的操作または変異の背景でRPEアブレーションを実行する場合、解剖学的ランドマークは、前処理および定量化の前に同定および検証されるべきである。ここで、OLMは定量化されたすべての幼虫において明らかであり、引き裂きによって損なわれなかった( 図 7B)またはDMSOまたはIWR-1による治療。背側開始点を特定した後、ROIは、腹側OLMの先端に隣接する点に達するまで、RPE(背側から腹側)の頂端側に続いて生成された(図 3B",D";青い矢印)。次に、ステップ6.2.3(図 3B",D";マゼンタ線)。ROIは、RPEの基底側(腹側から背側)に続いて、背側OLMの出発点に隣接する基底側に到達するまで継続された。ROIは、次に、尖った背側端(図 3B',D';マゼンタライン)として腹側で行われます。遺伝子アブレーションは、再生が進行するにつれて回復される中枢eGFP発現の喪失をもたらすことが示されている(要約は、 図 6)3;したがって、再生の程度および関心のある時点におけるeGFPの強度に応じて、eGFPチャネルはMTZにおけるROI生成にのみ有用であり得る。- 群。したがって、共焦点集録にはeGFPチャネル画像も含まれていましたが、ステップ6.2.3で述べたように、DAPIおよび明視野チャネルを使用してROI生成が完了しました。RPE ROI の生成は、DMSO および IWR-1 処理された MTZ では簡単でした。- 幼虫群および目に見えて色素沈着した頂端微絨毛(図 3B;赤い矢印)とともに、顕著に色素沈着した細胞体。同じパラメータがMTZに適用されました+ 幼虫群(図 3D;赤い矢じり);しかし、損傷部位内に損傷組織が残留しているため、頂端微絨毛および色素沈着境界は、場合によっては明視野チャネル単独で描写することが困難であった。これらの領域では、DAPIチャネルは、ROIに含まれていたRPE損傷部位内の細胞破片を同定するためにも使用された(図3C,D;傷害部位局在性細胞破片の例は、シアンの矢印で示されている)。未熟/成熟RPEのマーカーによる免疫染色(例えば、ZPR2; 図 6D,E)37 および/または感光体(例えば、ZPR1)37,38 また、アブレーションされた幼虫におけるRPE ROIの輪郭を描くことを容易にするためにも使用することができる。
以前、IWR-1で処理したアブレーションされた幼虫は、4dpfから4dpiまで、DMSO処理された兄弟対照と比較してRPE再生の有意な障害を示した(図8C)3。これは、中心色素回収率の割合として報告され、再生境界を指定するために、モデルに関するかなりの事前経験と角度距離の手動測定が必要でした(図8B;黒い矢印)。RpEGENは、RPE再生の定量化を自動化し、固有のバイアスを低減するために作成されました。それだけでなく、RpEGENは、非常に堅牢なデータセットの生成も可能にしました。例えば、10個のデータポイントは、n=10個のDMSO処理MTZ+ 幼虫の手動定量から以前に生成され(図8C;断面測定当たりの色素回収率%)3、一方、174,801個のデータポイントは、RpEGENを用いてn=11個のDMSO処理MTZ+ 幼虫/ROIから生成された(図9C;ピクセル強度測定)。
RpEGENは、FIJIを使用して生成された元のROIからスケルトン化された中心線(1ピクセル幅)を導出することによって、RPE全体にわたる色素沈着の局所的変化を段階的に評価するために開発されました(図4A、B)。分析のためにROI内のすべてのピクセル(すなわち、中心線ピクセルだけでなく)を組み込むために、中心線から各ピクセルに対してユークリッド距離変換を実行し、ROIマスク内の各ピクセルに最も近い中心線インデックスのマップを作成した。このインデックス マップにより、中心線の外側の各ピクセルを 1 つの中心線ピクセルに帰属させることができ、各幼虫の RPE 全体にわたる包括的なデータセットを作成できます (図 4E)。RPEの背側から腹側までの長さは、正規化されたピクセル距離(図4F;0-1任意単位)とは対照的に、角度距離(図4G;0-180°)で表されました。5度のビンから得られた強度の中央値は、大規模な傾向を強調し、1度のビン分割データで観察された高周波変動を最小限に抑えるために選択されたメトリックでした(表1、図10A)。順列シミュレーションを選択して帰無仮説を検定し、2つの治療群(ここでは、DMSO MTZ+とIWR-1 MTZ+(どちらも4dpi)、図10B)の中央値が類似しているかどうかを調べました39。このリサンプリング手法は、データの分布に関する厳密な仮定を欠いており、ロバストなp値推定値を生成するために、一連の検定統計量(平均、中央値など)で使用できます。これらのパラメータの数(例えば、生データおよび中央値データのビンサイズ、順列シミュレーションの繰り返しなど)を、ユーザのニーズに合うように適合および修正することができる。後者の場合、統計的にロバストな比較を生成するために20,000回の繰り返しが選択されましたが、繰り返しが少なすぎると誤ったp値推定値が生成される可能性があるため、計算効率と統計的堅牢性のバランスをとるように注意する必要があります。解釈を開始する前に、p値の分布と値が比較的安定していることを確認するために、複数の繰り返し値(10,000、20,000など)を実行することをお勧めします。順列の繰り返しを増やすと、統計的な検出力が向上します (ただし、実行に時間がかかることもあり)、一部のデータセットでは有益です。
共焦点画像データセットは、ステップ7で説明したようにRpEGENを用いて定量化した。注釈付きの RpEGEN およびサポート スクリプトは、GitHub (https://github.com/burchfisher/RpEGEN) で、関心のあるユーザーがテストできるように、8 ビットの TIF および対応する ROI ファイルと共に入手できます。MTZ-幼虫ROIからの生データを表示するヒートマップは、0.06% v/v DMSOまたは15μM IWR-1による治療にかかわらず、RPEの背側(0°)から腹側(180°)の長さにまたがる暗いピクセル強度(0 = 黒、255 = 白、8ビットカラースケール)の全体的な分布を示した(図9A、B)。ピクセル強度の中央値をプロットすると、すべてのグループ間での視覚化が容易になり、RPE全体のMTZ-グループ間の類似性が示されました(図10A;黒線と灰色の線)。これらのデータは、無傷の色素沈着RPE単分子膜の存在を支持し(図9E、F)、およびアブレーションされていないRPEのベースライン中央値(すなわち、150未満)を提供しました(図10A;黒線および灰色の線)。比較すると、MTZ+幼虫ROIからの生データ(図9C、D)および中央値(図10A;青線および赤線)は、治療条件にかかわらず、中央RPEにおけるより軽いピクセル強度の全体的な分布を示した。アブレーションされたDMSO処理された幼虫は、約100°(±15°)で光ピクセルの集中分布を示した(図9C;橙赤色ビン)。これは、視神経の中枢RPE損傷部位における色素沈着の目に見える欠如に対応していた(図9G;青い矢印)。アブレーションされたIWR-1処理幼虫はまた、MTZ+ DMSO処理された兄弟対照と比較した場合、背側(約50°まで)および腹側(約5°)の両方に拡大された光ピクセルの集中分布を示した(図9D;橙赤色ビン)。拡張された傷害部位の存在は、切片化された組織において明瞭に見えた(図9H;青色矢印)。2つの1度ビンを除いて、MTZ+群間で観察された差は、中央RPEにおいて統計的に有意であった(図10B;〜40〜140°の間の水色の網掛け領域;p値≤0.05)は、MTZ+ DMSO処理兄弟対照と比較した場合、MTZ+ IWR-1処理幼虫における中心RPE色素沈着が有意に少ないことを示している。RpEGENを用いた統計的比較(図10B)によるこれらの生データ(図9C,D)および中央値(図10A)データの解釈は、切片組織を観察することによって検証された(図9G,H)だけでなく、手動定量化(図8)3からの以前の知見も支持した3。
図1:rpe65a:受精後5日目のnfsB-eGFP導入遺伝子発現。 (A-C)PTU処理した5dpf幼虫のホールマウント像は、遺伝子切除のスクリーニング時に松果体における薄暗い導入遺伝子発現(A;黄色の矢印)およびRPE(B,C)における明るい導入遺伝子発現を示す。(B)導入遺伝子発現はRPEの中央3分の2に目に見えて局在しており、白い矢印は末梢(未熟)と中枢(成熟)RPEの境界を強調している。緑 = eGFP。前部が上がっている。スケール バー = 100 μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2: インビボでのRPEの遺伝子アブレーションの成功の検証。 (A)眼全体にRPE色素沈着を示す3匹のアブレーションされていない(MTZ−)7dpf幼虫および(B)3つのアブレーションされた(MTZ+)2dpi幼虫のホールマウント画像は、RPEの中央3分の2に色素がないアブレーションゾーン (赤い矢印)を示す。前部が上がっている。スケール バー = 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:RpEGENを使用した自動定量化のためのRPE関心領域(ROI)(A,B)アブレーションされていない(MTZ−)9dpf幼虫および(C,D)アブレーション(MTZ+)4dpi幼虫の横方向凍結切除であって、RPE ROIがマゼンタ色で強調表示されている。(B、D)赤い矢印は、目に見えて色素沈着した頂端微絨毛がROIに含まれていた領域を強調する。(C、D)シアンの矢印は、ROIにRPE細胞破片を含めるために使用された損傷部位局在性DAPI+破片の例の領域を指し示す。(B',B",D',D")背側および腹側ROI領域(BおよびDの黒い点線のボックス)のデジタルズームは、MATLABにおけるエンドポイント検出に重要な推奨ROI開始点(青色の矢印)および尖ったROI端を示す。明視野画像も図9E、Gに示されている。白/灰色 = 原子核。背側が上がっていて、遠位が残っています。(A-D)スケール バー = 40 μm. (B',B",D',D") スケール バー = 10 μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: RpEGEN 処理ワークフロー (A)MATLABにインポートされた、正しく配向された8ビット明視野画像とFIJI生成ROI(赤)の例。背側が上がっていて、遠位が残っています。カラーバーは、8 ビットのグレースケール強度値を表し、0 = 黒、255 = 白です。(B)(C)に示すような測地線画素距離描写のための誤ったスプリアスの存在および始点と終点の描写を示すROIマスクの初期バイナリスケルトン化(白)(赤)。(C)のカラーバーはユークリッドピクセル距離を表す。(D) スプリアスは、終了ピクセルから開始ピクセルに戻る単純化された最小コスト経路を使用して除去され、その結果、スプリアスのない連続した中心線 (赤) になります。(E)ROIマスク内のすべてのピクセルと中心線ピクセル(白)との間の距離変換に基づく最も近い線形中心線インデックス。これらのインデックス値により、ROIマスク内の各画像ピクセルを、解析のために最も近い中心線ピクセルに割り当てることができます。カラーバーは、直線的な中心線ピクセルインデックス値を表します。(F)中心線に沿った正規化されたピクセル距離の例で、0(青、最遠位背側ピクセル)が開始ピクセル、1(赤、最遠位腹側ピクセル)が終了ピクセルである。(G)は(F)に似ていますが、角度距離を使用しますが、0度(青)が開始ピクセル、180度(赤)が終了ピクセルです。(h)各中心線画素について算出した画素強度値の中央値の例。カラーバーは、所与の各中心線画素に寄与するすべてのROIピクセルの中央値グレースケール強度値を表す。この図は、0.06% v/v DMSOまたは15 μM IWR-1処理群の幼虫ではなく、テストデータセットからの画像を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:RPEアブレーションおよび感光体変性の証拠。(a)アブレーションされていない6dpf幼虫の横方向凍結切除。(A,A')PTUへの曝露後、導入遺伝子発現は成熟RPE細胞に限定され、最も明るい発現はRPEの中央3分の2に限定される。矢印は頂端微絨毛を示す。(A")微分干渉コントラスト(DIC)画像は、正常な外顆粒層(ONL、すなわち、感光体)構造を明らかにする。(B,B')1dpi幼虫の横方向凍結切除は、ONLラミネーションにおけるeGFP+細胞形態の著しい破壊および解体を明らかにする。矢印は、剥離およびピクノティック核を示す。(B")DIC画像は、ONLアーキテクチャの著しい混乱をさらに明らかにしています。緑 = eGFP、青 = 核、黄色 = ONL。背側が上がっていて、遠位が残っています。(A)中のスケールバーは40μmを表し、(B)にも適用できる。(A ́)中のスケールバーは40μmを表し、(A",B',B")に適用することができる。この図と図の凡例テキストは、Hanoviceらの2019(図1)3から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:ゼブラフィッシュの仔魚におけるRPE再生のモデル。 (A)nfsB-eGFPは、眼の中央3分の2の成熟RPEで発現している。(B)MTZの適用は、RPEおよび光受容体のアポトーシス(TUNEL、 赤色)をもたらす。(c)RPEアブレーションは、光受容体およびブルッフ膜(点線)の変性をもたらす。(D)末梢の未アブレーションRPEが増殖し始め、損傷部位(青色)にまで拡大する。(E)再生されたeGFP+ RPEが末梢に現れると、RPEは末梢RPE(pRPE)、分化RPE(dRPE)、遷移ゾーン(TZ)、および傷害部位(IS)の4つのゾーンに分けることができる。(E、差し込み図)再生された分化RPE(緑色)は、アブレーションされていない末梢RPEの近位付近の周辺に現れ、かつ移行ゾーンに隣接する増殖性細胞を含んでいる。移行ゾーンは、まだ分化したRPE細胞(ZPR2、赤)と増殖細胞(青)で構成されています。損傷部位は、RPE分化マーカーを全く発現しない色素沈着していない増殖細胞を含む。(F)機能的なRPE層およびブルッフ膜の再生が14dpiで完了する。この図と図の凡例テキストは、Hanoviceらの2019(図14)3から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:画像解析から除外された妥協した組織切片。(A-C)除外基準を満たした0.06% v/v DMSOおよび15μM IWR-1データセットからの幼虫の横方向凍結切片。1匹の幼虫は背側RPE組織の裂け目(A;マゼンタ矢じり)を示し、他の2匹の幼虫は、DAPIチャネルの解剖学的ランドマーク(背側OLM)を妨害するか(B;マゼンタ点線楕円形)、または明視野チャネルからのRPE強度測定値を歪める可能性がある組織折り畳みを示す(C;マゼンタ点線楕円形)。白/灰色 = 原子核。背側が上がっていて、遠位が残っています。スケール バー = 40 μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:IWR-1を用いた薬理学的阻害はRPE再生を損なう。(A)0.06% v/v DMSOおよび(B)15μM IWR-1処理群からのアブレーション(MTZ+)4dpi幼虫の横切片。明視野画像(A、B)およびパーセントRPE回収/セクション(C)の定量化は、IWR-1処理幼虫における色素沈着単層の回復における有意な遅延を示す(スチューデントの不対t検定、*** p < 0.0001)。(B) 黒い矢印は、再生RPEの最中央端を示す。背側が上がっていて、遠位が残っています。(B)中のスケールバーは40μmを表し、(A)にも適用可能である。この図と図の凡例テキストは、ハノヴィツェらから修正されている。2019年(図13)3.この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図9:RpEGENにおけるRPE再生の自動定量化から出力された生データ(A-D)背側(x軸;角度距離= 0°)から腹側(x軸;角度距離= 180°)までのRPE ROI領域全体からコンパイルされた明視野ピクセル強度分布を示すヒートマップ:(A)n = 11、DMSO MTZ−;(b)n=10、IWR-1 MTZ-;(c) n = 11, DMSO MTZ+;(d)n=12、IWR-1 MTZ+(3つの独立した親群から、N=3)。たとえば、(A) は、11 個の ROI にわたって 177,460 ピクセルのデータを表示します。Y 軸では、ピクセル強度は 8 ビットのカラー スケールに基づいて表示されます (0 = 黒、255 = 白)。生データは、5 度 (x 軸) x 5 ~ 8 ビットの強度値 (y 軸) のビン (赤 = 最大ビン数、濃い青 = 最小ビン数) で表示されます。(E-H)0.06% v/v DMSOおよび15μM IWR-1処理群からの代表的な(E,F)非アブレーション(MTZ−)9dpf幼虫および(G,H)アブレーション(MTZ+)4dpi幼虫の横切片。RPE ROIはマゼンタで強調表示され、角度距離の極端が示されます(0° = 背側、180° = 腹側)。大まかに言って、これらのデータは、治療に関係なく、(C,D,G,H)アブレーションROIと比較した場合、(A,B,E,F)アブレーションされていないROIにおけるより暗いピクセル(0〜150の間の強度値)の分布を示す。アブレーションされたROIからのデータは、DMSO処理群におけるより軽いピクセル(100°±15°)の中央集権的(150°〜15°)分布を示し、(D,H)はIWR-1処理幼虫において背側(〜50°まで)およびわずかに腹側(〜5°)に膨張する。(G,H)顔料が存在しないこれらの中央アブレーションゾーンは、青色の矢印で強調表示されている。黒い矢印は視神経の位置を示す。DMSO処理された幼虫からの画像も図3に示されている。スケール バー = 40 μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図10:RpEGENにおけるRPE再生の自動定量化から得られたグループ結果と統計的比較(A)各グループの生データから導き出された5度のビン化中央値と95%信頼度エンベロープ。プロットは、RPEの背側(0°)から腹側(180°)の長さのMTZ-グループ(黒と灰色の線)間の類似性を示し、中央RPE(〜40-140°の間の水色の陰影付き領域)のMTZ+グループ(青と赤の線)の間で顕著な違いを示しています。具体的には、IWR-1 MTZ+ 4 dpiでは、中央RPE色素沈着の減少に対応する他の処理群と比較して、ピクセル強度の中央値が明るく(0 = 黒および255 = 白)に見えます。(B) DMSO MTZ+ 4 dpiおよびIWR-1 MTZ+ 4 dpiのRPEの背側(0°)から腹側(180°)の長さにわたる1度のビンから得られた中央値の統計的比較は、(A)の観察を補強する。p値は、20,000回の繰り返しによる順列シミュレーションと、各1度ビンの両側検定を使用して計算されました。2つのグループが対応する任意の1度ビンについて類似の中央値を持つという帰無仮説では、p値≤0.05はグループ中央値間の統計的に有意な差を示します(黒破線= 95%信頼区間(CI))。中央RPE(約40~140°の間の水色の陰影付き領域)全体で0.05≤p値の存在は、アブレーション(MTZ+)IWR-1処理幼虫において、アブレーション(MTZ+)DMSO処理兄弟対照と比較して有意に少ない色素沈着を示す。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 変数名 | 変数型 | 可変サイズ | 変数の説明 | ||
| ROI名 | セル | {N x 1} | 処理されたROIファイルの名前 | ||
| ロイシー | セル | {N x 1} | 処理された各ROIファイルのROI頂点 | ||
| IMG名 | セル | {N x 1} | 処理されたTIF画像ファイルの名前 | ||
| ティッカー | セル | {N x 1} | 処理された各TIFの8ビット明視野画像データ | ||
| ロイブ | セル | {N x 1} | IMG イメージと同じ寸法の論理 (0 または 1) ROI マスク | ||
| ライン | テーブル付きセル | {N x 1} (n x 16) | X、Y、距離、角度、インデックス、ポイント数、統計情報など、個々の画像の中心線データ | ||
| ティッカー | セル | {N x 1} | CLineを計算するためのROIマスクポイントを最も近い中心線ポイントに関連付ける中心線インデックスデータ | ||
| クリネブ | セル | {N x 1} | 中心線の位置を示す IMG 画像と同じ寸法の論理 (0 または 1) 行列 (=1) | ||
| RAW_data | テーブル | N x 3 | すべての異なるIMG画像にわたるROIの各ピクセルのすべての生データを組み合わせた表 | ||
| BIN_1_deg_all | テーブル | N x 9 | 1 度のビン分割されたデータと、RAW_dataのデータを使用した統計を含むテーブル | ||
| BIN_5_deg_all | テーブル | N x 9 | 5 度のビン分割されたデータと、RAW_dataのデータを使用した統計を含むテーブル | ||
| BIN_10_deg_all | テーブル | N x 9 | 10 度のビン分割データと、RAW_dataのデータを使用した統計を含むテーブル | ||
表 1: RpEGEN.m スクリプトから MAT ファイルにエクスポートされた変数の説明。 定義は次のとおりです: ROI = 関心のある領域。TIF = タグ付き画像ファイル形式。
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Discussion
このプロトコルは、RPEを遺伝的にアブレーションし、幼虫齢ゼブラフィッシュの変性と再生のメカニズムを研究するための方法論を説明しています。このプロトコルは、成虫のゼブラフィッシュ3でも首尾よく実行されていますが、それほど広範な特性評価が行われていないため、幼虫がここで焦点を当てています。プロトコルのこの部分(ステップ1〜4)の重要な側面には、1)メラニン生成の開始前に胚に1.5倍のPTUを添加すること、2)2〜3dpfでPTU処理された胚を脱絾澄すること、3)eGFPの慎重なスクリーニング、および4)MTZによる遺伝子アブレーション中の水変化のタイミングが含まれる。PTUはメラニン合成21,22を阻害し、このRPEアブレーションパラダイムにおいて、rpe65a:nfsB-eGFP導入遺伝子発現のスクリーニングを容易にし、色素沈着組織の不在およびその後の復帰に基づくRPE変性および再生プロセスの特性評価を可能にするために利用されている3。PTUはさらなる色素沈着を阻害するが、メラニン形成が始まると組織を脱色素化させないため21、PTUは色素沈着の開始前に添加されなければならない(ゼブラフィッシュ25で約24hpf始まる)。ここで、および先行研究4,5において、PTUは、メラニン合成が始まる前に阻害を確実にするために、約6hpf 26で添加されている。PTUは主要なプロトコルステップの視覚化を可能にするが、PTU治療は(ステップ2.3で議論されているように)発達のいくつかの側面に影響を与え、胚の孵化を損なう可能性がある。後者のプロセスは、あまりにも長く遅れると、形態および運動性の欠損につながり、生存率に影響を与える可能性がある40。したがって、プロナーゼで酵素的に、または2〜3dpfの鉗子を使用して手動で胚を脱絨毛(孵化)することは、遺伝子アブレーションの前に幼虫の健康を維持および標準化するために重要である。高齢の幼虫の健康と生存率(PTU治療とは無関係)の問題を回避するためのもう1つの重要な考慮事項は、実験41のために9 dpf / 4 dpiを超えて水生施設システムから離れている場合、幼虫は標準化された給餌レジメンを開始するべきであるということです。
説明したように、rpe65aは後眼の中央3分の2の成熟RPEにおける導入遺伝子発現を駆動する。PTU処理された5dpf幼虫におけるeGFPの発現は、図1に示すように、通常、容易に検出され、目に見えて強い(明るい)。明るい発現を有する兄弟姉妹と比較して、5dpfでeGFPを薄暗く発現する幼虫も観察され得る。世代間の発現強度比(すなわち、明るい対薄暗い)の変動も存在し得、いくつかの世代は他の世代よりも薄暗い発現幼虫を有する。いずれにせよ、薄暗いeGFP発現を有する幼虫は、通常、各クラッチ内の動物の少数派を表す。薄暗い発現幼虫がそれほど重篤なRPE傷害表現型を示すかどうかは不明であるが、各クラッチの明るいeGFP+コホートでアブレーションが行われ、比較的薄暗い兄弟姉妹はスクリーニング時に安楽死させられ、分析から除外された。同様に、rpe65a:nfsB-eGFP導入遺伝子について、rpe65a:nfsB-eGFPヘテロ接合型成虫から野生型成虫に交配することにより、ゼブラフィッシュRPEアブレーションおよび再生表現型の広範な特徴付けが、rpe65a:nfsB-eGFP導入遺伝子のヘテロ接合型において実施されている3。しかし、rpe65a:nfsB-eGFPに対してホモ接合型の幼虫がより重度のアブレーション表現型を示すかどうかは不明である。アブレーションプロトコルを標準化するための他の努力には、24時間の遺伝子アブレーション期間中にMTZおよびMTZ+ディッシュに等しい測定容量(例えば、10cmペトリ皿あたり30mL)を添加することが含まれる。同様に、薬理学的処置皿中の幼虫は、等しい測定された体積(例えば、6ウェル当たり5mL)および新鮮な化合物のタイムリーな補充(例えば、24時間ごと)を受けている。異なるMTZおよび/または薬理学的化合物処理で皿を取り扱う場合、輸送中および水交換中のこぼれおよび不注意な交差汚染を防止するために慎重な措置が取られるべきである。
ゼブラフィッシュRPEアブレーションプロトコールは、薬理学的操作を含むように変更することができる(ステップ5)。これは、免疫応答5、mTOR4、およびWnt3シグナル伝達経路をRPE再生の重要な調節因子として同定するために以前に行われてきた。後者はここで繰り返し可能であることが示されており、RpEGENを検証するために使用されました。重要なRPE再生経路を照らすことに加えて、薬理学的操作は、ゼブラフィッシュ網膜再生研究10、42、43、44、45、46、47のために広く採用されている。RPEアブレーションプロトコールに組み込む前に、薬理学的薬剤の毒性、有効性、および治療期間について厳密に評価する必要があります。これは、毒性を評価するために用量反応実験を行うことによって行うことができる48;既知の標的遺伝子/タンパク質の発現を評価する4,5;薬理学的操作の既知の機能的帰結、例えばPLX3397処置による白血球の枯渇48、49、50、51を評価すること。ここで、DMSO(ビヒクルコントロール)およびIWR-1を遺伝子アブレーションの24時間前に添加し、4dpfで薬理学的前処置の直前に幼虫をスクリーニングした。eGFP+幼虫は4dpfのeGFP−幼虫と区別可能であるが、eGFPの強度はかなり薄暗く見えることがあるため、幼虫は5dpfでのeGFP発現について再スクリーニングされた(代表的結果)。4dpfより前のeGFPのスクリーニングは、発現が眼に検出できないほど低い可能性があるため、困難な場合がある。したがって、4dpfより前(すなわち、2dpf上)4の薬理学的薬剤による前処理を、eGFPがはっきりと見えるときに5dpf上で分離されるであろうスクリーニングされていない幼虫に加えることができる。幼虫を操作する必要があるあらゆるシナリオ(例えば、スクリーニング中、イメージングのための埋め込みなど)では、薬理学的治療条件を維持し、スクリーニング年齢にかかわらず、RPEを5dpfのMTZでアブレーションすべきである。
遺伝子アブレーションプロトコルに加えて、共焦点顕微鏡画像の前処理およびRpEGENを用いたRPE再生の自動定量化のためのステップバイステップの指示が概説されている(ステップ6〜7)。RpEGEN は、ユーザー間での RPE 再生の定量化を標準化し、出力データセットの堅牢性を高めると同時に、以前に行われた退屈な手動定量化に伴う固有のバイアスを最小限に抑えるために作成されました。プロトコルのこの部分の重要な側面は、ROI生成中に実行されます(ステップ6)。第1に、画像/眼は、RpEGENがこの方向性のために最適化されているため、背側上、遠位左向き(例えば、図3A−D、図4)でなければならない。RPE ROIの背側および腹側末端が、図3B'、B"、D'、D"(マゼンタ線)に示すように、尖った先端に先細りすることも重要です。これらの端部を代わりに二乗または四捨五入すると、RpEGENスクリプトは中心線スケルトンの始端と終点の画素を決定するのが難しくなり、集中線ではなく終端ROI端にスプリアスを生成する可能性があります(図4B)。端子ROI端部のスプリアスは、デスパーリング中の中心線の短縮(図4D)および/または周辺RPEにおける角度距離測定の問題(図4G)につながる可能性があります。個々の幼虫に対応するTIFファイルとROIファイルの同一の命名システムも、8ビットTIFファイルをRpEGENの正しいROIと組み合わせるための重要なステップであり、不可欠です。TIF ファイル名と ROI ファイル名が一致しないと、「代表的な結果」セクションで概説した RpEGEN 処理ワークフローの生成に失敗し (図 4)、最終的にこのスクリプトを使用した RPE 再生の定量化が妨げられます。
全体として、このプロトコルは、ゼブラフィッシュの幼虫におけるRPEを首尾よくアブレーションし、RPE傷害前、損傷中、または後に関心のあるシグナル伝達経路を操作し、限られた固有のバイアスで標準化された方法でRPE再生を定量化する指示を提供する。RPEの再生可能性を研究するために利用可能な インビボ および インビトロ モデルの文脈において、ゼブラフィッシュは、内因性RPE再生のためのその能力において独特である14。しかしながら、これはRPE傷害の急性モデルであり、治療開発の標的とされるRPE変性疾患(例えば、AMD)のように慢性的ではない。これはモデルの限界ですが、RPE再生のメカニズムを研究するための優れたプラットフォームであり、ほとんど知られておらず、将来的には慢性的な傷害や疾患の研究に適応できる可能性があります。本明細書に記載されるツールおよび方法論は汎用性があり、変性応答に関与する細胞プロセスの研究およびアブレーション後のRPE隣接組織の運命を研究するためにも適用され得る。同様に、RpEGEN スクリプトは、ユーザー データ出力のニーズに合わせて変更できます。例えば、色素以外のマーカー(例えば、 in situ ハイブリダイゼーションプローブ、タンパク質発現など)の空間解析を行う。
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Disclosures
L.L.L.は、ヒト多能性幹細胞から網膜色素上皮を誘導するための迅速な方法を記載した米国特許第9,458,428号の共同発明者である。これは、ここの内容とは無関係です。J.M.G.およびG.B.F.は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
本明細書に記載された研究は、国立衛生研究所(RO1-EY29410からJ.M.G.へ、およびNIH CORE Grant P30-EY08098から眼科へ)によって支援された。UPMC Immune Transplant & Therapy Center(L.L.L.およびJ.M.G.へ)E. Ronald Salvitti Chair in Ophthalmology Research(J.M.G.へ)。Wiegand Fellowship in Ophthalmology(L.へ)、ピッツバーグのEye & Ear Foundation、およびNew York, NYのResearch to Prevent Blindnessから無制限の助成金が受けられました。著者らはまた、技術支援のアマンダ・プラットと、優れた動物ケアサポートのためのヒュー・ハマー博士と水生生物スタッフに感謝したい。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab Material/Equipment | |||
| 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI) | Millipore Sigma | D9542 | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-539-13 | Catalog number is for 50 mL tubes |
| Diamond tip scribing pen | Fisher Scientific | 50-254-51 | Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 % | Fisher Scientific | BP231 | Check instiutional chemical waste disposal requirements |
| Embryo incubator (large) | Fisher Scientific | 3720A | |
| Embryo incubator (mini/tabletop) | Labnet | I5110A | |
| Fluorescence stereo microscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | Or similar, with 488 nm excitation laser/filter |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-4 | Manufactured by Corning, non-sterile |
| InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo | Millipore Sigma | 5.04462 | Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements |
| Methylene blue (powder) | Fisher Scientific | BP117-100 | Also available as a premade aqeuous solution |
| Metronidazole (MTZ) | Millipore Sigma | M3761 | Check instiutional chemical waste disposal requirements |
| N-phenylthiourea (PTU) | Millipore Sigma | P7629 | Check instiutional chemical waste disposal requirements |
| Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free | Fisher Scientific | AA433689M | Chemical waste, proper disposal required |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | 10 cm diameter |
| Phosphate buffered saline (powder packets) | Millipore Sigma | P3813 | Used to make 10 X PBS stock |
| Pronase | Millipore Sigma | PRON-RO | |
| Shaking incubator | Benchmark | H2010 | Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius |
| Stereo microscope | Leica | S9i | Or similar, with transmitted light illumination |
| Student Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Fine-tipped forceps for manual dechorionation |
| Tabletop rotator/shaker | Scilogex | SK-D1807-E | |
| Transfer pipette | Millipore Sigma | Z135003 | 3.2 mL bulb draw, non-sterile |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Pentair | TRS1, TRS2, TRS5 | Also available from Fisher Scientific (NC0342409) |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Software Material | |||
| FIJI (Fiji is Just ImageJ) | FIJI (Fiji is Just ImageJ) | https://imagej.net/software/fiji/ | Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats |
| GRAMM examples and how-tos | MathWorks | https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like. | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox |
| MATLAB support | MathWorks | https://www.mathworks.com/support.html |
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