Summary
Detta protokoll beskriver en vävnadsrensningsmetod och helmonterad immunofluorescerande färgning för tredimensionell (3D) njuravbildning. Denna teknik kan erbjuda makroskopiska perspektiv inom njurpatologi, vilket leder till nya biologiska upptäckter.
Abstract
Även om konventionell patologi gav många uppgifter om njurmikrostruktur, var det svårt att känna till den exakta strukturen hos blodkärl, proximala tubuler, uppsamlingskanaler, glomeruli och sympatiska nerver i njurarna på grund av bristen på tredimensionell (3D) information. Optisk clearing är en bra strategi för att övervinna detta stora hinder. Flera celler i ett helt organ kan analyseras med encellsupplösning genom att kombinera vävnadsrensning och 3D-avbildningsteknik. Cellmärkningsmetoder för helorganavbildning är dock fortfarande underutvecklade. I synnerhet är helmonterad organfärgning utmanande på grund av svårigheten med antikroppspenetration. Detta protokoll utvecklade en helmonterad musnjurfärgning för 3D-avbildning med CUBIC -vävnadsrensningsmetoden (Clear, Unobstructed Brain / Body Imaging Cocktails and Computational analysis). Protokollet har gjort det möjligt att visualisera njursympatitisk denervation efter ischemi-reperfusionsskada och glomerulomegali i det tidiga skedet av diabetisk njursjukdom ur en omfattande synvinkel. Således kan denna teknik leda till nya upptäckter inom njurforskning genom att ge ett makroskopiskt perspektiv.
Introduction
Njuren består av olika cellpopulationer. Även om konventionell patologi ger oss mycket information om njurmikromiljön, behövs tredimensionell (3D) avbildning för att exakt förstå den intercellulära överhörningen under njursjukdomsprogression. Tidigare behövde ett stort antal seriella sektionering och bildrekonstruktion utföras för helorganets 3D-avbildning1. Denna metod krävde dock för mycket ansträngning och hade problem när det gäller reproducerbarhet.
Optisk röjning är en bra strategi för att övervinna detta hinder 2,3. Vävnadsopacitet beror främst på ljusspridning och absorption eftersom varje organ består av olika ämnen, inklusive vatten, protein och lipider. Således är den grundläggande strategin för vävnadsrensning att ersätta vatten och lipider i vävnader med brytningsindex (RI) matchande reagens som har samma optiska egenskaper som proteiner4. För att observera ett transparent prov är en ljusplåtfluorescerande mikroskopi användbar5. Ljusark belyser det transparenta provet från sidan, och excitationssignaler förvärvas genom objektivlinsen i vertikalt läge6. Denna mikroskopi erhåller tvärsnittsinformation i ett enda svep, vilket skiljer sig från konfokal- eller multifotonfluorescerande mikroskopi. Således kan den snabbt förvärva z-stack-bilder med en låg nivå av fotoblekning.
Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) är en av vävnadsrensningsmetoderna som möjliggör helorgansavbildning med ljusarksfluorescerande mikroskopi 2,7,8. CUBIC och helmonterad immunofluorescerande färgning optimeras i denna studie för att visualisera musnjure 3D-strukturer 9,10,11. Med hjälp av denna helmonterade färgningsmetod visualiseras förändringen i njursympatiska nerver efter ischemi-reperfusionsskada 9,10 och glomerulomegali i det tidiga skedet av diabetisk njursjukdom 11, liksom blodkärl, proximala tubuler och uppsamlingskanaler i en hel njure9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment godkändes av University of Tokyo Institutional Review Board. Alla djurförsök utfördes enligt National Institutes of Health riktlinjer. Manliga C57BL/6NJcl-möss, 8 veckor gamla, användes för den aktuella studien. Mössen erhölls från kommersiella källor (se Materialförteckning).
1. Djurberedning och njurfixering
- Utför perfusionsfixering enligt stegen nedan.
- Bedöva musen genom inandning av isofluran (3 %, 2,0 l/min) och intraperitoneal administrering av medetomidinhydroklorid (0,3 mg/kg), butorfanoltartrat (5 mg/kg) och midazolam (4 mg/kg) (se materialförteckning).
- Persfuse djuret med 20 ml PBS (pH 7,4) och 30 ml 4% PFA i fosfatbuffert (PB) genom vänster kammarei hjärtat 12.
- Utför nedsänkningsfixeringen strax efter perfusionsfixeringen och njurprovtagningen9.
- Sänk ned njuren i 4 % PFA vid 4 °C i ytterligare 16 timmar och tvätta den sedan med PBS i 2 timmar (tre gånger)9 (figur 1).
VARNING: Formaldehyd och paraformaldehyd är giftiga irriterande. Hantera reagenser i en dragskåp med lämplig personlig skyddsutrustning.
- Sänk ned njuren i 4 % PFA vid 4 °C i ytterligare 16 timmar och tvätta den sedan med PBS i 2 timmar (tre gånger)9 (figur 1).
2. Avfärgning och delipidering
- Bered CUBIC-L för avfärgning och delipidering bestående av 10 viktprocent Triton X-100 och 10 viktprocent N-butyldietanolamin (se materialförteckning), efter tidigare publicerade rapporter 4,8,9.
- Utför avfärgning och delipidering med CUBIC-L enligt stegen nedan.
- Sänk ner den fasta njuren i 7 ml 50% (v/v) KUBIK-L (1:1 blandning av vatten och KUBIK-L) i ett 14 ml runt bottenrör (se materialtabell) med försiktig skakning vid rumstemperatur i 6 timmar (figur 2A). Sänk sedan ner den i 7 ml KUBIK-L i ett 14 ml runt bottenrör med försiktig skakning vid 37 °C i 5 dagar.
- Uppdatera CUBIC-L varje dag under denna process. Efter avfärgnings- och delipideringsprocessen, tvätta njuren med PBS vid rumstemperatur i 2 timmar (tre gånger)9 (figur 1). Använd en doseringssked för provhantering (figur 2B).
3. Helmonterad immunofluorescerande färgning
- Förbered färgningsbuffertarna.
- Förbered färgningsbufferten för primära antikroppar genom att blanda 0,5% (v / v) Triton X-100, 0,5% kasein i PBS och 0,05% natriumazid9.
- Förbered färgningsbufferten för sekundära antikroppar genom att blanda 0,5% (v / v) Triton X-100, 0,1% kasein i PBS och 0,05% natriumazid9.
- Utför färgning med primära antikroppar.
- Immunostaina den delipiderade njuren med primära antikroppar (1:100 eller 1:200, se materialförteckning) i färgningsbufferten vid 37 °C med försiktig skakning i 7 dagar.
OBS: Mängden färgningsbuffert som behövs för en njure är 500-600 μL (Figur 2C). - Tvätta njuren med 0,5% (v/v) Triton X-100 i PBS (PBST) vid rumstemperatur i 1 dag9 (figur 1).
- Immunostaina den delipiderade njuren med primära antikroppar (1:100 eller 1:200, se materialförteckning) i färgningsbufferten vid 37 °C med försiktig skakning i 7 dagar.
- Utför färgning med sekundära antikroppar.
- Immunostaina njuren med sekundära antikroppar (1:100 eller 1:200, se Materialförteckning) i färgningsbufferten vid 37 °C med försiktig skakning i 7 dagar. Tvätta njuren med PBST vid rumstemperatur i 1 dag9 (figur 1).
- Efter fixering9, sänk ner njuren i 1% formaldehyd i PB (1:36 blandning av 37% formaldehyd och PB) i 3 h och tvätta den med PBS vid rumstemperatur i 6 timmar (Figur 1).
4. Matchning av brytningsindex (RI)
- Förbered CUBIC-R+.
- Bered CUBIC-R genom att blanda 45 viktprocent 2,3-dimetyl-1-fenyl-5-pyrazolon/febernedsättande och 30 viktprocent nikotinamid (se materialförteckning).
- Förbered KUBIK-R+ för brytningsindexmatchning (RI) genom att tillsätta 0,5 v% N-butyldietanolamin till KUBIK-R efter de tidigare publicerade rapporterna 4,8,9.
- Utför RI-matchningen.
- Sänk ner njuren i 7 ml 50% (v/v) KUBIK-R+ (1:1 blandning av vatten och KUBIK-R+) i ett 14 ml runt bottenrör med försiktig skakning vid rumstemperatur i 1 dag. Sänk sedan ner den i 7 ml CUBIC-R+ i ett 14 ml runt bottenrör med försiktig skakning vid rumstemperatur i 2 dagar9 (figur 1).
OBS: Även om njuren flyter i 50% KUBIK-R+ i början av RI-matchningen, sjunker den och blir transparent i CUBIC-R+ i slutet av processen (figur 2D).
- Sänk ner njuren i 7 ml 50% (v/v) KUBIK-R+ (1:1 blandning av vatten och KUBIK-R+) i ett 14 ml runt bottenrör med försiktig skakning vid rumstemperatur i 1 dag. Sänk sedan ner den i 7 ml CUBIC-R+ i ett 14 ml runt bottenrör med försiktig skakning vid rumstemperatur i 2 dagar9 (figur 1).
5. Bildförvärv och rekonstruktion
- Sänk ner den RI-matchade njuren i en blandning av kiselolja (RI = 1,555) och mineralolja (RI = 1,467) (55:45) under bildinsamling (RI = 1,51)5 (figur 3).
- Skaffa 3D-bilder av hela njuren med ettspecialbyggt 9-ljusark fluorescerande mikroskop (se Materialförteckning). Samla in alla råa bilddata i ett 16-bitars TIFF-format. Visualisera och fånga de 3D-renderade bilderna med programvaran för bildanalys (Imaris, se materialförteckning).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av denna färgningsmetodvisualiserades sympatiska nerver [anti-tyrosinhydroxylas (TH) antikropp] och artärer [anti-α-glattmuskelaktin (αSMA) antikropp] i en hel njure (figur 4A, B och video 1) 9. Onormala njursympatiska nerver visualiserades också efter ischemi/reperfusionsskada (IRI)9,10 (figur 4C). Dessutom uppnåddes visualisering av sympatiska nerver i hela mjälten13 med hjälp av detta protokoll (Figur 4D). Ett exempel på kvantifiering av 3D-immunofluorescerande data visas i figur 5.
Dessutom var visualisering av uppsamlingskanaler [anti-aquaporin 2 (AQP2) antikropp], S1-segmentet av proximala tubuler [antinatriumglukoskomtransporter 2 (SGLT2) antikropp] och glomeruli (anti-podocinantikropp) i en hel njure9 framgångsrik (figur 6A). Med hjälp av denna 3D-avbildning av glomeruli visualiserades glomerulomegali (anti-podocinantikropp) i de tidiga stadierna av diabetisk njursjukdom, som undertrycktes av läkemedelsadministration11 (Figur 6B).
Figur 1: Vävnadsrensning och helmonterad immunofluorescerande färgning. Vävnadsrensning med CUBIC är en tvåstegsprocess: delipidering (CUBIC-L) och brytningsindex (RI) matchning (CUBIC-R+). Helmonterad färgning utförs efter delipideringsprocessen. Skalstång = 10 mm. Bilden är återgiven från Hasegawa et al.9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Bilder av hanteringsprocessen . (A) Provet nedsänks i 7 ml 50% eller 100% KUBIK-L i ett 14 ml runt bottenrör. Röret hålls horisontellt med mild skakning under delipideringsprocessen. B) En doseringssked används för provhantering. (C) Mängden färgningsbuffert som behövs för en njure är 500-600 μl. Röret hålls vertikalt under färgningsprocessen. (D) Även om provet flyter i 50% KUBIK-R+ i början av RI-matchningen, sjunker det och blir transparent i CUBIC-R+ i slutet av processen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Lysrörsmikroskopi för helnjure 3D-avbildning. Ljusark fluorescerande mikroskopi (LSFM) möjliggör tredimensionell (3D) avbildning av transparenta prover. Denna bild återges från Hasegawa et al.9. Nedsänkningsolja används vid datainsamling. Ljusark från båda sidor belyser provet. Excitationssignalerna förvärvas genom objektivlinsen i vertikalt läge. Scenen rör sig i axiell riktning och z-stackbilder erhålls. Skalstång = 10 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4. Hel-njure tredimensionell avbildning av sympatiska nerver och artärer. (A) Sympatiska nerver [anti-tyrosinhydroxylas (TH) antikropp, grön] och artärer [anti-α-glatt muskelaktin (αSMA) antikropp, magenta] visualiseras i en hel njure. (B) Den förstorade x-y-planbilden av (A) visas [anti-TH-antikropp, grön; anti-αSMA-antikropp, magenta]. (C) Ihållande denervation efter njurischemi-reperfusionsskada (IRI) visualiseras. (D) Sympatiska nerver i en mjälte visualiseras också i en hel mjälte av det aktuella protokollet. Denna bild återges från Hasegawa et al.9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Kvantifiering av tredimensionell immunofluorescerande färgning. Processen att kvantifiera förhållandet mellan signalpositiv volym och total njurvolym visas. Binär konvertering utförs enligt varje tröskel. Volymerna erhålls genom att beräkna integralen av intresseområdet (voxelstorlek: x = 6, 45 μm, y = 6, 45 μm, z = 7 μm). Bilden är återgiven från Hasegawa et al.9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Tredimensionell avbildning av uppsamlingskanaler, proximala tubuler och glomeruli. (A) Uppsamlingskanaler [anti-aquaporin 2 (AQP2) antikropp], S1-segment av proximala tubuler [antinatriumglukoskotransporter 2 (SGLT2) antikropp] respektive glomeruli (anti-podocin-antikropp) visualiseras i en hel njure. Bilden är återgiven från Hasegawa et al.9. (B) Glomerulomegali observeras i det tidiga stadiet av diabetisk njursjukdom (anti-podocinantikropp), som undertrycks av läkemedelsadministration. Bilden är återgiven från Hasegawa et al.11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: Roterande film av njuren. Den roterande filmen av njuren i figur 4A visas. Sympatiska nerver [anti-tyrosinhydroxylas (TH) antikropp, grön] och artärer [anti-α-glatt muskelaktin (αSMA) antikropp, magenta] visualiseras. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det nuvarande protokollet tillät helnjure 3D-avbildning av olika strukturer såsom sympatiska nerver, uppsamlingskanaler, artärer, proximala tubuler och glomeruli 9,10,11. Denna färgningsmetod erbjöd makroskopisk observation och ledde till nya biologiska upptäckter genom att visualisera förändringen i njursympatiska nerver efter ischemi-reperfusionsskada 9,10 och glomerulomegali i början av diabetisk njursjukdom 11.
Opacitet härrör från optisk inhomogenitet i en vävnad5. Den gemensamma principen för olika vävnadsrensningsmetoder är att ta bort ljusspridare/absorbenter och fylla utrymmet med RI-matchande reagenser. Jämfört med organiska lösningsmedelsbaserade metoder såsom 3D-avbildning av lösningsmedelsrensade organ (3DISCO/iDISCO)3,14 är CUBIC baserat på hydrofila reagenser och är därmed överlägsen vid fluorescerande konservering5. Denna egenskap hos CUBIC gör det möjligt för forskare att observera fluorescerande signaler från reportermusstammar2 samt signaler från helmonterade immunofluorescerande färgningar, vilket ger fler alternativ för en omfattande förståelse av 3D-organstrukturerna.
Det nuvarande CUBIC-baserade vävnadsrensningsprotokollet kan uppnå hög transparens för 3D-avbildning jämfört med tidigare musnjurerensningsforskning15. Det måste dock noteras att detta clearingprotokoll är lämpligt för musnjurar. En starkare delipidationsprocess behövs för att rensa mänskliga njurar. presenterade till exempel nyligen ett tillvägagångssätt för intakt kartläggning av mänskliga organ genom att utveckla den effektiva vävnadsröjningsmetoden SHANEL (small-micelle-mediated human organ efficient clearing and labeling)16. Eftersom starkare delipidering skadar prover måste forskare välja en lämplig vävnadsrensningsmetod enligt deras syfte.
Helmonterade organfärgning är utmanande på grund av svårigheten med antikroppspenetration; Detta protokoll har upprättats efter försök och fel. Eftersom färgningens stabilitet prioriteras kan inkubationstiden vara längre än det minimum som krävs. Som ett resultat har detta protokoll visat högkvalitativ helmonterad färgning av njurarna av antikropparna. Det finns dock en möjlighet att det kanske inte fungerar bra, beroende på målantigenerna som vi inte har provat. En nyligen genomförd studie har visat att tvåstegsfärgning med primära och sekundära antikroppar som det nuvarande protokollet i vissa fall inte är optimalt för helmonterad färgning av mushjärnor17. Detta beror på att när målmängden är stor fyller dess primära antikropp provet, vilket gör det svårt för den sekundära antikroppen att tränga djupt in i vävnaden17. Således är den fluorescerande märkta primära antikroppen, eller komplexet av den primära antikroppen och sekundärt Fab-fragment17, värt att försöka om penetrationen av antikroppar inte är effektiv.
När det gäller bildprocessen måste forskare välja en lämplig typ av mikroskopi och bildupplösning enligt deras syfte. Om forskare vill genomföra helnjure 3D-avbildning som presenteras i denna studie är det bättre att använda lysrörsmikroskopi för ljusark eftersom det snabbt kan förvärva breda z-stackbilder med låg fotoblekningsnivå. Eftersom filstorleken på 3D-bilddata är enorm bör bildupplösningen minskas i den utsträckning som helorgansavbildning kan stå. Däremot kan forskare också använda konfokala eller multifotonmikroskopier när de erhåller 3D-bilddata med hög upplösning i trångt utrymme.
Sammanfattningsvis har den aktuella studien utvecklat helmonterad njurfärgning för 3D-avbildning med vävnadsrensningsmetoden CUBIC. Protokollet möjliggör visualisering av 3D-strukturer i en hel njure, vilket ger ett makroskopiskt perspektiv för njurforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
En del av detta arbete genomfördes genom samarbete med prof. Hiroki R. Ueda (University of Tokyo), Prof. Etsuo A. Susaki (Juntendo University), Prof. Tetsuhiro Tanaka (Tohoku University), Prof. Masafumi Fukagawa, Dr. Takehiko Wada och Dr. Hirotaka Komaba (Tokai University).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube | Falcon | 352059 | Tissue clearing, staining, wash |
| 2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine | Tokyo Chemical Industry | D1876 | CUBIC-R+ |
| 37%-Formaldehyde Solution | Nacalai Tesque | 16223-55 | Post fixation |
| 4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Nacalai Tesque | 09154-85 | Kidney fixation |
| Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody | Invitrogen | A-21436 | Secondary antibody (1:100) |
| Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | A-31573 | Secondary antibody (1:200) |
| Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody | Abcam | ab199975 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-podocin antibody | Sigma-Aldrich | P0372 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody | Abcam | ab85626 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody | Abcam | ab113 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody | Abcam | ab5694 | Primary antibody (1:200) |
| Blocker Casein in PBS | Thermo Fisher Scientific | 37528 | Staining buffer |
| Butorphanol Tartrate | Meiji | 005526 | Anesthetic |
| C57BL/6NJcl | Nippon Bio-Supp.Center | N/A | Mouse strain |
| Imaris | Bitplane | N/A | Imaging analysis software |
| Macro-zoom microscope | OLYMPUS | MVX10 | The observation unit of the custom-built microscope |
| Medetomidine Hydrochloride | Kyoritsu-Seiyaku | 008656 | Anesthetic |
| Midazolam | SANDOZ | 27803229 | Anesthetic |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Immersion oil |
| N-buthyldiethanolamine | Tokyo Chemical Industry | B0725 | CUBIC-L, CUBIC-R+ |
| Nicotinamide | Tokyo Chemical Industry | N0078 | CUBIC-R+ |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | CUBIC-L, PBST |
| Silicon oil HIVAC-F4 | Shin-Etsu Chemical | 50449832 | Immersion oil |
| Sodium azide | Wako | 195-11092 | Staining buffer |
References
- Velez-Fort, M., et al. The stimulus selectivity and connectivity of layer six principal cells reveals cortical microcircuits underlying visual processing. Neuron. 83 (6), 1431-1443 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Tainaka, K., et al. Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Hasegawa, S., et al. Comprehensive three-dimensional analysis (CUBIC-kidney) visualizes abnormal renal sympathetic nerves after ischemia/reperfusion injury. Kidney International. 96 (1), 129-138 (2019).
- Hasegawa, S., Inoue, T., Inagi, R. Neuroimmune interactions and kidney disease. Kidney Research and Clinical Practice. 38 (3), 282-294 (2019).
- Hasegawa, S., et al. The oral hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor enarodustat counteracts alterations in renal energy metabolism in the early stages of diabetic kidney disease. Kidney International. 97 (5), 934-950 (2020).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hasegawa, S., et al. Activation of sympathetic signaling in macrophages blocks systemic inflammation and protects against renal ischemia-reperfusion injury. Journal of the American Society of Nephrology. 32 (7), 1599-1615 (2021).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1-22 (2020).
