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Biology

Ablazione mediata da nitrorefuttasi/metronidazolo e una piattaforma MATLAB (RpEGEN) per lo studio della rigenerazione dell'epitelio pigmentato retinico zebrafish

Published: March 2, 2022 doi: 10.3791/63658
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Ophthalmology, Louis J. Fox Center for Vision Restoration, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Earth Research Institute, University of California, Santa Barbara, 3Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Questo protocollo descrive la metodologia per ablare geneticamente l'epitelio pigmentato retinico (RPE) utilizzando un modello transgenico di zebrafish. L'adattamento del protocollo per incorporare la modulazione della via di segnalazione utilizzando composti farmacologici è ampiamente dettagliato. È stata sviluppata una piattaforma MATLAB per quantificare la rigenerazione RPE basata sulla pigmentazione, che viene presentata e discussa.

Abstract

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) risiede nella parte posteriore dell'occhio e svolge funzioni essenziali per mantenere la salute e l'integrità dei tessuti retinici e vascolari adiacenti. Allo stato attuale, la limitata capacità riparativa dell'RPE nei mammiferi, che è limitata a piccole lesioni, ha ostacolato il progresso verso la comprensione dei processi rigenerativi RPE in vivo . Qui, viene fornita una metodologia dettagliata per facilitare lo studio della riparazione RPE in vivo utilizzando il pesce zebra, un modello di vertebrato in grado di una robusta rigenerazione dei tessuti. Questo protocollo descrive un paradigma di lesione transgenico mediato da nitroreduttasi/metronidazolo (NTR/MTZ) (rpe65a:nfsB-eGFP), che si traduce in ablazione dei due terzi centrali dell'RPE dopo 24 ore di trattamento con MTZ, con successivo recupero tissutale. L'attenzione è posta sulle ablazioni RPE nel pesce zebra larvale e sono anche delineati i metodi per testare gli effetti dei composti farmacologici sulla rigenerazione RPE. Viene inoltre discussa la generazione e la convalida di RpEGEN, uno script MATLAB creato per automatizzare la quantificazione della rigenerazione RPE basata sulla pigmentazione. Oltre ai meccanismi attivi di riparazione RPE, questo protocollo può essere esteso agli studi sulla degenerazione RPE e sulle risposte alle lesioni, nonché sugli effetti del danno RPE sui tessuti retinici e vascolari adiacenti, tra gli altri processi cellulari e molecolari. Questo sistema di zebrafish è promettente nell'identificazione di geni, reti e processi che guidano la rigenerazione RPE e i meccanismi correlati alla malattia RPE, con l'obiettivo a lungo termine di applicare queste conoscenze ai sistemi dei mammiferi e, in definitiva, allo sviluppo terapeutico.

Introduction

La metodologia qui descritta descrive un protocollo per ablare geneticamente l'epitelio pigmentato retinico (RPE) utilizzando il pesce zebra larvale. L'RPE si estende sulla parte posteriore dell'occhio e risiede tra gli strati stratificati della retina neurale e lo strato di vascolarizzazione che costituisce la coroide. Il supporto trofico, l'assorbimento della luce fototossica e il mantenimento delle proteine del ciclo visivo sono solo alcune delle funzioni critiche che l'RPE svolge che sono essenziali per sostenere la salute e l'integrità di questi tessuti adiacenti1. Il danno all'RPE dei mammiferi è riparabile quando le lesioni sono piccole2; tuttavia, i danni subiti da lesioni più grandi o malattie degenerative progressive sono irreversibili. Nell'uomo, le malattie degenerative RPE (ad esempio, la degenerazione maculare legata all'età (AMD) e la malattia di Stargardt) portano alla perdita permanente della vista e, con poche opzioni di trattamento disponibili, alla diminuzione della qualità della vita del paziente. La limitata capacità dell'RPE dei mammiferi di auto-ripararsi ha creato una lacuna di conoscenza nel campo dei processi rigenerativi RPE. Data la robusta capacità rigenerativa del pesce zebra in molti tipi di tessuto diversi, questo protocollo è stato sviluppato per stabilire un sistema di vertebrati in vivo per facilitare gli studi sull'RPE intrinsecamente rigenerante e scoprire i meccanismi che guidano tale risposta. Utilizzando il paradigma di ablazione qui delineato, la via di segnalazione Wnt canonica3, la via mTOR4 e le risposte immuno-correlate5 sono state identificate come mediatori critici della rigenerazione RPE, probabilmente con funzioni sovrapposte.

In questo paradigma di ablazione genetica, il pesce zebra Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 esprime il gene6 della nitroreductasi di derivazione batterica (NTR/nfsB) fuso a eGFP sotto il controllo dell'elemento potenziatore RPE, rpe65a7. L'ablazione si ottiene aggiungendo il profarmaco, il metronidazolo (MTZ), al sistema idrico che ospita il pesce zebra. L'attivazione intracellulare di MTZ da parte della nitroreduttasi provoca reticolazione del DNA e apoptosi nelle cellule che esprimono NTR/nfsB 8,9. Questa tecnologia è stata ampiamente utilizzata nel pesce zebra per ablare le cellule della retina 10,11,12,13 e altri tessuti 8. Insieme, questi elementi consentono l'espressione mirata (rpe65a) di una metodologia di ablazione cellulare inducibile (NTR/MTZ)8,9 e di un marcatore fluorescente (eGFP) per la visualizzazione.

Esistono anche altri interessanti modelli in vivo che possono essere utilizzati per studiare il potenziale rigenerativo dell'RPE14. Questi sono ampi e includono la transdifferenziazione RPE-retina post-retinectomia negli anfibi, in cui le cellule RPE perse per ricrescita retinica vengono sostituite15,16; Ripristino RPE post-infortunio nel topo MRL/MpJ "super curativo"17; e stimolazione esogena della proliferazione RPE in un modello di ratto di RPE spontanea e degenerazione retinica18, tra gli altri. Sono stati sviluppati anche modelli in vitro, come le cellule staminali RPE umane adulte (RPESC)19. Questi modelli sono tutti strumenti preziosi che lavorano per scoprire i processi cellulari legati alla rigenerazione RPE (ad esempio, proliferazione, differenziazione, ecc.); tuttavia, il pesce zebra è unico nella sua capacità di riparazione RPE intrinseca post-ablazione.

Mentre la metodologia qui è scritta per concentrarsi sulla comprensione dei meccanismi che guidano la rigenerazione RPE, la linea Tg (rpe65a: nfsB-eGFP) e questo protocollo di ablazione genetica potrebbero essere utilizzati per studiare altri processi cellulari come l'apoptosi RPE, la degenerazione RPE e l'effetto della lesione RPE sui tessuti retinici e vascolari adiacenti. Il protocollo di ablazione può anche essere modificato per includere la manipolazione farmacologica, che è una comoda strategia preliminare per schermare le vie di segnalazione di interesse. Ad esempio, il blocco della via Wnt canonica utilizzando l'inibitore della risposta Wnt-1 (IWR-1)20, ha dimostrato di compromettere la rigenerazione RPE3. Questo è stato ripetuto qui per guidare gli utenti attraverso un esperimento di manipolazione farmacologica e servire come proof-of-concept per convalidare uno script MATLAB (RpEGEN) creato per quantificare la rigenerazione RPE basata sul recupero della pigmentazione. Come la linea transgenica e il protocollo di ablazione, gli script RpEGEN sono adattabili e potrebbero essere utilizzati per quantificare altri marcatori / processi cellulari all'interno dell'RPE.

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Protocol

Tutte le metodologie qui descritte sono conformi all'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università di Pittsburgh.

1. Preparazione prima della raccolta degli embrioni di zebrafish

  1. Impostare l'incubatrice embrionale a 28,5°C.
  2. Preparare una soluzione madre 25x dell'inibitore della melanogenesi, N-feniltiourea (PTU)21,22. Questa soluzione madre è scalata da una ricetta comune22 e 1x è pari allo 0,003% di peso per volume (% p/v) (ad esempio, 0,003 g di polvere PTU in 100 mL di solvente liquido).
    1. Per ottenere una grande soluzione madre 25x PTU, aggiungere 0,75 g di polvere PTU a 1 L di acqua deionizzata purificata (di seguito denominata dH2O) e mescolare accuratamente a temperatura ambiente (~ 25 °C) usando una barra di agitazione e una piastra di agitazione. Conservare a 4°C per un massimo di 3 mesi al riparo dalla luce.
      NOTA: è difficile ottenere PTU per andare in soluzione acquosa e può essere necessario mescolare prolungatamente durante la notte.
      ATTENZIONE: la PTU è pericolosa e bisogna fare attenzione a prevenire l'ingestione, l'inalazione e/o il contatto con la pelle o gli occhi. La polvere PTU e tutti i derivati liquidi PTU descritti nel presente documento potrebbero dover essere smaltiti come rifiuti chimici a seconda delle normative statali e istituzionali. Si raccomanda la conferma di adeguati metodi di smaltimento dei rifiuti PTU, se presenti, prima dell'uso.
    2. Per realizzare una soluzione di lavoro PTU 1,5x (di seguito denominata PTU 1,5x), aggiungere 60 mL di soluzione madre PTU 25x a 940 mL di acqua dell'impianto di alloggiamento zebrafish (di seguito denominata acqua di sistema). Sono stati descritti parametri ottimali di qualità dell'acqua per il pesce zebra23 e gli impianti acquatici dovrebbero disporre di procedure standard di monitoraggio dell'acqua. Conservare 1,5x PTU a 28,5°C per 1-2 settimane al riparo dalla luce.
      NOTA: questo protocollo viene eseguito di routine utilizzando le concentrazioni PTU, i solventi e i parametri di stoccaggio descritti nel passaggio 1.2. Per precauzione, gli embrioni / larve devono essere osservati ogni 1-2 giorni mentre sono in PTU per convalidare l'efficacia e confermare la depigmentazione sostenuta. Le condizioni di dissoluzione e/o conservazione devono essere ottimizzate se si sospetta una diminuzione della solubilità/efficacia della PTU.
  3. Preparare una soluzione madre di blu di metilene allo 0,05% p/v, un inibitore della crescita fungina, aggiungendo 0,05 g di polvere di blu di metilene a 100 ml di dH2O. Mescolare accuratamente usando una barra di agitazione e una piastra. Conservare a 4°C.
  4. Preparare pipette per la manipolazione di embrioni / larve (ad esempio, spostare embrioni / larve tra le piastre di Petri, separare le larve durante lo screening di fluorescenza, raccogliere larve eutanasizzate in tubi di microcentrifuga per la fissazione, ecc.) tagliando l'estremità affusolata di una pipetta di vetro Pasteur usando una penna a punta di diamante. Incidere intorno alla circonferenza della pipetta con la penna diamantata e tirare delicatamente o staccare l'estremità per fare una rottura pulita.
    NOTA: La bocca della pipetta deve essere liscia e abbastanza larga da assorbire facilmente un embrione ancora all'interno del corion senza tosatura. Utilizzare una pipetta di trasferimento del disegno della lampadina come alternativa. Le pipette preparate possono anche essere utilizzate per rimuovere il liquido durante i cambi d'acqua (piuttosto che versare) per ridurre al minimo la perdita di embrioni / larve.
  5. Preparare una soluzione di paraformaldeide al 4% (PFA) in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (ad esempio, aggiungere 10 mL di PFA al 16% a 4 mL di PBS 10x e 26 mL di dH2O). Conservare a 4°C per un massimo di 4 settimane al riparo dalla luce.
    ATTENZIONE: La paraformaldeide è una sostanza chimica pericolosa e deve essere maneggiata in una cappa aspirante chimica e smaltita correttamente. Prestare attenzione e indossare dispositivi di protezione individuale (DPI) per prevenire l'ingestione, l'inalazione e/o il contatto con la pelle o gli occhi.

2. Raccolta e mantenimento degli embrioni di Zebrafish prima dell'ablazione genetica (0-5 giorni dopo la fecondazione)

  1. Mantenere il pesce zebra adulto come descritto in precedenza 3,4,5. Il pomeriggio/sera prima della raccolta degli embrioni, separare il pesce zebra adulto in vasche di riproduzione per la deposizione delle uova.
  2. La mattina seguente (0 giorni dopo la fecondazione (dpf)), raccogliere gli embrioni in piastre di Petri di 10 cm di diametro in acqua di sistema e rimuovere tutte le uova non vitali o non fecondate, che appariranno opache e / o mostreranno citoplasma irregolare e scissione fallita24.
    NOTA: Gli eventi normali di scissione e stadiazione dello sviluppo saranno evidenti negli embrioni sani come descritto25. Le piastre di Petri devono essere mantenute piene per tre quarti (~ 30 ml per una parabola di 10 cm di diametro) per tutto il protocollo.
    1. Aggiungere due gocce di blu di metilene allo 0,05% p/v a ciascuna capsula di Petri, mescolare delicatamente e conservare gli embrioni a 28,5 °C per il resto del protocollo.
  3. Circa 6 ore dopo la fecondazione (hpf)4,5,26, sostituire l'acqua di sistema nelle piastre di Petri embrionali con 1,5x PTU (soluzione di lavoro fatta nella fase 1.2.2) e ricostituire il blu di metilene.
    NOTA: la PTU deve essere aggiunta agli embrioni prima dell'inizio della pigmentazione (cioè prima di 24 hpf)25 poiché i tessuti già pigmentati non si depigmentano con l'aggiunta di PTU21. Va notato, tuttavia, che nelle dimensioni ridotte degli occhi, nei pesci zebra trattati con PTU27,28,29 sono stati riportati riduzioni delle dimensioni degli occhi, deficit oculari e craniofacciali e interruzione di alcune vie di segnalazione (ad esempio, segnalazione tiroidea). La tossicità per lo sviluppo della PTU sembra dipendere dalla concentrazione e dalla tempistica dell'aggiunta di PTU27,29. Come accennato in precedenza per convalidare l'efficacia della PTU (fase 1.2), anche i segni di tossicità della PTU devono essere attentamente monitorati e, se sospettati, la concentrazione di lavoro e/o il tempo di aggiunta della PTU devono essere ottimizzati.
  4. Su 2-3 dpf, embrioni decorionati utilizzando una soluzione di pronasi appena fatta.
    1. Sciogliere la pronasi in 1,5x PTU ad una concentrazione di 2 mg/mL mediante vortice.
      ATTENZIONE: La pronasi è confezionata come polvere molto fine ed è irritante. Adottare misure per evitare l'inalazione e/o il contatto con la pelle, gli occhi, ecc.
    2. Separare gli embrioni nati dagli embrioni non schiusi e trattare la pronasi solo gli embrioni non schiusi.
    3. Sostituire 1,5x PTU con 2 mg/mL di soluzione di pronasi prodotta nel passaggio 2.4.1 e lasciare sugli embrioni non schiusi per 4-5 minuti con agitazione delicata (ad esempio, su un rotatore/agitatore da tavolo o mediante vortice manuale).
    4. Versare la soluzione di pronasi e risciacquare immediatamente con PTU fresco 1,5x. Triturare delicatamente 1,5x PTU risciacquare sugli embrioni con una pipetta di trasferimento a bulbo.
    5. Ripetere un secondo risciacquo PTU 1,5x per scartare tutti i detriti di corione, quindi ricostituire 1,5x PTU per la manutenzione.
      NOTA: gli embrioni possono anche essere decorianiati manualmente usando una pinza a punta fine. In questo caso, i detriti di corione devono essere rimossi e 1,5x PTU reintegrati dopo la decoerniazione manuale.
  5. Monitorare la salute embrionale / larvale e ricostituire 1,5 volte la PTU ogni 1-2 giorni. Gli embrioni/larve sono tenuti in PTU 1,5x fino all'ablazione a 5 dpf.
    NOTA: l'importanza dei passaggi 2.3 e 2.4 è affrontata ulteriormente nella sezione Discussione.

3. Screening delle larve di zebrafish per rpe65a:nfsB-eGFP e ablazione genetica dell'epitelio pigmentato retinico (5-6 giorni dopo la fecondazione)

  1. Preparare una soluzione fresca di metronidazolo (MTZ) da 10 mM su 5 dpf (giorno di ablazione). Questo processo richiede 2 ore per essere completato.
    1. Aggiungere la polvere MTZ all'acqua di sistema senza PTU e mescolare accuratamente agitando vigorosamente (ad esempio, 250 rotazioni al minuto) per 1 ora a 37 °C.
    2. Raffreddare la soluzione MTZ da 10 mM per ulteriori 1 ora a temperatura ambiente su un rotatore/agitatore da tavolo e garantire la completa dissoluzione prima di aggiungere alle piastre di Petri con larve.
      NOTA: Lo screening fluorescente e la separazione delle larve di eGFP+ (fase 3.2) possono essere eseguiti durante le incubazioni a temperatura ambiente e a 37 °C.
      ATTENZIONE: MTZ è pericoloso e bisogna fare attenzione per prevenire l'ingestione, l'inalazione e/o il contatto con la pelle o gli occhi. La polvere MTZ e tutti i derivati liquidi descritti nel presente documento potrebbero dover essere smaltiti come rifiuti chimici a seconda delle normative statali e istituzionali. Si raccomanda la conferma dei metodi di smaltimento dei rifiuti MTZ corretti, se presenti, prima dell'uso.
  2. Schermare le larve di zebrafish per il transgene rpe65a:nfsB-eGFP.
    1. Anestetizzare le larve con 0,168 g/L di tricaina (MS-222) e separare le larve transgeniche (eGFP+) (Figura 1) dalle larve non transgeniche (eGFP-) utilizzando uno stereomicroscopio a fluorescenza con laser/filtro di eccitazione a 488 nm.
      NOTA: La tricaina deve essere aggiunta a 1,5x PTU e/o soluzioni farmacologiche composte poiché le larve devono rimanere immerse nel trattamento durante lo screening per eGFP. Incubare le larve in tricaina solo per la durata dello screening (ad esempio, ≤10 minuti per una singola capsula di Petri di 10 cm contenente 50 larve).
    2. Wake le larve schermate immediatamente pipettando direttamente in una capsula di Petri con PTU fresco 1,5x senza tricaina.
    3. Al termine dello screening, separare ulteriormente le larve di eGFP+ in due gruppi di piastre di Petri: un gruppo per ricevere il trattamento MTZ (ablato / MTZ +) e un gruppo per essere il controllo non blato (MTZ-).
  3. Ablare l'epitelio pigmentato retinico.
    1. Rimuovere 1,5x PTU dalle piastre di controllo non bloped (MTZ-) e aggiungere acqua fresca di sistema senza PTU.
    2. Rimuovere 1,5x PTU dalle piastre di trattamento ablate (MTZ+) e aggiungere la soluzione MTZ da 10 mM appena prodotta (fase 3.1.).
    3. Rimuovere la soluzione MTZ da 10 mM dopo esattamente 24 ore (designato 1 giorno dopo l'infortunio (dpi)) e aggiungere acqua di sistema fresca senza PTU. Sostituire l'acqua fresca del sistema senza PTU sulle piastre MTZ. Le larve non saranno nuovamente esposte alla PTU per il resto del protocollo.
      NOTA: potrebbe essere difficile pipettare o versare tutte le PTU 1,5x (passaggi 3.3.1 e 3.3.2) o 10 mM MTZ (fase 3.3.3) tra gli scambi di soluzione senza perdita larvale mentre gli animali nuotano attivamente. In questo caso, è possibile aggiungere lavaggi di acqua di sistema senza PTU per garantire un corretto scambio di soluzioni.

4. Mantenimento larvale post-ablazione genetica (6+ giorni dopo la fecondazione)

  1. Controllare le larve e reintegrare l'acqua del sistema senza PTU ogni giorno fino all'eutanasia (passaggio 5.6) o tornare alla struttura di stabulazione del pesce zebra.
  2. Monitorare il successo e l'entità dell'ablazione in vivo a 2 dpi (7 dpf) utilizzando l'illuminazione a luce trasmessa su uno stereomicroscopio (Figura 2).

5. Incorporare il trattamento farmacologico nel protocollo di ablazione dell'epitelio pigmentato retinico zebrafish

NOTA: Come eseguito in precedenza3, il trattamento con IWR-1 da 15 μM o controllo del veicolo con dimetilsolfossido (DMSO) a partire da 4 dpf è descritto qui come esperimento di esempio per testare RpEGEN. Le concentrazioni e le tempistiche possono variare con i diversi composti farmacologici e le raccomandazioni per la convalida dose-risposta, la durata del trattamento, lo screening e altri aspetti della progettazione sperimentale per gli studi di manipolazione farmacologica sono affrontate nella sezione Discussione. Seguire i passaggi 6 e 7 se è necessaria l'analisi delle immagini.

  1. Raccogliere e mantenere gli embrioni come descritto nella fase 2. Embrioni decionati su 2 dpf.
  2. Schermare le larve di eGFP+ su 4 dpf come descritto al punto 3.2. Piuttosto che le piastre di Petri, posizionare le larve di eGFP + in piastre a 6 pozzetti ad una densità di n ≤ 10 larve per 6 pozzetti per il trattamento farmacologico. Designare piastre separate a 6 pozzetti per le larve che non saranno compresse (MTZ-) e le larve che saranno ablate (MTZ+).
    NOTA: il segnale eGFP è visibile su 4 dpf ma appare dimmer rispetto all'intensità del segnale su 5 dpf.
  3. Pretrattare 4 larve di eGFP+ dpf con 15 μM IWR-1 o controllo del veicolo DMSO in volume per esattamente 24 ore prima dell'ablazione genetica con soluzione MTZ da 10 mM.
    NOTA: Spesso, molto poco composto è necessario per gli esperimenti di trattamento farmacologico. Per evitare di pesare piccole quantità di polvere di IWR-1, questo composto farmacologico viene acquistato già in soluzione DMSO, ad una concentrazione di 25 mM, e aliquotato in volumi più piccoli all'arrivo per evitare ripetuti cicli di congelamento-disgelo.
    1. Determinare il volume dei trattamenti farmacologici e di controllo del veicolo necessari e aliquotare 1,5x PTU in tubi conici di conseguenza. Si consiglia un volume di 5 ml/pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.
    2. Aggiungere lo stock IWR-1 a 1,5x PTU per una concentrazione finale di 15 μM IWR-1 (ad esempio, 3 μL di 25 mM IWR-1 per 5 mL di 1,5x PTU). Aggiungere un volume corrispondente di stock DMSO a 1,5x PTU (ad esempio, 3 μL ≥ 99,7% DMSO per 5 mL di 1,5x PTU). Qui, questo finirà per produrre una concentrazione finale dello 0,06% volume / volume (% v / v) DMSO. Mescolare bene vorticosamente e confermare visivamente la dissoluzione dei composti.
      ATTENZIONE: DMSO, IWR-1 e altri composti farmacologici e solventi potrebbero dover essere smaltiti come rifiuti chimici a seconda delle normative statali e istituzionali. Prima dell'uso si raccomanda la conferma del livello di pericolo e dei metodi adeguati di smaltimento dei rifiuti per questi composti, se presenti.
    3. Rimuovere 1,5x PTU dalle larve eGFP+ in piastre a 6 pozzetti e aggiungere 5 mL/pozzetti di DMSO appena fatto 0,06% v/v o 15 μM IWR-1 trattamenti dal passo 5.3.2.
  4. Su 5 dpf, ablare l'RPE. Oltre al pretrattamento di 24 ore (fase 5.3), le larve rimarranno immerse in trattamenti farmacologici e di controllo del veicolo durante 24 ore di ablazione genetica con MTZ 10 mM e durante il recupero post-ablazione, fino alla fissazione (ad esempio, da 4-9 dpf).
    1. Effettuare 10 mM di soluzione MTZ 2 ore prima di eseguire l'ablazione genetica (fase 3.1).
    2. Determinare il volume dei trattamenti farmacologici e di controllo del veicolo necessari per piastre a 6 pozzetti sia non ablate (MTZ-) che ablate (MTZ+) e aliquote volumi appropriati di acqua dolce di sistema senza PTU (MTZ-) o soluzione MTZ da 10 mM (MTZ+) in tubi conici. Ciò produrrà quattro condizioni di trattamento: 1) 0,06% v / v DMSO, MTZ-; 2) 15 μM IWR-1, MTZ-; 3) 0,06% v/v DMSO, MTZ+; e 4) 15 μM IWR-1, MTZ+.
    3. Aggiungere le soluzioni stock IWR-1 e DMSO ai rispettivi tubi conici come eseguito nel passaggio 5.3.2. Mescolare bene vorticosamente e confermare visivamente la dissoluzione dei composti.
    4. Rimuovere i trattamenti 0,06% v/v DMSO e 15 μM IWR-1 in 1,5x PTU (fase 5.3.2) dalle piastre designate non blated (MTZ-) e ablate (MTZ+) a 6 pozzetti e reintegrare con i trattamenti appropriati effettuati nel passaggio 5.4.3.
    5. Rimuovere i trattamenti DMSO 0,06% v/v e IWR-1 da 15 μM in soluzione MTZ da 10 mM dopo esattamente 24 ore e reintegrare con trattamenti in acqua dolce di sistema senza PTU. Reintegrare i trattamenti DMSO 0,06% v/v e IWR-1 da 15 μM in acqua dolce di sistema senza PTU sulle piastre a 6 pozzetti non compresse (MTZ-).
  5. Seguire il mantenimento larvale post-ablazione come indicato nella fase 4 e reintegrare quotidianamente i trattamenti 0,06% v/v DMSO o 15 μM IWR-1 in acqua di sistema senza PTU.
  6. Eutanasia delle larve su 9 dpf (4 dpi per i fratelli trattati con MTZ abbinati all'età) immergendo gli animali in soluzione di tricaina da 0,3 g / L (sovradosaggio letale) accoppiato con un rapido raffreddamento (ad esempio, posizionare le piastre di Petri sul ghiaccio) per almeno 20 minutie 30. Verificare che le larve non rispondano al tocco e fissare il 4% di PFA (fase 1.5) per 3 ore a temperatura ambiente o a 4 °C durante la notte.
  7. Elaborare il tessuto larvale post-fissazione per l'acquisizione di immagini z-stack su un microscopio confocale come descritto in precedenza 5,31 e qui nella sezione Risultati rappresentativi. L'analisi nei passaggi 6 e 7 richiederà, come minimo, l'acquisizione di marcatori nucleari (ad esempio, DAPI) e immagini z-stack a campo luminoso.

6. Pre-elaborazione dell'immagine z-stack del microscopio confocale in FIJI (ImageJ)

  1. Importa e formatta le immagini z-stack del microscopio confocale utilizzando FIJI32.
    1. Apri le immagini del microscopio utilizzando le opzioni di importazione dei bioformati impostate su Visualizza stack con: Hyperstack e modalità Colore: Scala di grigi.
    2. Generare una proiezione di massima intensità dell'immagine del microscopio importata scegliendo Immagine | Stack | Progetto Z. Nella finestra ZProjection , impostate Avvia sezione e Interrompi sezione per includere tutte le sezioni per l'immagine. Ad esempio, impostare Start Slice: 1 e Stop Slice: 18 per uno z-stack con un totale di 18 slice. Scegliete Tipo di proiezione: Intensità massima e fate clic su OK.
    3. Convertire il file di proiezione di intensità massima in un'immagine a 8 bit (se non già) scegliendo Immagine | Tipo | 8 bit.
    4. Riorientare l'immagine in modo che il lato dorsale sia rivolto verso l'alto e distale (cioè l'obiettivo) venga lasciato scegliendo Immagine | Trasforma | Capovolgi orizzontalmente (per l'ultimo comando, scegli l'opzione più adatta alla direzionalità necessaria per quell'immagine). Per un'immagine multicanale, fare clic su Sì nello stack di processo? per riorientare tutti i canali.
      NOTA: questo passaggio è fondamentale, ma non necessario se l'immagine è già nell'orientamento sinistro dorsale verso l'alto e distale. Vedere la Figura 3A-D e la Figura 4 per le immagini con gli occhi nella direzionalità corretta per l'elaborazione.
    5. Salvare la proiezione a intensità massima a 8 bit come file TIF (Tagged Image File Format) scegliendo File | Salva con nome | Tiff....
  2. Generare la regione di interesse RPE (ROI) utilizzando FIJI.
    1. Aprire un'immagine TIF a 8 bit generata come descritto nel passaggio 6.1. Avvia il ROI Manager scegliendo Analizza | Strumenti | ROI Manager.
    2. Usa | immagine Zoom e commutazione tra i canali DAPI e brightfield per identificare il punto o i punti in cui il lato apicale dell'RPE è adiacente alla punta della membrana limitante esterna (OLM) (Figura 3B', B", D', D"; punte di freccia blu). Usa questo punto di riferimento anatomico come punto di partenza del ROI.
    3. Creare il ROI RPE con lo strumento Selezioni poligonali (nella barra degli strumenti FIJI) utilizzando sia i canali immagine DAPI che brightfield e la funzione zoom (Image | Zoom) per identificare i confini APICALI e BASALI DELL'RPE. Portare le estremità dorsale e ventrale del ROI (cioè, dove il ROI passa dal lato apicale a quello basale dell'RPE) a un punto acuto piuttosto che smussare o arrotondare (Figura 3B', B", D', D"; linee magenta).
      NOTA: la creazione di un roi finale mirato è un passaggio fondamentale per ottimizzare il rilevamento degli endpoint utilizzando RpEGEN ed è affrontato nella sezione Discussione.
    4. Aggiungi il ROI facendo clic su Aggiungi in ROI Manager. Regola il ROI secondo necessità e fai clic su Aggiorna nel ROI Manager.
    5. Salva il file ROI scegliendo Altro>> | Salvare... all'interno del ROI Manager. Utilizzare nomi identici per i file di immagine ROI e TIF corrispondenti (ad esempio, [nome file].tif e [nome file].roi).
  3. Combina file TIF e ROI a 8 bit per ogni condizione in un'unica cartella. Ad esempio, la cartella, DMSO_9dpf, conterrà tutti i file TIF e ROI corrispondenti per il gruppo larvale trattato DMSO da 9 dpf non blated (MTZ-) 0,06% v/v.

7. Quantificazione e visualizzazione della rigenerazione RPE utilizzando script RpEGEN

  1. Installare e preparare gli script RpEGEN.
    1. Scarica gli script RpEGEN più recenti dal repository GitHub (https://github.com/burchfisher/RpEGEN) facendo clic su Code | Scarica ZIP.
    2. Decomprimere la cartella e posizionarla nella posizione dell'area di lavoro desiderata (ad esempio, Desktop).
    3. Apri MATLAB.
    4. Passare alla cartella RpEGEN nel riquadro Cartella corrente (in genere sul lato sinistro).
    5. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla cartella RpEGEN e scegliere Aggiungi al percorso | Cartelle e sottocartelle selezionate. Questo aggiunge la cartella al percorso MATLAB in modo che possa trovare ed eseguire automaticamente tutti gli script nella cartella.
    6. Fare doppio clic sulla cartella RpEGEN nel riquadro Cartella corrente per visualizzare tutte le sottocartelle e i file M.
    7. Fare doppio clic sul file RpEGEN.m da aprire nel riquadro Editor .
    8. Nella sezione VARIABILI DEFINITE DALL'UTENTE del file RpEGEN.m, immettere i percorsi di directory per le cartelle contenenti i file ROI (con estensione roi), i file di immagine (.tif) e dove salvare i file di output. Immettere il nome del gruppo per il file .mat da esportare (ad esempio, DMSO_9dpf, DMSO_4dpi, ecc.) e la posizione del canale brightfield nello stack di immagini TIF (ad esempio, 3, se brightfield è il terzo canale in uno stack di immagini). Se il file di immagine contiene solo l'immagine brightfield, questo dovrebbe essere uguale a 1.
  2. Eseguire lo script RpEGEN.m e convalidare i risultati.
    NOTA: RpEGEN richiede che Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox e Statistics and Machine Learning Toolbox vengano attivati sulla licenza MATLAB utente per poter essere eseguiti. Inoltre, il readImageJROI toolbox33 disponibile gratuitamente è necessario per importare i ROI FIJI in MATLAB; tuttavia, viene fornito nella cartella RpEGEN insieme ad altri file di funzione M che non richiedono alcuna attivazione.
    1. Esegui lo script facendo clic sul pulsante Esegui nel menu Editor nella parte superiore di MATLAB.
      NOTA: una volta avviato, la finestra di comando fornirà un output dettagliato che indica la progressione dello script. Dopo aver salvato il file MAT contenente i dati estratti, verrà visualizzata una figura a tre pannelli che verrà salvata come PDF nella directory di output per ogni esecuzione dell'immagine. Si tratta di cifre di controllo qualità (QC) per assicurarsi che tutto sia stato eseguito correttamente e includono: 1) l'immagine brightfield sovrapposta dal ROI (Figura 4A); 2) il ROI con asse di mezzeria e distanza angolare associata (gradi) (Figura 4G); e 3) il ROI con i valori di intensità mediana della linea mediana (0-255, scala di colori a 8 bit) (Figura 4H). Attendere che i PDF QC siano stati salvati nella cartella di output e l'ultima figura sia scomparsa prima di procedere al passaggio successivo.
    2. Aprire i singoli PDF esportati nella cartella di output in qualsiasi visualizzatore PDF e verificare che tutti i ROI corrispondano alle immagini brightfield, che i valori di mezzeria siano approssimazioni ragionevoli del centro dei ROI e che i valori di intensità mediana siano adeguatamente popolati con dati (cioè non tutti lo stesso valore su tutta la linea di mezzeria).
      NOTA: una descrizione dettagliata e la struttura di ogni variabile salvata nel file MAT da RpEGEN.m è disponibile nella Tabella 1.
  3. Eseguire lo script RpEGEN_PermPlot.m.
    NOTA: lo script RpEGEN_PermPlot.m utilizza l'output di RpEGEN.m per eseguire confronti statistici utilizzando una simulazione di permutazione delle mediane di due gruppi e fornisce anche il codice per la riproduzione dei grafici in questo documento utilizzando il toolbox GRAMM34 disponibile gratuitamente, che è stato anche incluso nella cartella RpEGEN.
    1. Fare doppio clic sul file RpEGEN_PermPlot.m da aprire in una nuova scheda Editor .
    2. Nella SEZIONE 1 - VARIABILI DEFINITE DALL'UTENTE nel file RpEGEN_PermPlot.m, immettere il percorso della directory per la cartella di output contenente i file MAT dall'esecuzione di RpEGEN.m e immettere ogni nome di file MAT da caricare (ad esempio, DMSO_4dpi.mat, IWR1_4dpi.mat).
    3. Esegui questa sezione dello script facendo clic sul pulsante Esegui sezione nel menu Editor nella parte superiore di MATLAB.
    4. Nella Sezione 2, inserisci i nomi dei due gruppi per il confronto statistico nel data_A e data_B variabili (questi sono i gruppi da cui verranno derivate le mediane usando la simulazione di permutazione). Nella variabile bin_sz , immettere il numero di gradi su cui integrare i valori di intensità mediana per i set di dati (il valore predefinito è 1-degree bins).
      NOTA: la variabile reps indica il numero di permutazioni da utilizzare per creare una distribuzione di probabilità e può essere impostata su qualsiasi numero (il valore predefinito è 20.000). In generale, un numero maggiore di ripetizioni sarà statisticamente più robusto, ma aumenterà il tempo di elaborazione.
    5. Esegui questa sezione dello script facendo clic sul pulsante Esegui sezione nel menu Editor nella parte superiore di MATLAB. Il completamento di questa sezione potrebbe richiedere del tempo a seconda del numero di ripetizioni specificate, ma fornisce un aggiornamento continuo dello stato nella finestra di comando.
    6. Eseguire le sezioni HEATMAP FIGURE e GROUP RESULTS AND P-VALUES in modo indipendente utilizzando il pulsante Esegui sezione . Modifica le variabili di dati in tutte le sezioni commentate con "INSERISCI DATI QUI". I PDF di queste figure vengono salvati automaticamente per ciascuno e possono essere facilmente modificati in qualsiasi post-elaborazione di software vettoriale.
      NOTA: i grafici generati nel file RpEGEN_PermPlot.m sono ad hoc e probabilmente richiederanno modifiche in base alle specifiche esigenze di visualizzazione e dati di ciascun utente. Tuttavia, le cifre forniscono una solida base che può essere facilmente individuata utilizzando sia i siti Web MATLAB che GRAMM.

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Representative Results

È noto che l'inibizione della via di segnalazione canonica Wnt compromette significativamente la rigenerazione RPE del pesce zebra utilizzando il paradigma di ablazione genetica (rpe65a:nfsB-eGFP) e la metodologia di manipolazione farmacologica (IWR-1) descritti nel protocollo3. Questo esperimento è stato ripetuto qui per convalidare un metodo automatizzato per quantificare la rigenerazione RPE del pesce zebra basato sulla pigmentazione. I risultati riassunti di seguito comprendevano tutte le fasi del protocollo, dal giorno della fecondazione (0 dpf) alla quantificazione della rigenerazione RPE utilizzando RpEGEN.

Implementazione del protocollo di ablazione RPE (con manipolazione farmacologica) nel pesce zebra larvale
Gli embrioni raccolti da tre gruppi genitori separati (N = 3) hanno iniziato il trattamento con PTU 1,5x intorno a 6 hpf e l'assenza di pigmentazione nell'RPE e nei melanociti di superficie è stata confermata visivamente su 1 dpf. Gli embrioni sono stati decorientati enzimaticamente su 2 dpf utilizzando 2 mg/ml di pronasi (fase 2.4). Su 4 dpf, le larve sono state anestetizzate usando tricaina (MS-222) e sottoposte a screening per eGFP usando uno stereomicroscopio a fluorescenza (passaggi 3.2 e 5.2). Le larve di eGFP+ sono state spostate in piastre a 6 pozzetti (n = 10 larve/pozzetto) e sono state trattate con DMSO (controllo del veicolo) v/v allo 0,06% o IWR-1 da 15 μM (fase 5.3). La densità larvale qui riportata era inizialmente basata sull'approssimazione di 1 larva / cm2 area di crescita ed è stata convalidata attraverso un attento monitoraggio della salute (ad esempio, lo sviluppo della vescica natatoria) nel tempo. L'intensità di eGFP è apparsa debole su 4 dpf, quindi le larve sono state nuovamente sottoposte a screening su 5 dpf per confermare l'espressione luminosa di eGFP (Figura 1). RPE65 (rpe65a nel pesce zebra) è un marker di RPE7 maturo e, nei pesci teleostei, le cellule retiniche e RPE sono continuamente generate dalla zona marginale ciliare (CMZ), una nicchia di cellule staminali sulla punta distale della retina, adiacente alla lente35. Così, nella linea transgenica rpe65a:nfsB-eGFP, più RPE immaturo esiste alla periferia e appare eGFP- (circa un terzo del tessuto RPE totale) mentre i due terzi maturi e centrali dell'RPE esprimono eGFP (Figura 1B; punte di freccia bianche). Il transgene era visibile anche nella ghiandola pineale (Figura 1A; punta di freccia gialla), che era prevista poiché rpe65a mostra l'espressione pineale nel pesce zebra36. Relativamente deboli o larve di eGFP- sono state estratte da piastre a 6 pozzetti ed eutanasizzate su 5 dpf. Esattamente 24 ore dopo il trattamento con DMSO o IWR-1, 5 larve dpf sono state trattate con 10 mM MTZ per ablare l'RPE (passaggi 3.1, 3.3 e 5.4). MTZ è stato lavato dopo esattamente 24 ore (cioè su 6 dpf / 1 dpi) per consentire la rigenerazione RPE.

Le larve sono state osservate quotidianamente su uno stereomicroscopio utilizzando l'illuminazione a luce trasmessa da 6 dpf/1 dpi al tempo dell'eutanasia su 9 dpf/4 dpi. Il successo dell'ablazione genetica è stato confermato in vivo su 2 dpi dall'assenza di pigmento nei due terzi centrali dell'occhio nelle larve MTZ+ (Figura 2B; punte di freccia rosse) rispetto a 7 fratelli di controllo MTZ dpf (Figura 2A) (fase 4.2). Come anticipato, l'area priva di pigmento su 2 dpi è apparsa analoga alla regione di espressione transgenica rpe65a:nfsB-eGFP osservata su 5 dpf (Figura 1B). La valutazione è stata eseguita su 2 dpi e non prima, poiché l'RPE subisce una ripigmentazione dopo la rimozione della PTU e, a seconda del tempo di osservazione in vivo, una marcata differenza tra l'RPE centrale ablato e l'RPE periferico risparmiato (non pubblicato) può essere difficile da discernere se quest'ultimo non è stato completamente ripigmentato. Nonostante la possibilità di ambiguità macroscopica, l'ablazione RPE a 1 dpi è stata precedentemente dimostrata essere facilmente evidente nel tessuto sezionato, rivelando una perdita di RPE centrale e integrità tissutale dello strato nucleare esterno (ONL; cioè fotorecettore) insieme all'evidenza della morte cellulare (nuclei picnotici) (Figura 5)3. Contrariamente alla perdita di tessuto, è stato determinato che la proliferazione robusta è stata un fattore chiave durante la rigenerazione dei tessuti nel modello di zebrafish rpe65a:nfsB-eGFP3. Sia la risposta apoptotica precoce, dove l'ablazione RPE porta alla degenerazione dei tessuti adiacenti (ad esempio, fotorecettori e membrana di Bruch; La Figura 6A-C) e la risposta proliferativa periferica-centrale che segue, che produce "zone" di rigenerazione eterogenee che si muovono verso l'interno nel sito della lesione (Figura 6D-F), sono state ampiamente caratterizzate e discusse in precedenza3.

Preparazione dei tessuti, acquisizione di immagini confocali e pre-elaborazione delle immagini per la quantificazione automatizzata basata sulla pigmentazione RPE utilizzando RpEGEN
Su 9 dpf/4 dpi, le larve trattate con DMSO e IWR-1 sono state eutanasizzate per sovradosaggio di tricaina e fissate al 4% di PFA per 3 ore a temperatura ambiente (fase 5.6). Quattro larve di ciascun gruppo genitore indipendente sono state scelte in modo casuale per la successiva elaborazione dei tessuti (N = 3; n = 12 larve per trattamento). La crioprotezione, la criosezione (a 12 μm di spessore), la controcolorazione nucleare con DAPI e il montaggio su coverslip sono stati eseguiti come indicato al punto 5.7 5,31. Una sezione centrale, con nervo ottico visibile, da ogni larva è stata fotografata su un microscopio a scansione laser confocale utilizzando un obiettivo di immersione in olio 40x (apertura numerica = 1,30) per acquisire immagini z-stack da 512 x 512 pixel con un intervallo z-step di 1 μm. Ogni immagine conteneva dati da tre canali: canale 1 = eccitazione a 405 nm per DAPI, canale 2 = eccitazione a 488 nm per eGFP, canale 3 = luce trasmessa per campo luminoso. Poiché l'intensità dei pixel è stata quantificata nelle immagini a campo luminoso, le impostazioni di tensione della lampada della luce trasmessa sono state mantenute costanti e tutti i dati raccolti per i confronti statistici sono stati ripresi lo stesso giorno.

Le immagini z-stack del microscopio confocale sono state preelaborate per la quantificazione automatizzata come descritto nella fase 6, utilizzando FIJI. Le immagini sono state escluse dalla pre-elaborazione e dalla quantificazione se il tessuto è stato compromesso in modo da rendere difficile la generazione del ROI (ad esempio, dallo strappo (Figura 7A; punte di freccia magenta) o ostruzione del punto di riferimento (Figura 7B; ovali magenta)) o inclinare le misurazioni dell'intensità del ROI (ad esempio, dalla piegatura (Figura 7C; ovali magenta)). Nonostante l'omissione di alcune larve con questi criteri di esclusione, tutti i set di dati qui riportati rappresentano N = 3 con il seguente numero di repliche biologiche (larve): n = 11, DMSO MTZ-; n = 10, IWR-1 MTZ-; n = 11, DMSO MTZ+; n = 12, IWR-1 MTZ+. Utilizzando il canale DAPI, i ROI RPE sono stati avviati identificando prima il punto in cui il lato apicale dorsale dell'RPE (rivolto verso la retina) era direttamente adiacente alla punta dorsale dell'OLM (Figura 3B',D'; punte di freccia blu) (punto 6.2.2). Poiché l'estensione RPE distale può variare tra le sezioni, l'OLM è stato utilizzato come punto di riferimento anatomico per standardizzare gli endpoint RPE ROI e normalizzare le misurazioni della distanza angolare in MATLAB (dove 0° = endpoint ROI dorsale e 180° = endpoint ROI ventrale). Quando si eseguono ablazioni RPE con manipolazione farmacologica o in un background mutante, un punto di riferimento anatomico deve essere identificato e convalidato prima della pre-elaborazione e della quantificazione. Qui, l'OLM era evidente in tutte le larve quantificate e non era compromesso dallo strappo (come in Figura 7B) o trattamento con DMSO o IWR-1. Dopo aver identificato il punto di partenza dorsale, sono stati generati ROI seguendo il lato apicale dell'RPE (dorsale-ventrale) fino a raggiungere il punto adiacente alla punta dell'OLM ventrale (Figura 3B",D"; punte di freccia blu). Quindi, è stato realizzato un endpoint ROI ventrale tra i lati apicale e basale (rivolto verso la coroide) dell'RPE, come discusso nel passaggio 6.2.3 (Figura 3B",D"; linea magenta). Il ROI è stato continuato, seguendo il lato basale dell'RPE (ventrale-dorsale) fino a raggiungere il lato basale adiacente al punto di partenza all'OLM dorsale. Il ROI è stato quindi racchiuso creando un'estremità dorsale appuntita (Figura 3B',D'; linea magenta) come fatto ventralmente. È stato dimostrato che l'ablazione genetica provoca una perdita dell'espressione centrale di eGFP che viene recuperata man mano che la rigenerazione procede (riassunta in Figura 6)3; pertanto, a seconda dell'entità della rigenerazione e dell'intensità di eGFP nel punto di interesse temporale, il canale eGFP può essere utile solo per la generazione di ROI nell'MTZ- gruppo. Pertanto, mentre le acquisizioni confocali contenevano anche immagini del canale eGFP, la generazione di ROI è stata completata utilizzando i canali DAPI e brightfield come menzionato nel passaggio 6.2.3. La generazione del ROI RPE è stata semplice in MTZ trattati con DMSO e IWR-1- gruppi larvali e regioni comprese con microvilli apicali visibilmente pigmentati (Figura 3B; punta di freccia rossa) insieme ai corpi cellulari pigmentati in modo prominente. Gli stessi parametri sono stati applicati a MTZ+ gruppi larvali (Figura 3D; punta di freccia rossa); tuttavia, a causa del tessuto danneggiato residuo all'interno del sito della lesione, i microvilli apicali e i confini della pigmentazione erano difficili da delineare nel solo canale del campo luminoso in alcuni casi. In queste aree, il canale DAPI è stato utilizzato anche per identificare i detriti cellulari all'interno del sito di lesione RPE, che è stato incluso nel ROI (Figura 3C,D; esempi di detriti cellulari localizzati sul sito della lesione sono indicati con punte di freccia ciano). Immunocolorazione con marcatori di RPE immaturo/maturo (ad esempio, ZPR2; Figura 6D,E)37 e/o fotorecettori (ad esempio, ZPR1)37,38 potrebbe anche essere impiegato per facilitare la delineazione di ROI RPE in larve ablate.

In precedenza, le larve ablate trattate con IWR-1 da 4 dpf a 4 dpi mostravano una significativa compromissione della rigenerazione RPE rispetto ai controlli fratelli trattati con DMSO (Figura 8C)3. Questo è stato riportato come la percentuale di recupero del pigmento centrale, che ha richiesto una sostanziale esperienza precedente con il modello e misurazioni manuali della distanza angolare per designare i confini di rigenerazione (Figura 8B; punte di freccia nere). RpEGEN è stato creato per automatizzare la quantificazione della rigenerazione RPE e ridurre i bias intrinseci. Non solo, RpEGEN ha anche permesso la generazione di set di dati altamente robusti; ad esempio, 10 punti dati sono stati precedentemente generati dalla quantificazione manuale di n = 10 larve MTZ+ trattate con DMSO (Figura 8C; % di recupero del pigmento per misurazioni di sezione)3, mentre 174.801 punti dati sono stati generati da n = 11 larve/ROI MTZ+ trattate con DMSO utilizzando RpEGEN (Figura 9C; misurazioni dell'intensità dei pixel).

RpEGEN è stato sviluppato per valutare in modo incrementale i cambiamenti regionali nella pigmentazione sull'intera RPE derivando un asse di mezzeria scheletrato (larghezza di 1 pixel) dal ROI originale generato utilizzando FIJI (Figura 4A, B). Per incorporare tutti i pixel all'interno del ROI per l'analisi (cioè non solo i pixel dell'asse di mezzeria), è stata eseguita una trasformazione della distanza euclidea su ciascun pixel dall'asse di mezzeria per creare una mappa dell'indice di mezzeria più vicino per ogni pixel nella maschera ROI. Questa mappa di indici consentiva di attribuire ogni pixel al di fuori dell'asse di mezzeria a un singolo pixel di mezzeria, creando un set di dati completo sull'intero RPE per ogni larva (Figura 4E). La lunghezza dorsale-ventrale dell'RPE era rappresentata dalla distanza angolare (Figura 4G; 0-180°) rispetto alla distanza pixel normalizzata (Figura 4F; 0-1 unità arbitrarie), in quanto ciò era più intuitivo sulla base delle precedenti misurazioni della rigenerazione RPE 3,4,5 e del fatto che la distanza angolare non varia con le differenze morfologiche. Le intensità mediane derivate dai contenitori a 5 gradi sono state la metrica scelta per evidenziare le tendenze su larga scala e ridurre al minimo la variabilità ad alta frequenza osservata nei dati binned di 1 grado (Tabella 1, Figura 10A). La simulazione di permutazione è stata scelta per testare l'ipotesi nulla per vedere se le mediane dei due gruppi di trattamento (qui, DMSO MTZ+ e IWR-1 MTZ+ (entrambi 4 dpi), Figura 10B) sono simili39. Questa tecnica di ricampionamento manca di ipotesi rigorose sulla distribuzione dei dati e può essere utilizzata su una serie di statistiche di test (ad esempio, media, mediana, ecc.) per generare solide stime del valore p. Alcuni di questi parametri (ad esempio, dimensione del cestino dei dati grezzi e mediani, ripetizioni della simulazione di permutazione, ecc.) possono essere adattati e modificati in base alle esigenze dell'utente. Per quest'ultimo, sono state scelte 20.000 ripetizioni per generare un confronto statisticamente robusto, tuttavia, è necessario prestare attenzione a bilanciare l'efficienza computazionale con la robustezza statistica poiché troppo poche ripetizioni possono produrre stime errate del valore p. Si raccomanda di eseguire più valori di ripetizione (10.000, 20.000, ecc.) per garantire che la distribuzione e i valori del valore p siano relativamente stabili prima di iniziare le interpretazioni. Aumentare le ripetizioni di permutazione aumenterà la potenza statistica (ma richiederà anche più tempo per essere eseguito), il che potrebbe essere utile per alcuni set di dati.

I set di dati di immagini confocali sono stati quantificati utilizzando RpEGEN come descritto nel passaggio 7. Gli script RpEGEN e di supporto annotati sono disponibili su GitHub (https://github.com/burchfisher/RpEGEN) insieme al TIF a 8 bit e ai corrispondenti file ROI per gli utenti interessati da testare. Le mappe di calore che mostravano i dati grezzi dei ROI larvali MTZ-mostravano una distribuzione complessiva delle intensità dei pixel più scuri (dove 0 = nero e 255 = bianco, scala di colori a 8 bit) che si estendeva dalla lunghezza dorsale (0°) a ventrale (180°) dell'RPE, indipendentemente dal trattamento con 0,06% v/v DMSO o 15 μM IWR-1 (Figura 9A,B). Il grafico delle intensità dei pixel mediani ha facilitato la visualizzazione tra tutti i gruppi e ha mostrato somiglianze tra i gruppi MTZ attraverso l'RPE (Figura 10A; linee nere e grigie). Questi dati hanno supportato la presenza di un monostrato RPE pigmentato intatto (Figura 9E, F) e hanno fornito valori di intensità dei pixel mediani di base (cioè inferiori a 150) per RPE non barrato (Figura 10A; linee nere e grigie). Comparativamente, i dati grezzi (Figura 9C, D) e mediani (Figura 10A; linee blu e rosse) dei ROI larvali MTZ + hanno mostrato una distribuzione complessiva delle intensità dei pixel più leggeri nell'RPE centrale, ancora una volta, indipendentemente dalle condizioni di trattamento. Le larve trattate con DMSO ablate hanno mostrato una distribuzione centralizzata dei pixel di luce a circa 100 ° (± 15 °) (Figura 9C; bidoni rosso-arancio). Ciò corrispondeva a una visibile assenza di pigmentazione nel sito centrale della lesione RPE all'interno / intorno al nervo ottico (Figura 9G; punte di freccia blu). Le larve trattate con IWR-1 ablate hanno anche mostrato una distribuzione centralizzata dei pixel di luce che sono stati espansi sia dorsalmente (a circa 50°) che ventralmente (di circa 5°) rispetto ai controlli fratelli trattati con MTZ+ DMSO (Figura 9D; bidoni rosso-arancio). La presenza di un sito di lesione espanso era chiaramente visibile nel tessuto sezionato (Figura 9H; punte di freccia blu). Fatta eccezione per due contenitori di 1 grado, la differenza osservata tra i gruppi MTZ+ era statisticamente significativa nell'RPE centrale (Figura 10B; area ombreggiata azzurra tra ~40-140°; il valore p ≤ 0,05), che indica una pigmentazione RPE centrale significativamente inferiore nelle larve trattate con MTZ+ IWR-1 rispetto ai controlli fratelli trattati con MTZ+ DMSO. L'interpretazione di questi dati grezzi (Figura 9C,D) e mediani (Figura 10A) con confronto statistico (Figura 10B) utilizzando RpEGEN è stata convalidata non solo osservando il tessuto sezionato (Figura 9G,H), ma ha anche supportato i risultati precedenti della quantificazione manuale (Figura 8)3.

Figure 1
Figura 1: espressione transgenica di rpe65a:nfsB-eGFP a 5 giorni dalla fecondazione. (A-C) Immagini integrali di una larva di 5 dpf trattata con PTU che mostrano una debole espressione transgenica nella ghiandola pineale (A; punta di freccia gialla) e un'espressione transgenica brillante nell'RPE (B, C) al momento dello screening per l'ablazione genetica. (B) L'espressione transgenica è visibilmente localizzata ai due terzi centrali dell'RPE, e le punte di freccia bianche evidenziano il confine tra RPE periferico (immaturo) e centrale (maturo). Verde = eGFP. Anterior è su. Barre di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Verifica del successo dell'ablazione genetica dell'RPE in vivo. Immagini integrali di (A) tre larve non blate (MTZ-) 7 dpf che mostrano la pigmentazione RPE in tutto l'occhio e (B) tre larve ablate (MTZ +) da 2 dpi che mostrano una zona di ablazione in cui vi è un'assenza di pigmento nei due terzi centrali dell'RPE (punte di freccia rosse). Anterior è su. Barre di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Regioni di interesse RPE (ROI) per la quantificazione automatizzata utilizzando RpEGEN. Criosezioni trasversali di (A,B) una larva non bulata (MTZ-) 9 dpf e (C,D) una larva ablata (MTZ+) da 4 dpi con i ROI RPE evidenziati in magenta. (B,D) Le punte di freccia rosse evidenziano le regioni in cui i microvilli apicali visibilmente pigmentati sono stati inclusi nel ROI. (C,D) Le punte di freccia ciano indicano regioni di esempio di detriti DAPI+ localizzati nel sito di lesione, che sono stati utilizzati per includere i detriti delle cellule RPE nel ROI. (B',B",D',D") Gli zoom digitali delle regioni ROI dorsale e ventrale (caselle tratteggiate nere in B e D) mostrano i punti di partenza del ROI suggeriti (punte di freccia blu) e le estremità del ROI appuntite che sono fondamentali per il rilevamento degli endpoint in MATLAB. Le immagini Di Campo Luminoso sono mostrate anche nella Figura 9E,G. Bianco/grigio = nuclei. La dorsale è in alto e distale è sinistra. (A-D) Barre di scala = 40 μm. (B',B",D',D") Barre di scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Flusso di lavoro di elaborazione RpEGEN. (A) Esempio di un'immagine brightfield a 8 bit correttamente orientata e ROI (rosso) generato da FIJI importato in MATLAB. La dorsale è in alto e distale è sinistra. La barra dei colori rappresenta i valori di intensità della scala di grigi a 8 bit, dove 0 = nero e 255 = bianco. (B) Scheletratura binaria iniziale (bianca) della maschera ROI (rossa) che mostra la presenza di speroni errati e la delineazione dei punti iniziale e finale per la delineazione della distanza dei pixel geodetici come mostrato in (C). La barra dei colori in (C) rappresenta la distanza dei pixel euclidei. (D) Gli speroni vengono rimossi utilizzando un percorso semplificato a basso costo dal pixel finale al pixel iniziale, risultando in una linea mediana continua priva di speroni (rosso). (E) Indici lineari di mezzeria più vicini basati su una trasformazione di distanza tra tutti i pixel nella maschera ROI e i pixel dell'asse di mezzeria (bianco). Questi valori di indice consentono di assegnare ogni pixel dell'immagine all'interno della maschera ROI al pixel di mezzeria più vicino per l'analisi. La barra dei colori rappresenta i valori dell'indice pixel lineare dell'asse di mezzeria. (F) Un esempio della distanza di pixel normalizzata lungo l'asse di mezzeria, dove 0 (blu, pixel dorsale distale) è il pixel iniziale e 1 (rosso, pixel ventrale più distale) è il pixel finale. (G) Simile a (F) ma usando la distanza angolare, dove 0 gradi (blu) è il pixel iniziale e 180 gradi (rosso) è il pixel finale. (H) Esempio dei valori di intensità mediana dei pixel calcolati per ogni pixel di mezzeria. La barra dei colori rappresenta il valore mediano dell'intensità della scala di grigi di tutti i pixel ROI che contribuiscono a ciascun pixel di mezzeria. Questa figura mostra le immagini di un set di dati di test e non le larve dei gruppi di trattamento 0,06% v / v DMSO o 15 μM IWR-1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Evidenza di ablazione RPE e degenerazione dei fotorecettori. (A) Criosezioni trasversali di una larva nonblata di 6 dpf. (A,A') Dopo l'esposizione alla PTU, l'espressione transgenica è limitata alle cellule RPE mature, con l'espressione più brillante confinata ai due terzi centrali dell'RPE. Le punte di freccia indicano microvilli apicali. (A") Le immagini DIC (Differential Interference Contrast) rivelano la normale architettura dello strato nucleare esterno (ONL, cioè fotorecettore). (B,B») Le criosezioni trasversali di una larva di 1 dpi rivelano una significativa interruzione della morfologia cellulare eGFP+ e la disorganizzazione nella laminazione ONL. Le frecce indicano nuclei delaminato e picnotici. (B") Le immagini DIC rivelano inoltre la marcata interruzione dell'architettura ONL. Verde = eGFP, blu = nuclei, giallo = ONL. La dorsale è in alto e distale è sinistra. La barra di scala in (A) rappresenta 40 μm e può essere applicata a (B). La barra di scala in (A') rappresenta 40 μm e può essere applicata a (A",B',B"). Questa figura e il testo della legenda della figura sono stati modificati da Hanovice et al. 2019 (Figura 1)3. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Modello di rigenerazione RPE nel pesce zebra larvale. (A) nfsB-eGFP è espresso in RPE maturo nei due terzi centrali dell'occhio. (B) L'applicazione di MTZ porta all'apoptosi (TUNEL, rosso) di RPE e fotorecettori. (C) L'ablazione della RPE porta alla degenerazione dei fotorecettori e della membrana di Bruch (linea tratteggiata). (D) L'RPE non pubblicato nella periferia inizia a proliferare e ad estendersi nel sito della lesione (blu). (E) Quando l'RPE eGFP+ rigenerato appare nella periferia, l'RPE può essere diviso in quattro zone: RPE periferico (pRPE), RPE differenziato (dRPE), zona di transizione (TZ) e sito di lesione (IS). (E, inserto) L'RPE differenziato rigenerato (verde) appare nella periferia prossimale all'RPE periferico non barrato e contiene cellule proliferative adiacenti alla zona di transizione. La zona di transizione è costituita da cellule RPE ancora differenzianti (ZPR2, rosso) e cellule proliferative (blu). Il sito di lesione comprende cellule proliferate non pigmentate che non esprimono alcun marcatore di differenziazione RPE. (F) La rigenerazione di uno strato RPE funzionale e della membrana di Bruch è completa di 14 dpi. Questa figura e il testo della legenda della figura sono stati modificati da Hanovice et al. 2019 (Figura 14)3. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Sezioni di tessuto compromesse escluse dall'analisi delle immagini. (A-C) Criosezioni trasversali di larve dal DMSO 0,06% v/v e dai set di dati IWR-1 da 15 μM che soddisfacevano i criteri di esclusione. Una larva mostra lacerazione del tessuto RPE dorsale (A; punte di freccia magenta) e altre due larve mostrano un ripiegamento del tessuto che ostruisce un punto di riferimento anatomico (OLM dorsale) nel canale DAPI (B; ovali punteggiati magenta) o può distorcere le misurazioni dell'intensità RPE dal canale brightfield (C; ovali punteggiati magenta). Bianco/grigio = nuclei. La dorsale è in alto e distale è sinistra. Barre di scala = 40 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: L'inibizione farmacologica con IWR-1 compromette la rigenerazione dell'RPE. Criosezioni trasversali di larve ablate (MTZ+) a 4 dpi da (A) 0,06% v/v DMSO e (B) 15 μM IWR-1 gruppi di trattamento. Le immagini a campo luminoso (A, B) e la quantificazione della percentuale di recupero / sezione RPE (C) mostrano un ritardo significativo nel recupero di un monostrato pigmentato nelle larve trattate con IWR-1 (Student's unpaired t-test, *** p < 0,0001). (B) Le punte di freccia nere indicano il bordo più centrale dell'RPE rigenerante. La dorsale è in alto e distale è sinistra. La barra di scala in (B) rappresenta 40 μm e può essere applicata a (A). Questo testo della figura e della legenda della figura è stato modificato da Hanovice et al. 2019 (Figura 13)3. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 9
Figura 9: Output di dati grezzi dalla quantificazione automatizzata della rigenerazione RPE in RpEGEN. (A-D) Heatmaps che mostrano distribuzioni di intensità dei pixel brightfield compilate dall'intera regione RPE ROI, da dorsale (assi x; distanza angolare = 0°) a ventrale (assi x; distanza angolare = 180°), per tutte le larve in ciascun set di dati: (A) n = 11, DMSO MTZ-; (B) n = 10, IWR-1 MTZ-; (C) n = 11, DMSO MTZ+; (D) n = 12, IWR-1 MTZ+ (da tre gruppi genitori indipendenti, N = 3). Ad esempio, (A) visualizza i dati da 177.460 pixel su 11 ROI. Sugli assi y, l'intensità dei pixel viene visualizzata in base a una scala di colori a 8 bit in cui 0 = nero e 255 = bianco. I dati grezzi vengono visualizzati in contenitori con valore di intensità a 5 gradi (asse x) e 5-8 bit (asse y) in cui rosso = numero massimo di contenitori e blu scuro = numero minimo di contenitori. (E-H) Criosezioni trasversali di larve rappresentative (E,F) non blop (MTZ-) 9 dpf e larve (G,H) ablate (MTZ+) da 0,06% v/v DMSO e 15 μM IWR-1 gruppi di trattamento. I ROI RPE sono evidenziati in magenta e sono indicati gli estremi di distanza angolari (0° = dorsale, 180° = ventrale). In generale, questi dati mostrano la distribuzione di pixel più scuri (valori di intensità tra 0-150) in ROI non estesi (A, B, E, F) rispetto ai ROI ablati (C, D, G, H), indipendentemente dal trattamento. I dati dei ROI ablati mostrano (C, G) distribuzione centralizzata (100 ° ± 15 °) di pixel più leggeri (valori di intensità tra 150-250) nel gruppo di trattamento DMSO che (D, H) si espande dorsalmente (a ~ 50 °) e leggermente ventralmente (di ~ 5 °) nelle larve trattate con IWR-1. (G,H) Queste zone di ablazione centrale prive di pigmento sono evidenziate da punte di freccia blu. Le frecce nere indicano la posizione del nervo ottico. Le immagini delle larve trattate con DMSO sono mostrate anche nella Figura 3. Barre di scala = 40 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 10
Figura 10: Risultati di gruppo e confronto statistico derivati dalla quantificazione automatizzata della rigenerazione RPE in RpEGEN. (A) valori mediani binned a 5 gradi e buste di confidenza al 95% derivate dai dati grezzi per ciascun gruppo. Il grafico mostra somiglianze tra i gruppi MTZ- (linee nere e grigie) attraverso la lunghezza dorsale (0°) e ventrale (180°) dell'RPE con notevoli differenze tra e tra i gruppi MTZ+ (linee blu e rosse) nell'RPE centrale (area ombreggiata blu chiaro tra ~40-140°). In particolare, l'intensità mediana dei pixel appare più chiara (0 = nero e 255 = bianco) nell'IWR-1 MTZ+ 4 dpi rispetto a qualsiasi altro gruppo di trattamento, che corrisponde a una diminuzione della pigmentazione RPE centrale. (B) Un confronto statistico dei valori mediani derivati dai contenitori di 1 grado attraverso la lunghezza dorsale (0°) a ventrale (180°) dell'RPE per DMSO MTZ+ 4 dpi e IWR-1 MTZ+ 4 dpi rafforza l'osservazione in (A). I valori p sono stati calcolati utilizzando una simulazione di permutazione con 20.000 ripetizioni e un test a due lati per ogni contenitore di 1 grado. Nell'ipotesi nulla che i due gruppi abbiano valori mediani simili per ogni corrispondente bin di 1 grado, un valore p ≤ 0,05 indica una differenza statisticamente significativa tra le mediane del gruppo (linea nera tratteggiata = intervallo di confidenza al 95% (CI)). La presenza di valori p ≤ 0,05 attraverso l'RPE centrale (area ombreggiata blu chiaro tra ~ 40-140 °) indica una pigmentazione significativamente inferiore nelle larve trattate con IWR-1 ablate (MTZ +) rispetto ai controlli fratelli trattati con DMSO ablati (MTZ +). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nome variabile Tipo di variabile Dimensione variabile Descrizione variabile
Nome ROIname Cellula {N x 1} Nomi dei file ROI elaborati
ROIxy Cellula {N x 1} Vertici ROI per ogni file ROI elaborato
NOME IMG Cellula {N x 1} Nomi dei file di immagine TIF elaborati
IMG · Cellula {N x 1} Dati immagine brightfield a 8 bit per ogni TIF elaborato
ROIBW · Cellula {N x 1} Maschera ROI logica (0 o 1) con le stesse dimensioni delle immagini IMG
Cline Cella con tabelle {N x 1} (n x 16) Dati della linea di mezzeria per singole immagini tra cui x, y, distanza, angolo, indice, numero di punti e statistiche
CIdx · Cellula {N x 1} Dati dell'indice centerline relativi alla maschera ROI punta al punto di mezzeria più vicino per il calcolo di CLine
CLineBW Cellula {N x 1} Matrice logica (0 o 1) con le stesse dimensioni delle immagini IMG che indicano la posizione dell'asse di mezzeria (=1)
RAW_data Tavolo N x 3 Tabella che combina tutti i dati grezzi per ogni pixel nel ROI in tutte le diverse immagini IMG
BIN_1_deg_all Tavolo N x 9 Tabella contenente dati e statistiche associati a 1 grado che utilizzano i dati di RAW_data
BIN_5_deg_all Tavolo N x 9 Tabella contenente dati e statistiche associati a 5 gradi utilizzando i dati di RAW_data
BIN_10_deg_all Tavolo N x 9 Tabella contenente dati e statistiche associati a 10 gradi utilizzando i dati di RAW_data

Tabella 1: Descrizione delle variabili esportate dallo script RpEGEN.m al file MAT. Le definizioni sono le seguenti: ROI = regione(e) di interesse; TIF = formato di file immagine con tag.

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Discussion

Questo protocollo descrive la metodologia per ablare geneticamente l'RPE e studiare i meccanismi di degenerazione e rigenerazione nel pesce zebra di età larvale. Questo protocollo è stato eseguito con successo anche nel pesce zebra adulto3 ma con una caratterizzazione meno estesa, motivo per cui le larve sono al centro dell'attenzione. Gli aspetti critici di questa parte del protocollo (fasi 1-4) includono: 1) aggiunta di 1,5x PTU agli embrioni prima dell'inizio della melanogenesi, 2) decorionazione di embrioni trattati con PTU su 2-3 dpf, 3) attento screening per eGFP e 4) tempistica dei cambi d'acqua durante l'ablazione genetica con MTZ. La PTU inibisce la sintesi della melanina21,22 ed è stata utilizzata in questo paradigma di ablazione RPE per facilitare lo screening per l'espressione transgenica di rpe65a:nfsB-eGFP e per consentire la caratterizzazione dei processi degenerativi e rigenerativi rpE in base all'assenza e al successivo ritorno, rispettivamente, del tessuto pigmentato3. Poiché la PTU inibisce un'ulteriore pigmentazione, ma non depigmenta i tessuti una volta che la melanogenesi è iniziata21, la PTU deve essere aggiunta prima dell'inizio della pigmentazione, che inizia intorno ai 24 hpf nel pesce zebra25. Qui, e in studi precedenti 4,5, PTU è stato aggiunto a circa 6 hpf26 per garantire l'inibizione prima che inizi la sintesi della melanina. Mentre la PTU consente la visualizzazione delle fasi chiave del protocollo, il trattamento con PTU può influenzare alcuni aspetti dello sviluppo (come discusso nella fase 2.3) e compromettere la schiusa degli embrioni. Quest'ultimo processo, se ritardato troppo a lungo, può portare a deficit morfologici e di motilità e influire sulla vitalità40; pertanto, la decorionazione (schiusa) degli embrioni sia enzimaticamente con pronasi che manualmente utilizzando pinze su 2-3 dpf è importante per mantenere e standardizzare la salute larvale prima dell'ablazione genetica. Un'altra considerazione importante per evitare problemi con la salute e la vitalità delle larve più vecchie (non correlate al trattamento PTU), è che le larve dovrebbero iniziare regimi di alimentazione standardizzati se rimangono fuori da un sistema di strutture acquatiche oltre 9 dpf / 4 dpi per gli esperimenti41.

Come spiegato, rpe65a guida l'espressione transgenica in RPE maturo nei due terzi centrali dell'occhio posteriore. L'espressione di eGFP nelle larve di 5 dpf trattate con PTU è normalmente facilmente rilevabile e visibilmente intensa (luminosa), come mostrato nella Figura 1. Si possono anche osservare larve che esprimono vagamente eGFP a 5 dpf rispetto ai fratelli con espressione brillante. Possono anche esistere variazioni nei rapporti di intensità dell'espressione (cioè luminoso vs debole) tra le generazioni, con alcune generazioni che hanno larve che esprimono più debolmente di altre. In ogni caso, le larve con espressione debole di eGFP di solito rappresentano una minoranza degli animali in ogni frizione. Mentre non è noto se le larve che esprimono scarsamente mostrino fenotipi di lesioni RPE meno gravi, le ablazioni sono state eseguite nella coorte eGFP + brillante da ciascuna frizione e fratelli relativamente deboli sono stati eutanasizzati allo screening ed esclusi dall'analisi. Allo stesso modo, un'ampia caratterizzazione dei fenotipi di ablazione e rigenerazione RPE del pesce zebra è stata eseguita in larve eterozigoti per il transgene rpe65a:nfsB-eGFP, incrociando gli adulti eterozigoti rpe65a:nfsB-eGFP con gli adulti wildtype3. È improbabile, tuttavia, non è noto se le larve omozigoti per rpe65a:nfsB-eGFP mostrino fenotipi di ablazione più gravi. Altri sforzi per standardizzare il protocollo di ablazione includono l'aggiunta di volumi uguali e misurati (ad esempio, 30 ml per capsula di Petri da 10 cm) a piastre MTZ e MTZ + durante il periodo di ablazione genetica di 24 ore. Allo stesso modo, le larve nei piatti di trattamento farmacologico hanno ricevuto volumi uguali e misurati (ad esempio, 5 ml per 6 pozzetti) e un rifornimento tempestivo di composti freschi (ad esempio, ogni 24 ore). Quando si maneggiano piatti con diversi trattamenti MTZ e/o composti farmacologici, devono essere prese misure accurate per prevenire fuoriuscite e contaminazioni incrociate involontarie durante il trasporto e i cambi d'acqua.

Il protocollo di ablazione RPE di zebrafish può essere modificato per includere la manipolazione farmacologica (fase 5). Questo è stato fatto in precedenza per identificare le vie di segnalazione della risposta immunitaria5, mTOR4 e Wnt3 come regolatori critici della rigenerazione RPE; quest'ultimo ha dimostrato di essere ripetibile qui ed è stato utilizzato per convalidare RpEGEN. Oltre a illuminare i percorsi critici di rigenerazione RPE, la manipolazione farmacologica è stata ampiamente utilizzata per gli studi di rigenerazione retinica del pesce zebra 10,42,43,44,45,46,47. Prima di essere incorporati nel protocollo di ablazione RPE, gli agenti farmacologici devono essere rigorosamente valutati per tossicità, efficacia e durata del trattamento. Questo può essere fatto mediante: esecuzione di esperimenti dose-risposta per valutare la tossicità48; valutare l'espressione di geni/proteine bersaglio noti 4,5; e valutando le conseguenze funzionali note della manipolazione farmacologica, ad esempio l'esaurimento dei leucociti con il trattamento PLX3397 48,49,50,51. Qui, DMSO (controllo del veicolo) e IWR-1 sono stati aggiunti 24 ore prima dell'ablazione genetica e le larve sono state sottoposte a screening immediatamente prima del pretrattamento farmacologico su 4 dpf. Mentre le larve di eGFP+ sono distinguibili dalle larve di eGFP su 4 dpf, l'intensità di eGFP può apparire piuttosto debole, motivo per cui le larve sono state nuovamente sottoposte a screening per l'espressione di eGFP su 5 dpf (Risultati rappresentativi). Lo screening per eGFP prima di 4 dpf può essere difficile in quanto l'espressione può essere così bassa da non essere rilevabile alla vista. Pertanto, il pretrattamento con agenti farmacologici prima di 4 dpf (cioè su 2 dpf)4 può essere aggiunto a larve non schermate che saranno separate su 5 dpf quando eGFP è chiaramente visibile. In qualsiasi scenario in cui le larve devono essere manipolate (ad esempio, durante lo screening, l'incorporamento per l'imaging, ecc.), Le condizioni di trattamento farmacologico devono essere mantenute e, indipendentemente dall'età dello screening, l'RPE deve essere ablato con MTZ su 5 dpf.

Oltre al protocollo di ablazione genetica, vengono delineate le istruzioni passo-passo per la pre-elaborazione delle immagini al microscopio confocale e la quantificazione automatizzata della rigenerazione RPE utilizzando RpEGEN (passaggi 6-7). RpEGEN è stato creato per standardizzare la quantificazione della rigenerazione RPE tra gli utenti e aumentare la robustezza del set di dati di output, riducendo al minimo i pregiudizi intrinseci che possono derivare dalla noiosa quantificazione manuale eseguita in precedenza. Gli aspetti critici di questa parte del protocollo vengono eseguiti durante la generazione del ROI (fase 6). In primo luogo, l'immagine / occhio deve essere nell'orientamento dorsale verso l'alto, distale a sinistra (ad esempio, Figura 3A-D, Figura 4) poiché RpEGEN è stato ottimizzato per questa direzionalità. È anche fondamentale che le estremità terminali dorsali e ventrali del ROI RPE si assottiglino fino a una punta appuntita come mostrato in Figura 3B',B',D',D" (linee magenta). Se queste estremità sono invece quadrate o arrotondate, lo script RpEGEN potrebbe avere difficoltà a determinare i pixel di inizio e fine dello scheletro dell'asse di mezzeria e potrebbe generare speroni alle estremità del ROI del terminale anziché a una linea centralizzata (Figura 4B). Gli speroni alle estremità del ROI terminale potrebbero portare ad accorciamento della linea mediana durante la de-spuring (Figura 4D) e/o a problemi con le misurazioni della distanza angolare nell'RPE periferico (Figura 4G). Sistemi di denominazione identici per i file TIF e ROI corrispondenti a ogni singola larva sono anche un passo significativo e un imperativo per accoppiare il file TIF a 8 bit con il ROI corretto in RpEGEN. Nomi di file TIF e ROI non corrispondenti comporteranno la mancata generazione del flusso di lavoro di elaborazione RpEGEN descritto nella sezione Risultati rappresentativi (Figura 4) e, in definitiva, impediranno la quantificazione della rigenerazione RPE utilizzando questo script.

Collettivamente, questo protocollo fornisce istruzioni per ablare con successo l'RPE nel pesce zebra larvale, per manipolare le vie di segnalazione che possono essere di interesse pre-, durante o post-RPE injury e per quantificare la rigenerazione RPE in modo standardizzato con pregiudizi intrinseci limitati. Nel contesto dei modelli disponibili in vivo e in vitro in cui studiare il potenziale rigenerativo dell'RPE, il pesce zebra è unico nella sua capacità di rigenerazione intrinseca dell'RPE14. Tuttavia, questo è un modello acuto di danno RPE, non cronico come lo sono le malattie degenerative RPE mirate per lo sviluppo terapeutico (ad esempio, AMD). Mentre questa è una limitazione del modello, rimane un'eccellente piattaforma in cui studiare i meccanismi di rigenerazione RPE, che sono in gran parte sconosciuti e potrebbero essere adattabili in futuro per studiare lesioni croniche e malattie. Gli strumenti e la metodologia qui descritti sono versatili e potrebbero essere applicati anche agli studi dei processi cellulari coinvolti nella risposta degenerativa e allo studio del destino dei tessuti RPE-adiacenti post-ablazione. Allo stesso modo, lo script RpEGEN potrebbe essere modificato per soddisfare le esigenze di output dei dati dell'utente; ad esempio, per eseguire analisi spaziali di marcatori diversi dal pigmento (ad esempio, sonde di ibridazione in situ , espressione proteica, ecc.).

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Disclosures

L.L.L. è il co-inventore del brevetto statunitense n. 9.458.428, che descrive un metodo accelerato per derivare l'epitelio pigmentato retinico da cellule staminali pluripotenti umane; questo non è correlato al contenuto del presente documento. J.M.G. e G.B.F. non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Il lavoro qui descritto è stato supportato dal National Institutes of Health (RO1-EY29410 a J.M.G e NIH CORE Grant P30-EY08098 al Dipartimento di Oftalmologia); il Centro Immunotrapianto e Terapia UPMC (a L.L.L. e J.M.G.); e la Cattedra E. Ronald Salvitti in Ricerca Oftalmologica (a J.M.G.). Un ulteriore sostegno è stato ricevuto dalla Wiegand Fellowship in Ophthalmology (a L.L.L), dalla Eye & Ear Foundation di Pittsburgh e da una sovvenzione illimitata da Research to Prevent Blindness, New York, NY. Gli autori desiderano anche ringraziare Amanda Platt per l'assistenza tecnica e il Dr. Hugh Hammer e lo staff acquatico per l'eccellente supporto alla cura degli animali.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lab Material/Equipment
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI) Millipore Sigma D9542
6-well plates Fisher Scientific 07-200-83
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 05-539-13 Catalog number is for 50 mL tubes
Diamond tip scribing pen Fisher Scientific 50-254-51 Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 % Fisher Scientific BP231 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Embryo incubator (large) Fisher Scientific 3720A
Embryo incubator (mini/tabletop) Labnet I5110A
Fluorescence stereo microscope Zeiss Axio Zoom.V16 Or similar, with 488 nm excitation laser/filter
Glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-4 Manufactured by Corning, non-sterile
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo Millipore Sigma 5.04462 Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements
Methylene blue (powder) Fisher Scientific BP117-100 Also available as a premade aqeuous solution
Metronidazole (MTZ) Millipore Sigma M3761 Check instiutional chemical waste disposal requirements
N-phenylthiourea (PTU) Millipore Sigma P7629 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free Fisher Scientific AA433689M Chemical waste, proper disposal required
Petri dishes Fisher Scientific FB0875712 10 cm diameter
Phosphate buffered saline (powder packets) Millipore Sigma P3813 Used to make 10 X PBS stock
Pronase Millipore Sigma PRON-RO
Shaking incubator Benchmark H2010 Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius
Stereo microscope Leica S9i Or similar, with transmitted light illumination
Student Dumont #5 forceps Fine Science Tools 91150-20 Fine-tipped forceps for manual dechorionation
Tabletop rotator/shaker Scilogex SK-D1807-E
Transfer pipette Millipore Sigma Z135003 3.2 mL bulb draw, non-sterile
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Pentair TRS1, TRS2, TRS5 Also available from Fisher Scientific (NC0342409)
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Software Material
FIJI (Fiji is Just ImageJ) FIJI (Fiji is Just ImageJ) https://imagej.net/software/fiji/ Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats
GRAMM examples and how-tos MathWorks https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.
MATLAB MathWorks https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox
MATLAB support MathWorks https://www.mathworks.com/support.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Biologia Numero 181 zebrafish epitelio pigmentato retinico nitroreduttasi metronidazolo ablazione genetica rigenerazione pigmentazione composti farmacologici RpEGEN
Ablazione mediata da nitrorefuttasi/metronidazolo e una piattaforma MATLAB (RpEGEN) per lo studio della rigenerazione dell'epitelio pigmentato retinico zebrafish
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Leach, L. L., Fisher, G. B., Gross,… More

Leach, L. L., Fisher, G. B., Gross, J. M. Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (181), e63658, doi:10.3791/63658 (2022).

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