Summary
本プロトコルは、3次元(3D)腎臓イメージングのための組織透明化法およびホールマウント免疫蛍光染色を記載する。この技術は、腎臓病理学における巨視的な視点を提供し、新しい生物学的発見につながる可能性があります。
Abstract
従来の病理では腎臓の微細構造に関する情報が数多くありましたが、腎臓の血管、近位尿細管、集合管、糸球体、交感神経の正確な構造を知ることは、3次元(3D)情報が不足しているため困難でした。光学クリアリングは、この大きなハードルを克服するための優れた戦略です。組織クリアリングと3Dイメージング技術を組み合わせることで、臓器全体の複数の細胞を単一細胞分解能で解析できます。しかし、全臓器イメージングのための細胞標識法は未開発のままです。特に、ホールマウント臓器染色は抗体の浸透が難しいため困難です。本プロトコルは、CUBIC(透明で遮るもののない脳/身体イメージングカクテルおよび計算分析)組織クリアリング法による3Dイメージング用のホールマウントマウス腎臓染色を開発しました。糖尿病性腎疾患の早期における虚血再灌流障害後の腎交感神経除神経や糸球体腫大を総合的に可視化することが可能となりました。したがって、この技術は、巨視的な視点を提供することにより、腎臓研究における新しい発見につながる可能性があります。
Introduction
腎臓はさまざまな細胞集団で構成されています。従来の病理では腎臓の微小環境に関する多くの情報が得られますが、腎臓病進行時の細胞間クロストークを正確に理解するためには、3次元(3D)イメージングが必要です。従来、臓器全体の3Dイメージングには膨大な数の連続切片作成と画像再構成が必要でした1。しかし、この方法は手間がかかりすぎて再現性に問題がありました。
光学クリアリングは、このハードル2,3を克服するための優れた戦略です。組織の不透明度は、各臓器が水、タンパク質、脂質などのさまざまな物質で構成されているため、主に光の散乱と吸収によるものです。したがって、組織透明化の基本的な戦略は、組織内の水と脂質を、タンパク質4と同じ光学特性を持つ屈折率(RI)マッチング試薬に置き換えることです。透明な標本を観察するためには、ライトシート蛍光顕微鏡が有用である5。ライトシートは透明な試料を側面から照らし、励起信号は垂直位置6にある対物レンズを通して取得される。この顕微鏡は、共焦点または多光子蛍光顕微鏡とは異なる、単一のスイープで断面情報を取得します。したがって、低レベルの光退色でzスタック画像をすばやく取得できます。
透明で遮るもののない脳/身体イメージングカクテルおよび計算分析(CUBIC)は、ライトシート蛍光顕微鏡による全臓器イメージングを可能にする組織クリアリング方法の1つです2,7,8。CUBICおよびホールマウント免疫蛍光染色は、マウス腎臓の3D構造を視覚化するために本研究で最適化されています9、10、11。このホールマウント染色法を用いて、糖尿病性腎疾患11の早期虚血再灌流障害9,10および糸球体腫大後の腎交感神経の変化、ならびに腎臓全体の血管、近位尿細管、および集合管の変化を可視化します9。
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Protocol
すべての実験は東京大学治験審査委員会の承認を受けました。すべての動物の手順は、国立衛生研究所のガイドラインに従って実施されました。8週齢の雄C57BL/6NJclマウスを本研究に用いた。マウスは市販の供給源から入手した( 材料表参照)。
1.動物の準備と腎臓の固定
- 以下の手順に従って灌流固定を行います。
- イソフルラン(3%、2.0 L / min)の吸入と塩酸メデトミジン(0.3 mg / kg)、酒石酸ブトルファノール(5 mg / kg)、およびミダゾラム(4 mg / kg)の腹腔内投与によってマウスを麻酔します( 材料の表を参照)。.
- 心臓12の左心室を通して、20mLのPBS(pH7.4)およびリン酸緩衝液(PB)中の30mLの4%PFAで動物に灌流する。
- 灌流固定と腎臓サンプリングの直後に浸漬固定を行う9.
- 腎臓を4%PFAに4°Cでさらに16時間浸した後、PBSで2時間(3回)洗浄します9 (図1)。
注意: ホルムアルデヒドとパラホルムアルデヒドは有毒な刺激物です。適切な個人用保護具を備えたヒュームフード内の試薬を取り扱ってください。
- 腎臓を4%PFAに4°Cでさらに16時間浸した後、PBSで2時間(3回)洗浄します9 (図1)。
2.脱色と脱脂
- 以前に発表された報告4,8,9に従って、10重量%のTriton X-100と10重量%のN-ブチルジエタノールアミンからなる脱色および脱脂質化用のCUBIC-Lを調製します(材料の表を参照)。
- CUBIC-Lによる脱色・脱脂は以下の手順で行ってください。
- 固定した腎臓を7 mLの50%(v / v)CUBIC-L(水とCUBIC-Lの1:1混合物)に14 mLの丸底チューブ( 材料の表を参照)に浸し、室温で6時間穏やかに振とうします(図2A)。その後、14mLの丸底チューブに7mLのCUBIC-Lを浸漬し、37°Cで5日間穏やかに振とうします。
- このプロセス中は、CUBIC-Lを毎日更新してください。脱色および脱脂プロセスの後、腎臓をPBSで室温で2時間(3回)洗浄します9 (図1)。サンプルの取り扱いにはディスペンシングスプーンを使用してください(図2B)。
3. ホールマウント免疫蛍光染色
- 染色バッファーを準備します。
- 0.5%(v/v)のTriton X-100、PBS中の0.5%カゼイン、および0.05%アジ化ナトリウムを混合することにより、一次抗体用の染色バッファーを調製します9。
- 0.5%(v/v)のTriton X-100、0.1%のカゼインをPBSに、0.05%のアジ化ナトリウムを混合して、二次抗体用の染色バッファーを調製します9。
- 一次抗体による染色を行います。
- 脱脂質化した腎臓を一次抗体(1:100または1:200、 材料の表を参照)で染色バッファー中で37°Cで7日間穏やかに振とうしながら免疫染色します。
注:1つの腎臓に必要な染色バッファーの量は500〜600μLです(図2C)。 - PBS(PBST)中の0.5%(v / v)トリトンX-100で腎臓を室温で1日間洗浄します 9(図1)。
- 脱脂質化した腎臓を一次抗体(1:100または1:200、 材料の表を参照)で染色バッファー中で37°Cで7日間穏やかに振とうしながら免疫染色します。
- 二次抗体による染色を行います。
- 腎臓を二次抗体(1:100または1:200、 材料表を参照)で染色バッファー中で37°C、7日間穏やかに振とうしながら免疫染色します。腎臓をPBSTで室温で1日間洗浄します9 (図1)。
- 固定後9、腎臓をPB中の1%ホルムアルデヒド(37%ホルムアルデヒドとPBの1:36混合物)に3時間浸し、PBSで室温で6時間洗浄します(図1)。
4. 屈折率(RI)マッチング
- キュービックR+を準備します。
- 45重量%の2,3-ジメチル-1-フェニル-5-ピラゾロン/アンチピリンと30重量%のニコチンアミドを混合してCUBIC-Rを調製します(材料の表を参照)。
- 以前に発表されたレポート4,8,9に従って、0.5 v%のN-ブチルジエタノールアミンをCUBIC-Rに添加することにより、屈折率(RI)マッチング用のCUBIC-R+を準備します。
- RI マッチングを実行します。
- 腎臓を7 mLの50%(v / v)CUBIC-R +(水とCUBIC-R +の1:1混合物)に14 mLの丸底チューブに浸し、室温で1日間穏やかに振とうします。.次に、室温で2日間穏やか に振とうしながら、14 mLの丸底チューブ内の7 mLのCUBIC-R+に浸します9(図1)。
注:腎臓はRIマッチングの開始時に50%CUBIC-R +で浮遊しますが、プロセスの最後に沈み、CUBIC-R +で透明になります(図2D)。
- 腎臓を7 mLの50%(v / v)CUBIC-R +(水とCUBIC-R +の1:1混合物)に14 mLの丸底チューブに浸し、室温で1日間穏やかに振とうします。.次に、室温で2日間穏やか に振とうしながら、14 mLの丸底チューブ内の7 mLのCUBIC-R+に浸します9(図1)。
5. 画像の取得と再構成
- 画像取得中(RI = 1.51)5 (図3)中に、RIに整合した腎臓をシリコンオイル(RI = 1.555)とミネラルオイル(RI = 1.467)の混合物に浸します(55:45)。
- 特注の9 ライトシート蛍光顕微鏡で腎臓全体の3D画像を取得します( 材料表を参照)。すべての生の画像データを16ビットTIFF形式で収集します。イメージング解析ソフトウェア(Imaris、 材料表を参照)を使用して、3Dレンダリングされた画像を視覚化およびキャプチャします。
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Representative Results
この染色法を用いて、腎臓全体の交感神経[抗チロシンヒドロキシラーゼ(TH)抗体]および動脈[抗α平滑筋アクチン(αSMA)抗体](図4A、Bおよびビデオ1)を可視化しました9。虚血/再灌流障害(IRI)後の異常な腎交感神経も可視化されました9,10(図4C)。さらに、脾臓13全体における交感神経の可視化は、このプロトコルを用いて達成された(図4D)。3D免疫蛍光データを定量する一例を図5に示す。
また、採取管[抗アクアポリン2(AQP2)抗体]、近位尿細管のS1セグメント[抗ナトリウムグルコース共輸送体2(SGLT2)抗体]、および糸球 体(抗ポドシン抗体)を腎臓全体9で可視化することに成功しました(図6A)。この糸球体の3Dイメージングを用いて、糖尿病性腎疾患の初期段階における糸球体腫大(抗ポドシン抗体)を可視化し、薬剤投与により抑制した11 (図6B)。
図1:組織透明化とホールマウント免疫蛍光染色。 CUBICによる組織透明化は、脱脂質化(CUBIC-L)と屈折率(RI)マッチング(CUBIC-R+)の2段階のプロセスです。ホールマウント染色は、脱脂質化プロセスの後に行われます。スケールバー= 10 mm。画像は長谷川ら9から転載しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:処理プロセスの画像 。 (A)サンプルを7mLの50%または100%キュービック-Lの14mL丸底チューブに浸します。チューブは、脱脂プロセス中に穏やかに振とうしながら水平に保たれます。(B)サンプルの取り扱いにはディスペンシングスプーンを使用します。(C)腎臓1本に必要な染色バッファーの量は500〜600μLです。染色プロセス中、チューブは垂直に保たれます。(D)サンプルは、RIマッチングの開始時に50%CUBIC-R+に浮かんでいますが、プロセスの最後には沈み込み、CUBIC-R+で透明になります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:全腎臓3Dイメージング用のライトシート蛍光顕微鏡。 ライトシート蛍光顕微鏡(LSFM)は、透明なサンプルの3次元(3D)イメージングを可能にします。この画像は長谷川ら9から転載しています。データ取得時には液浸油が使用されます。両側からのライトシートがサンプルを照らします。励起信号は、垂直位置にある対物レンズを介して取得されます。ステージが軸方向に移動し、zスタック画像が得られます。スケールバー= 10 mm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.交感神経と動脈の全腎3次元イメージング。 (A)交感神経[抗チロシンヒドロキシラーゼ(TH)抗体、緑色]と動脈[抗α平滑筋アクチン(αSMA)抗体、マゼンタ]を腎臓全体で可視化する。(B)(A)の拡大x-y面像を示す[抗TH抗体、緑;抗αSMA抗体、マゼンタ]。(C)腎虚血再灌流障害(IRI)後の持続的な除神経を可視化します。(D)脾臓の交感神経も現在のプロトコルでは脾臓全体で視覚化されています。この画像は長谷川ら9から転載しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:三次元免疫蛍光染色の定量。 総腎臓容積に対するシグナル陽性体積の比率を定量化するプロセスが示されている。バイナリ変換は、各しきい値に従って実行されます。体積は、関心領域の積分を計算することによって得られます(ボクセルサイズ:x = 6.45 μm、y = 6.45 μm、z = 7 μm)。画像は長谷川ら9から転載しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:集合管、近位尿細管、糸球体の全腎3次元イメージング 。 (A)腎臓全体で、近位尿細管のS1セグメント[抗ナトリウムグルコース共輸送体2(SGLT2)抗体]、糸球体(抗ポドシン抗体)をそれぞれ可視化する。画像は長谷川ら9から転載しています。(B)糖尿病性腎疾患(抗ポドシン抗体)の初期に糸球体腫大が認められ、薬剤投与により抑制される。画像は長谷川ら11から転載。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ1:腎臓の回転動画。 腎臓の回転動画を 図4A に示す。交感神経[抗チロシンヒドロキシラーゼ(TH)抗体、緑色]と動脈[抗α平滑筋アクチン(αSMA)抗体、マゼンタ]を可視化します。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本プロトコルにより、交感神経、集合管、動脈、近位尿細管、糸球体などのさまざまな構造の腎臓全体の3Dイメージングが可能になりました9、10、11。この染色法は、糖尿病性腎疾患11の虚血再灌流障害後の腎交感神経の変化を可視化し、新たな生物学的発見をもたらした。
不透明度は、組織5における光学的不均一性に由来する。さまざまな組織透明化法の共通原理は、光散乱体/吸収体を除去し、RIマッチング試薬で空間を満たすことです。溶媒除去臓器の3Dイメージング(3DISCO/iDISCO)3,14などの有機溶媒ベースの方法と比較して、CUBICは親水性試薬に基づいているため、蛍光保存に優れています5。CUBICのこの特性により、研究者はレポーターマウス系統2からの蛍光シグナルとホールマウント免疫蛍光染色からのシグナルを観察することができ、3D臓器構造を包括的に理解するためのより多くのオプションを提供します。
現在のCUBICベースの組織クリアリングプロトコルは、以前のマウス腎臓クリアリング研究と比較して、3Dイメージングの高い透明性を達成することができます15。しかしながら、この透明化プロトコルはマウス腎臓に適していることに留意しなければならない。人間の腎臓をきれいにするには、より強力な脱脂質プロセスが必要です。たとえば、Zhaoらは最近、SHANEL(小ミセルを介したヒト臓器の効率的な透明化と標識)16という名前の効率的な組織透明化法を開発することにより、無傷のヒト臓器マッピングのアプローチを発表しました。より強い脱脂はサンプルに損傷を与えるため、研究者は目的に応じて適切な組織透明化方法を選択する必要があります。
ホールマウント臓器染色は、抗体の浸透が難しいため困難です。現在のプロトコルは試行錯誤の後に確立されました。染色の安定性が優先されるため、インキュベーション時間は必要最小限よりも長くなる可能性があります。その結果、このプロトコルは、抗体による腎臓の高品質のホールマウント染色を実証しました。ただし、試していない標的抗原によってはうまく機能しない可能性があります。最近の研究では、現在のプロトコルのような一次抗体と二次抗体を使用した2段階染色は、マウス脳のホールマウント染色に最適ではない場合があることが示されています17。これは、標的量が多いと、その一次抗体が試料を満たし、二次抗体が組織17の奥深くまで浸透しにくくなるからである。したがって、蛍光標識された一次抗体、または一次抗体と二次Fabフラグメント17との複合体は、抗体の浸透が効率的でない場合に試す価値がある。
イメージングプロセスに関しては、研究者は目的に応じて適切なタイプの顕微鏡と画像解像度を選択する必要があります。研究者がこの研究で提示されたように腎臓全体の3Dイメージングを実施したい場合は、低レベルの光退色で広いzスタック画像をすばやく取得できるため、ライトシート蛍光顕微鏡を使用することをお勧めします。3Dイメージングデータのファイルサイズは膨大であるため、臓器全体のイメージングに耐えられる程度に画像の解像度を下げる必要があります。対照的に、研究者は、狭いスペースで高解像度の3Dイメージングデータを取得するときに、共焦点顕微鏡または多光子顕微鏡を使用することもできます。
結論として、現在の研究では、組織透明化法CUBICを使用した3Dイメージング用のホールマウント腎臓染色を開発しました。このプロトコルは、腎臓全体の3D構造の視覚化を可能にし、腎臓研究に巨視的な視点を提供します。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
本研究の一部は、東京大学の上田宏樹教授、順天堂大学須崎悦夫教授、東北大学・田中哲弘教授、深川雅文教授、和田武彦博士、駒場博隆教授(東海大学)との共同研究によって行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube | Falcon | 352059 | Tissue clearing, staining, wash |
| 2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine | Tokyo Chemical Industry | D1876 | CUBIC-R+ |
| 37%-Formaldehyde Solution | Nacalai Tesque | 16223-55 | Post fixation |
| 4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Nacalai Tesque | 09154-85 | Kidney fixation |
| Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody | Invitrogen | A-21436 | Secondary antibody (1:100) |
| Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | A-31573 | Secondary antibody (1:200) |
| Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody | Abcam | ab199975 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-podocin antibody | Sigma-Aldrich | P0372 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody | Abcam | ab85626 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody | Abcam | ab113 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody | Abcam | ab5694 | Primary antibody (1:200) |
| Blocker Casein in PBS | Thermo Fisher Scientific | 37528 | Staining buffer |
| Butorphanol Tartrate | Meiji | 005526 | Anesthetic |
| C57BL/6NJcl | Nippon Bio-Supp.Center | N/A | Mouse strain |
| Imaris | Bitplane | N/A | Imaging analysis software |
| Macro-zoom microscope | OLYMPUS | MVX10 | The observation unit of the custom-built microscope |
| Medetomidine Hydrochloride | Kyoritsu-Seiyaku | 008656 | Anesthetic |
| Midazolam | SANDOZ | 27803229 | Anesthetic |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Immersion oil |
| N-buthyldiethanolamine | Tokyo Chemical Industry | B0725 | CUBIC-L, CUBIC-R+ |
| Nicotinamide | Tokyo Chemical Industry | N0078 | CUBIC-R+ |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | CUBIC-L, PBST |
| Silicon oil HIVAC-F4 | Shin-Etsu Chemical | 50449832 | Immersion oil |
| Sodium azide | Wako | 195-11092 | Staining buffer |
References
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