Detta protokoll beskriver metoden för att genetiskt ablate retinal pigmentepitel (RPE) med hjälp av en transgen zebrafiskmodell. Att anpassa protokollet för att införliva signalvägsmodulering med hjälp av farmakologiska föreningar är utförligt detaljerat. En MATLAB-plattform för kvantifiering av RPE-regenerering baserat på pigmentering har utvecklats och presenteras och diskuteras.
Retinal pigmentepitelet (RPE) finns på baksidan av ögat och utför funktioner som är väsentliga för att upprätthålla hälsan och integriteten hos intilliggande retinala och vaskulära vävnader. För närvarande har den begränsade reparativa kapaciteten hos däggdjurs RPE, som är begränsad till små skador, hindrat framsteg mot att förstå RPE-regenerativa processer in vivo . Här tillhandahålls en detaljerad metod för att underlätta studien av in vivo RPE-reparation med zebrafisken, en ryggradsdjursmodell som kan robust vävnadsregenerering. Detta protokoll beskriver ett transgent nitroreduktas/metronidazol (NTR/MTZ)-medierat skadeparadigm (rpe65a:nfsB-eGFP), vilket resulterar i ablation av de centrala två tredjedelarna av RPE efter 24 timmars behandling med MTZ, med efterföljande vävnadsåterhämtning. Fokus läggs på RPE-ablationer i larvzebrafiskar och metoder för att testa effekterna av farmakologiska föreningar på RPE-regenerering beskrivs också. Generering och validering av RpEGEN, ett MATLAB-skript skapat för att automatisera kvantifiering av RPE-regenerering baserat på pigmentering, diskuteras också. Utöver aktiva RPE-reparationsmekanismer kan detta protokoll utvidgas till studier av RPE-degenerering och skaderespons samt effekterna av RPE-skador på intilliggande retinala och vaskulära vävnader, bland andra cellulära och molekylära processer. Detta zebrafisksystem har ett betydande löfte om att identifiera gener, nätverk och processer som driver RPE-regenerering och RPE-sjukdomsrelaterade mekanismer, med det långsiktiga målet att tillämpa denna kunskap på däggdjurssystem och i slutändan mot terapeutisk utveckling.
Metoden som beskrivs här beskriver ett protokoll för att genetiskt ablate retinal pigmentepitel (RPE) med hjälp av larvzebrafisk. RPE sträcker sig över ögats baksida och ligger mellan de stratifierade skikten i den neurala näthinnan och skiktet av vaskulatur som utgör koroiden. Trofiskt stöd, absorption av fototoxiskt ljus och underhåll av visuella cykelproteiner är bara några av de kritiska funktioner som RPE utför som är väsentliga för att upprätthålla hälsan och integriteten hos dessa intilliggande vävnader1. Skador på däggdjurs RPE kan repareras när lesionerna är små2; Skador som drabbas av större skador eller progressiv degenerativ sjukdom är dock irreversibla. Hos människor leder RPE-degenerativa sjukdomar (t.ex. åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) och Stargardts sjukdom) till permanent synförlust och, med få behandlingsalternativ tillgängliga, minskad patientlivskvalitet. Den begränsade förmågan för däggdjurs RPE att självreparera har skapat en kunskapslucka inom RPE-regenerativa processer. Med tanke på zebrafiskens robusta regenerativa kapacitet över många olika vävnadstyper utvecklades detta protokoll för att upprätta ett in vivo ryggradsdjurssystem för att underlätta studier om inneboende regenererande RPE och avslöja mekanismer som driver det svaret. Med hjälp av ablationsparadigmet som beskrivs här har den kanoniska Wnt-signalvägen3, mTOR-vägen4 och immunrelaterade svar5 identifierats som kritiska mediatorer för RPE-regenerering, sannolikt med överlappande funktioner.
I detta genetiska ablationsparadigm uttrycker Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 zebrafiskar den bakteriehärledda nitroreduktasgenen (NTR/nfsB)6 smält samman med eGFP under kontroll av RPE-förstärkarelementet, rpe65a7. Ablation uppnås genom tillsats av prodrug, metronidazol (MTZ), till systemvattenhus zebrafisk. Intracellulär aktivering av MTZ genom nitroreduktas resulterar i DNA-tvärbindning och apoptos i NTR/nfsB-uttryckande celler 8,9. Denna teknik har använts i stor utsträckning i zebrafisk för att ablatera celler i näthinnan 10,11,12,13 och andra vävnader 8. Tillsammans möjliggör dessa element riktat uttryck (rpe65a) av en inducerbar cellablationsmetodik (NTR / MTZ) 8,9 och en fluorescerande markör (eGFP) för visualisering.
Andra intressanta in vivo-modeller finns också som kan användas för att studera RPE14: s regenerativa potential. Dessa är breda och inkluderar RPE-till-näthinnan-transdifferentiering efter retinektomi hos amfibier, där RPE-celler som förlorats till retinal återväxt ersätts15,16; RPE-restaurering efter skada i “superläkning” MRL / MpJ-mus17; och exogen stimulering av RPE-proliferation i en råttmodell av bland annat spontan RPE och retinal degeneration18. In vitro-modeller, såsom vuxna humana RPE-stamceller (RPESC)19 har också utvecklats. Dessa modeller är alla värdefulla verktyg som arbetar för att avslöja de cellulära processerna relaterade till RPE-regenerering (t.ex. spridning, differentiering etc.); Zebrafisken är dock unik i sin kapacitet för inneboende RPE-reparation efter ablation.
Medan metoden här är skriven för att fokusera på att förstå mekanismerna som driver RPE-regenerering, kan Tg (rpe65a: nfsB-eGFP) – linjen och detta genetiska ablationsprotokoll användas för att studera andra cellulära processer som RPE-apoptos, RPE-degeneration och effekten av RPE-skada på intilliggande retinala och vaskulära vävnader. Ablationsprotokollet kan också modifieras för att inkludera farmakologisk manipulation, vilket är en bekväm preliminär strategi för att screena signalvägar av intresse. Till exempel har blockering av den kanoniska Wnt-vägen med hjälp av Inhibitor of Wnt Response-1 (IWR-1)20 visat sig försämra RPE-regenerering3. Detta upprepades här för att vägleda användare genom ett farmakologiskt manipulationsexperiment och fungera som proof-of-concept för att validera ett MATLAB-skript (RpEGEN) skapat för att kvantifiera RPE-regenerering baserat på återvinning av pigmentering. Liksom det transgena linje- och ablationsprotokollet är RpEGEN-skripten anpassningsbara och kan användas för att kvantifiera andra markörer / cellulära processer inom RPE.
Detta protokoll beskriver metodik för att genetiskt ablatera RPE och studera mekanismer för degenerering och regenerering hos larvåldrade zebrafiskar. Detta protokoll har också framgångsrikt utförts hos vuxnazebrafiskar 3 men med mindre omfattande karakterisering, varför larver är i fokus här. Kritiska aspekter av denna del av protokollet (steg 1-4) inkluderar: 1) tillsats av 1,5x PTU till embryon före melanogenesens början, 2) dechorionating PTU-behandlade embryon på 2-3 dpf, 3) noggr…
The authors have nothing to disclose.
Arbetet som beskrivs här stöddes av National Institutes of Health (RO1-EY29410 till J.M.G och NIH CORE Grant P30-EY08098 till Institutionen för oftalmologi); UPMC Immune Transplant & Therapy Center (till L.L.L. och J.M.G.); och E. Ronald Salvitti-professuren i oftalmologiforskning (till J.M.G.). Ytterligare stöd erhölls från Wiegand Fellowship in Ophthalmology (till L.L.L), Eye & Ear Foundation of Pittsburgh, och ett obegränsat bidrag från Research to Prevent Blindness, New York, NY. Författarna vill också tacka Amanda Platt för teknisk hjälp och Dr. Hugh Hammer och vattenpersonalen för utmärkt djurvårdsstöd.
Lab Material/Equipment | |||
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI) | Millipore Sigma | D9542 | |
6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-539-13 | Catalog number is for 50 mL tubes |
Diamond tip scribing pen | Fisher Scientific | 50-254-51 | Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 % | Fisher Scientific | BP231 | Check instiutional chemical waste disposal requirements |
Embryo incubator (large) | Fisher Scientific | 3720A | |
Embryo incubator (mini/tabletop) | Labnet | I5110A | |
Fluorescence stereo microscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | Or similar, with 488 nm excitation laser/filter |
Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-4 | Manufactured by Corning, non-sterile |
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo | Millipore Sigma | 5.04462 | Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements |
Methylene blue (powder) | Fisher Scientific | BP117-100 | Also available as a premade aqeuous solution |
Metronidazole (MTZ) | Millipore Sigma | M3761 | Check instiutional chemical waste disposal requirements |
N-phenylthiourea (PTU) | Millipore Sigma | P7629 | Check instiutional chemical waste disposal requirements |
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free | Fisher Scientific | AA433689M | Chemical waste, proper disposal required |
Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | 10 cm diameter |
Phosphate buffered saline (powder packets) | Millipore Sigma | P3813 | Used to make 10 X PBS stock |
Pronase | Millipore Sigma | PRON-RO | |
Shaking incubator | Benchmark | H2010 | Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius |
Stereo microscope | Leica | S9i | Or similar, with transmitted light illumination |
Student Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Fine-tipped forceps for manual dechorionation |
Tabletop rotator/shaker | Scilogex | SK-D1807-E | |
Transfer pipette | Millipore Sigma | Z135003 | 3.2 mL bulb draw, non-sterile |
Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Pentair | TRS1, TRS2, TRS5 | Also available from Fisher Scientific (NC0342409) |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
Software Material | |||
FIJI (Fiji is Just ImageJ) | FIJI (Fiji is Just ImageJ) | https://imagej.net/software/fiji/ | Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats |
GRAMM examples and how-tos | MathWorks | https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like. | |
MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox |
MATLAB support | MathWorks | https://www.mathworks.com/support.html |