Summary
يصف البروتوكول الحالي طريقة إزالة الأنسجة وتلطيخ الفلورسنت المناعي بالكامل لتصوير الكلى ثلاثي الأبعاد (3D). يمكن أن تقدم هذه التقنية وجهات نظر عيانية في أمراض الكلى ، مما يؤدي إلى اكتشافات بيولوجية جديدة.
Abstract
على الرغم من أن علم الأمراض التقليدي قدم العديد من المعلومات حول البنية المجهرية للكلى ، إلا أنه كان من الصعب معرفة التركيب الدقيق للأوعية الدموية ، والأنابيب القريبة ، وقنوات التجميع ، والكبيبات ، والأعصاب الودية في الكلى بسبب نقص المعلومات ثلاثية الأبعاد (3D). المقاصة البصرية هي استراتيجية جيدة للتغلب على هذه العقبة الكبيرة. يمكن تحليل خلايا متعددة في عضو كامل بدقة خلية واحدة من خلال الجمع بين إزالة الأنسجة وتقنية التصوير 3D. ومع ذلك ، لا تزال طرق وضع العلامات الخلوية لتصوير الأعضاء بأكملها متخلفة. على وجه الخصوص ، يمثل تلطيخ الأعضاء بالكامل تحديا بسبب صعوبة اختراق الأجسام المضادة. طور البروتوكول الحالي تلطيخ كلى فأر كامل التركيب للتصوير 3D باستخدام طريقة إزالة الأنسجة CUBIC (كوكتيلات تصوير الدماغ / الجسم الواضحة دون عائق والتحليل الحسابي). وقد مكن البروتوكول من تصور إزالة التعصيب الكلوي الودي بعد إصابة نقص التروية وتضخم الكبيبات في المرحلة المبكرة من مرض الكلى السكري من وجهة نظر شاملة. وبالتالي ، يمكن أن تؤدي هذه التقنية إلى اكتشافات جديدة في أبحاث الكلى من خلال توفير منظور عياني.
Introduction
تتكون الكلية من مجموعات خلايا مختلفة. على الرغم من أن علم الأمراض التقليدي يعطينا الكثير من المعلومات حول البيئة المكروية للكلى ، إلا أن هناك حاجة إلى التصوير ثلاثي الأبعاد (3D) لفهم الحديث المتبادل بين الخلايا بدقة أثناء تطور مرض الكلى. في الماضي ، كان هناك حاجة إلى إجراء عدد كبير من التقسيم التسلسلي وإعادة بناء الصورة لتصوير 3D للجهاز بالكامل1. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة تتطلب الكثير من الجهد ولديها مشاكل من حيث التكاثر.
المقاصة البصرية هي استراتيجية جيدة للتغلب على هذه العقبة 2,3. يرجع عتامة الأنسجة بشكل أساسي إلى تشتت الضوء وامتصاصه لأن كل عضو يتكون من مواد مختلفة ، بما في ذلك الماء والبروتين والدهون. وبالتالي ، فإن الاستراتيجية الأساسية لإزالة الأنسجة هي استبدال الماء والدهون في الأنسجة بكواشف مطابقة لمعامل الانكسار (RI) لها نفس الخصائص البصرية مثل البروتينات4. من أجل مراقبة عينة شفافة ، فإن الفحص المجهري الفلوري للورقة الضوئية مفيد5. تضيء صفائح الضوء العينة الشفافة من الجانب ، ويتم الحصول على إشارات الإثارة من خلال العدسة الموضوعية الموجودة في وضع رأسي6. يحصل هذا الفحص المجهري على معلومات المقطع العرضي في عملية مسح واحدة ، والتي تختلف عن الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر أو متعدد الفوتونات. وبالتالي ، يمكنه الحصول بسرعة على صور z-stack بمستوى منخفض من التبييض الضوئي.
تعد كوكتيلات التصوير الواضحة وغير المعوقة للدماغ / الجسم والتحليل الحسابي (CUBIC) إحدى طرق إزالة الأنسجة التي تتيح تصوير الأعضاء بالكامل بواسطة الفحص المجهري الفلوريللصفائح الضوئية 2،7،8. تم تحسين تلطيخ CUBIC و Cycl-mount المناعي بالكامل في الدراسة الحالية لتصور هياكل 3D لكلية الفأر9،10،11. باستخدام طريقة التلوين الكاملة هذه ، يتم تصور التغيير في الأعصاب الودية الكلوية بعد إصابة نقص التروية 9،10 وتضخم الكبيبات في المرحلة المبكرة من مرض الكلى السكري11 ، وكذلك الأوعية الدموية والأنابيب القريبة والقنوات المجمعة في الكلى الكاملة9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة طوكيو. تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة. تم استخدام ذكور الفئران C57BL / 6NJcl ، البالغة من العمر 8 أسابيع ، للدراسة الحالية. تم الحصول على الفئران من مصادر تجارية (انظر جدول المواد).
1. إعداد الحيوانات وتثبيت الكلى
- قم بإجراء تثبيت التروية باتباع الخطوات أدناه.
- تخدير الفأر عن طريق استنشاق إيزوفلوران (3٪، 2.0 لتر/دقيقة) وإعطاء هيدروكلوريد ميديتوميدين داخل الصفاق (0.3 ملغ/كغ)، طرطرات بوتورفانول (5 ملغ/كغ)، وميدازولام (4 ملغ/كغ) (انظر جدول المواد).
- قم بتخلل الحيوان مع 20 مل من PBS (درجة الحموضة 7.4) و 30 مل من 4٪ PFA في الفوسفات العازلة (PB) من خلال البطين الأيسر للقلب12.
- قم بإجراء تثبيت الغمر بعد تثبيت التروية وأخذ عينات الكلى9.
- اغمر الكلى في 4٪ PFA عند 4 درجات مئوية لمدة 16 ساعة إضافية ، ثم اغسلها باستخدام PBS لمدة 2 ساعة (ثلاث مرات) 9 (الشكل 1).
تنبيه: الفورمالديهايد والبارافورمالدهيد مهيجات سامة. تعامل مع الكواشف في غطاء الدخان مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.
- اغمر الكلى في 4٪ PFA عند 4 درجات مئوية لمدة 16 ساعة إضافية ، ثم اغسلها باستخدام PBS لمدة 2 ساعة (ثلاث مرات) 9 (الشكل 1).
2. إزالة اللون وإزالة الدهون
- تحضير CUBIC-L لإزالة اللون وإزالة الدهون التي تتكون من 10٪ بالوزن من Triton X-100 و 10٪ بالوزن من N-buthyldiethanolamine (انظر جدول المواد) ، بعد التقارير المنشورة سابقا4،8،9.
- قم بإجراء إزالة اللون وإزالة الدهون بواسطة CUBIC-L باتباع الخطوات أدناه.
- اغمر الكلية الثابتة في 7 مل من 50٪ (v / v) CUBIC-L (خليط 1: 1 من الماء و CUBIC-L) في أنبوب سفلي دائري سعة 14 مل (انظر جدول المواد) مع اهتزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة لمدة 6 ساعات (الشكل 2 أ). ثم اغمره في 7 مل من CUBIC-L في أنبوب سفلي دائري سعة 14 مل مع اهتزاز لطيف عند 37 درجة مئوية لمدة 5 أيام.
- قم بتحديث CUBIC-L كل يوم خلال هذه العملية. بعد عملية إزالة اللون وإزالة الدهون ، اغسل الكلى باستخدام PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة (ثلاث مرات)9 (الشكل 1). استخدم ملعقة توزيع لمعالجة العينات (الشكل 2 ب).
3. تلطيخ مناعي كامل
- تحضير مخازن تلطيخ.
- تحضير المخزن المؤقت للتلطيخ للأجسام المضادة الأولية عن طريق خلط 0.5٪ (v / v) Triton X-100 ، 0.5٪ الكازين في PBS ، و 0.05٪ أزيد الصوديوم9.
- قم بإعداد المخزن المؤقت للتلطيخ للأجسام المضادة الثانوية عن طريق خلط 0.5٪ (v / v) Triton X-100 ، و 0.1٪ الكازين في PBS ، و 0.05٪ أزيد الصوديوم9.
- أداء تلطيخ مع الأجسام المضادة الأولية.
- صبغ الكلى منزوعة الدهون بالأجسام المضادة الأولية (1: 100 أو 1: 200 ، انظر جدول المواد) في المخزن المؤقت للتلطيخ عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف لمدة 7 أيام.
ملاحظة: كمية المخزن المؤقت للتلطيخ اللازم لكلية واحدة هي 500-600 ميكرولتر (الشكل 2C). - اغسل الكلى بنسبة 0.5٪ (v / v) Triton X-100 في PBS (PBST) في درجة حرارة الغرفة لمدة يوم واحد9 (الشكل 1).
- صبغ الكلى منزوعة الدهون بالأجسام المضادة الأولية (1: 100 أو 1: 200 ، انظر جدول المواد) في المخزن المؤقت للتلطيخ عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف لمدة 7 أيام.
- أداء تلطيخ مع الأجسام المضادة الثانوية.
- صبغ الكلى المناعي بالأجسام المضادة الثانوية (1: 100 أو 1: 200 ، انظر جدول المواد) في مخزن تلطيخ عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف لمدة 7 أيام. اغسل الكلى باستخدام PBST في درجة حرارة الغرفة لمدة يوم واحد9 (الشكل 1).
- بعد التثبيت9 ، اغمر الكلى في 1٪ فورمالديهايد في PB (خليط 1:36 من 37٪ فورمالديهايد و PB) لمدة 3 ساعات ، واغسله باستخدام PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 6 ساعات (الشكل 1).
4. مطابقة معامل الانكسار (RI)
- تحضير CUBIC-R +.
- تحضير CUBIC-R عن طريق خلط 45٪ بالوزن من 2،3-ثنائي ميثيل-1-فينيل-5-بيرازولون / أنتيبيرين و 30٪ بالوزن من نيكوتيناميد (انظر جدول المواد).
- قم بإعداد CUBIC-R + لمطابقة معامل الانكسار (RI) بإضافة 0.5٪ من N-buthyldiethanolamine إلى CUBIC-R بعد التقارير المنشورة سابقا4،8،9.
- قم بإجراء مطابقة RI.
- اغمر الكلى في 7 مل من 50٪ (v / v) CUBIC-R + (خليط 1: 1 من الماء و CUBIC-R +) في أنبوب سفلي دائري سعة 14 مل مع اهتزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة لمدة يوم واحد. بعد ذلك ، اغمرها في 7 مل من CUBIC-R + في أنبوب سفلي دائري سعة 14 مل مع اهتزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة لمدة يومين9 (الشكل 1).
ملاحظة: على الرغم من أن الكلى تطفو في 50٪ CUBIC-R + في بداية مطابقة RI ، إلا أنها تغرق وتصبح شفافة في CUBIC-R + في نهاية العملية (الشكل 2D).
- اغمر الكلى في 7 مل من 50٪ (v / v) CUBIC-R + (خليط 1: 1 من الماء و CUBIC-R +) في أنبوب سفلي دائري سعة 14 مل مع اهتزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة لمدة يوم واحد. بعد ذلك ، اغمرها في 7 مل من CUBIC-R + في أنبوب سفلي دائري سعة 14 مل مع اهتزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة لمدة يومين9 (الشكل 1).
5. الحصول على الصور وإعادة الإعمار
- اغمر الكلى المتطابقة مع RI في خليط من زيت السيليكون (RI = 1.555) والزيت المعدني (RI = 1.467) (55:45) أثناء الحصول على الصورة (RI = 1.51) 5 (الشكل 3).
- الحصول على صور 3D من الكلى بأكملها مع المجهر الفلورسنت9 ورقة ضوء مصممة خصيصا (انظر جدول المواد). اجمع كل بيانات الصور الأولية بتنسيق TIFF 16 بت. تصور والتقاط الصور المقدمة 3D مع برنامج تحليل التصوير (Imaris ، انظر جدول المواد).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام طريقة التلوين هذه ، تم تصور الأعصاب الودية [الجسم المضاد لهيدروكسيلاز التيروزين (TH)] والشرايين [الجسم المضاد للأكتين العضلي α الملساء (αSMA)] في كلية كاملة (الشكل 4 أ ، ب والفيديو 1)9. كما تم تصوير الأعصاب الكلوية الودية غير الطبيعية بعد إصابة نقص التروية / التروية (IRI)9،10 (الشكل 4C). علاوة على ذلك ، تم تحقيق تصور الأعصاب المتعاطفة في الطحال13 بأكمله باستخدام هذا البروتوكول (الشكل 4D). يوضح الشكل 5 أحد الأمثلة على تحديد بيانات الفلورسنت المناعي ثلاثي الأبعاد.
بالإضافة إلى ذلك ، كان تصور قنوات التجميع [الجسم المضاد للأكوابورين 2 (AQP2)] ، والجزء S1 من الأنابيب القريبة [الجسم المضاد للجلوكوز المضاد للجلوكوز 2 (SGLT2)] ، والكبيبات (الجسم المضاد للبودوسين) في الكلى الكاملة9 ناجحا (الشكل 6 أ). باستخدام هذا التصوير ثلاثي الأبعاد للكبيبات ، تم تصور تضخم الكبيبات (الجسم المضاد للبودوسين) في المراحل المبكرة من مرض الكلى السكري ، والذي تم قمعه عن طريق إعطاء الدواء11 (الشكل 6 ب).
الشكل 1: تطهير الأنسجة وتلطيخ الفلورسنت المناعي بالكامل. تطهير الأنسجة بواسطة CUBIC هو عملية من خطوتين: إزالة الدهون (CUBIC-L) ومطابقة معامل الانكسار (RI) (CUBIC-R +). يتم إجراء تلطيخ كامل التركيب بعد عملية إزالة الدهون. شريط المقياس = 10 مم. الصورة مستنسخة من Hasegawa et al.9. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: صور لعملية المناولة . (أ) تغمر العينة في 7 مل من 50٪ أو 100٪ مكعب-L في أنبوب سفلي دائري سعة 14 مل. يتم الاحتفاظ بالأنبوب أفقيا مع اهتزاز لطيف أثناء عملية إزالة الدهون. (ب) تستخدم ملعقة توزيع لمعالجة العينات. (ج) كمية المخزن المؤقت للتلطيخ اللازم لكلية واحدة هي 500-600 ميكرولتر. يتم الاحتفاظ الأنبوب عموديا أثناء عملية التلطيخ. (د) على الرغم من أن العينة تطفو في 50٪ CUBIC-R + في بداية مطابقة RI ، فإنها تغرق وتصبح شفافة في CUBIC-R + في نهاية العملية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: الفحص المجهري الفلوري للصفائح الضوئية للتصوير ثلاثي الأبعاد للكلى بالكامل. يتيح الفحص المجهري الفلوري للصفائح الضوئية (LSFM) التصوير ثلاثي الأبعاد (3D) للعينات الشفافة. هذه الصورة مستنسخة من Hasegawa et al.9. يستخدم زيت الغمر أثناء الحصول على البيانات. أوراق الضوء من كلا الجانبين تضيء العينة. يتم الحصول على إشارات الإثارة من خلال العدسة الموضوعية الموجودة في وضع رأسي. تتحرك المرحلة في الاتجاه المحوري ، ويتم الحصول على صور z-stack. شريط المقياس = 10 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4. تصوير ثلاثي الأبعاد للكلى الكاملة للأعصاب والشرايين الودية. (أ) يتم تصوير الأعصاب الودية [الجسم المضاد لهيدروكسيلاز التيروزين (TH) ، الأخضر] والشرايين [الجسم المضاد للأكتين العضلي α (αSMA) ، أرجواني] في كلية كاملة. (B) تظهر صورة المستوى x-y المكبرة ل (A) [الجسم المضاد ل TH ، أخضر ؛ جسم مضاد ل αSMA ، أرجواني]. (ج) يتم تصور إزالة التعصيب المستمر بعد إصابة نقص التروية الكلوية (IRI). (د) يصور البروتوكول الحالي أيضا الأعصاب الودية في الطحال بأكمله. هذه الصورة مستنسخة من Hasegawa et al.9. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: القياس الكمي للتلطيخ المناعي ثلاثي الأبعاد. تظهر عملية تحديد نسبة الحجم الإيجابي للإشارة إلى إجمالي حجم الكلى. يتم إجراء التحويل الثنائي وفقا لكل عتبة. يتم الحصول على الأحجام عن طريق حساب تكامل منطقة الاهتمام (حجم voxel: x = 6.45 μm ، y = 6.45 μm ، z = 7 μm). الصورة مستنسخة من Hasegawa et al.9. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: تصوير ثلاثي الأبعاد للكلى الكاملة للقنوات الجامعة، والأنيبيبات القريبة، والكبيبات . (أ) يتم تصوير القنوات المجمعة [الجسم المضاد للأكوابورين 2 (AQP2)] ، والجزء S1 من الأنابيب القريبة [الجسم المضاد للجلوكوز المضاد للجلوكوز 2 (SGLT2)] ، والكبيبات (الجسم المضاد للبودوسين) على التوالي في كلية كاملة. الصورة مستنسخة من Hasegawa et al.9. (ب) لوحظ تضخم الكبيبات في المرحلة المبكرة من مرض الكلى السكري (الأجسام المضادة المضادة للبودوسين) ، والتي يتم قمعها عن طريق إعطاء الدواء. الصورة مستنسخة من Hasegawa et al.11. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
فيديو 1: فيلم دوار للكلى. يوضح الفيلم الدوار للكلية في الشكل 4 أ . يتم تصور الأعصاب الودية [الأجسام المضادة لهيدروكسيلاز التيروزين (TH) ، الأخضر] والشرايين [الأجسام المضادة للأكتين العضلي α الملساء (αSMA) ، أرجواني]. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
سمح البروتوكول الحالي بتصوير 3D للكلى بالكامل لهياكل مختلفة مثل الأعصاب الودية ، وجمع القنوات ، والشرايين ، والأنابيب القريبة ، والكبيبات9،10،11. قدمت طريقة التلوين هذه ملاحظة عيانية وأدت إلى اكتشافات بيولوجية جديدة ، من خلال تصور التغيير في الأعصاب الودية الكلوية بعد إصابة نقص التروية 9,10 وتضخم الكبيبات في المرحلة الأولى من مرض الكلى السكري 11.
التعتيم مشتق من عدم التجانس البصري في الأنسجة5. المبدأ المشترك لطرق إزالة الأنسجة المختلفة هو إزالة مشتتات / ماصات الضوء وملء المساحة باستخدام كواشف مطابقة RI. بالمقارنة مع الطرق القائمة على المذيبات العضوية مثل التصوير ثلاثي الأبعاد للأعضاء المطهرة بالمذيبات (3DISCO / iDISCO) 3،14 ، يعتمد CUBIC على الكواشف المحبة للماء ، وبالتالي فهو متفوق في الحفاظ على الفلورسنت5. تسمح هذه الخاصية ل CUBIC للباحثين بمراقبة إشارات الفلورسنت من سلالات فأر المراسل2 بالإضافة إلى إشارات من تلطيخ الفلورسنت المناعي بالكامل ، مما يوفر المزيد من الخيارات لفهم شامل لهياكل الأعضاء 3D.
يمكن لبروتوكول إزالة الأنسجة الحالي القائم على CUBIC تحقيق شفافية عالية للتصوير ثلاثي الأبعاد مقارنة بأبحاث تطهير الكلى السابقةللفأر 15. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن بروتوكول المقاصة هذا مناسب لكلى الفأر. هناك حاجة إلى عملية إزالة الدهون أقوى لإزالة الكلى البشرية. على سبيل المثال، قدم Zhao et al. مؤخرا نهجا لرسم خرائط سليمة للأعضاء البشرية من خلال تطوير طريقة فعالة لإزالة الأنسجة تسمى SHANEL (إزالة الأعضاء البشرية ووضع العلامات بكفاءة بوساطة المذيلات الصغيرة)16. نظرا لأن إزالة الدهون الأقوى تلحق الضرر بالعينات ، يحتاج الباحثون إلى اختيار طريقة مناسبة لإزالة الأنسجة وفقا للغرض منها.
يمثل تلطيخ الأعضاء بالكامل تحديا بسبب صعوبة اختراق الأجسام المضادة. تم وضع البروتوكول الحالي بعد التجربة والخطأ. نظرا لأن استقرار التلوين له الأولوية ، فقد يكون وقت الحضانة أطول من الحد الأدنى المطلوب. نتيجة لذلك ، أظهر هذا البروتوكول تلطيخا عالي الجودة للكلى بواسطة الأجسام المضادة. ومع ذلك ، هناك احتمال ألا يعمل بشكل جيد ، اعتمادا على مولدات الضد المستهدفة التي لم نجربها. أظهرت دراسة حديثة أن التلوين بخطوتين باستخدام الأجسام المضادة الأولية والثانوية مثل البروتوكول الحالي ليس هو الأمثل في بعض الحالات لتلطيخ أدمغة الفئرانبالكامل 17. هذا لأنه عندما تكون الكمية المستهدفة كبيرة ، يملأ الجسم المضاد الأساسي العينة ، مما يجعل من الصعب على الجسم المضاد الثانوي اختراق الأنسجةبعمق 17. وبالتالي ، فإن الجسم المضاد الأولي المسمى بالفلورسنت ، أو مجمع الجسم المضاد الأساسي وجزء Fabالثانوي 17 ، يستحق المحاولة إذا كان تغلغل الأجسام المضادة غير فعال.
بالنسبة لعملية التصوير ، يحتاج الباحثون إلى اختيار نوع مناسب من الفحص المجهري ودقة الصورة وفقا للغرض منها. إذا أراد الباحثون إجراء تصوير 3D للكلى بالكامل كما هو موضح في هذه الدراسة ، فمن الأفضل استخدام الفحص المجهري الفلوري للصفائح الضوئية لأنه يمكنه الحصول بسرعة على صور z-stack واسعة مع مستوى منخفض من التبييض الضوئي. نظرا لأن حجم ملف بيانات التصوير 3D هائل ، يجب تقليل دقة الصورة إلى الحد الذي يمكن أن يقف فيه تصوير الجهاز بأكمله. في المقابل ، يمكن للباحثين أيضا استخدام المجهر متحد البؤر أو متعدد الفوتونات عند الحصول على بيانات التصوير 3D بدقة عالية في مساحة ضيقة.
في الختام ، طورت الدراسة الحالية تلطيخ الكلى بالكامل للتصوير 3D باستخدام طريقة إزالة الأنسجة CUBIC. يسمح البروتوكول بتصور هياكل 3D في كلية كاملة ، مما يوفر منظورا عيانيا لأبحاث الكلى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم تنفيذ جزء من هذا العمل من خلال التعاون مع البروفيسور هيروكي ر. أويدا (جامعة طوكيو) ، والبروفيسور إيتسو أ. سوساكي (جامعة جونتيندو) ، والبروفيسور تيتسوهيرو تاناكا (جامعة توهوكو) ، والبروفيسور ماسافومي فوكاغاوا ، والدكتور تاكيهيكو وادا ، والدكتور هيروتاكا كومابا (جامعة توكاي).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube | Falcon | 352059 | Tissue clearing, staining, wash |
| 2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine | Tokyo Chemical Industry | D1876 | CUBIC-R+ |
| 37%-Formaldehyde Solution | Nacalai Tesque | 16223-55 | Post fixation |
| 4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Nacalai Tesque | 09154-85 | Kidney fixation |
| Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody | Invitrogen | A-21436 | Secondary antibody (1:100) |
| Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | A-31573 | Secondary antibody (1:200) |
| Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody | Abcam | ab199975 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-podocin antibody | Sigma-Aldrich | P0372 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody | Abcam | ab85626 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody | Abcam | ab113 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody | Abcam | ab5694 | Primary antibody (1:200) |
| Blocker Casein in PBS | Thermo Fisher Scientific | 37528 | Staining buffer |
| Butorphanol Tartrate | Meiji | 005526 | Anesthetic |
| C57BL/6NJcl | Nippon Bio-Supp.Center | N/A | Mouse strain |
| Imaris | Bitplane | N/A | Imaging analysis software |
| Macro-zoom microscope | OLYMPUS | MVX10 | The observation unit of the custom-built microscope |
| Medetomidine Hydrochloride | Kyoritsu-Seiyaku | 008656 | Anesthetic |
| Midazolam | SANDOZ | 27803229 | Anesthetic |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Immersion oil |
| N-buthyldiethanolamine | Tokyo Chemical Industry | B0725 | CUBIC-L, CUBIC-R+ |
| Nicotinamide | Tokyo Chemical Industry | N0078 | CUBIC-R+ |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | CUBIC-L, PBST |
| Silicon oil HIVAC-F4 | Shin-Etsu Chemical | 50449832 | Immersion oil |
| Sodium azide | Wako | 195-11092 | Staining buffer |
References
- Velez-Fort, M., et al. The stimulus selectivity and connectivity of layer six principal cells reveals cortical microcircuits underlying visual processing. Neuron. 83 (6), 1431-1443 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Tainaka, K., et al. Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Hasegawa, S., et al. Comprehensive three-dimensional analysis (CUBIC-kidney) visualizes abnormal renal sympathetic nerves after ischemia/reperfusion injury. Kidney International. 96 (1), 129-138 (2019).
- Hasegawa, S., Inoue, T., Inagi, R. Neuroimmune interactions and kidney disease. Kidney Research and Clinical Practice. 38 (3), 282-294 (2019).
- Hasegawa, S., et al. The oral hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor enarodustat counteracts alterations in renal energy metabolism in the early stages of diabetic kidney disease. Kidney International. 97 (5), 934-950 (2020).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hasegawa, S., et al. Activation of sympathetic signaling in macrophages blocks systemic inflammation and protects against renal ischemia-reperfusion injury. Journal of the American Society of Nephrology. 32 (7), 1599-1615 (2021).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1-22 (2020).
