Summary
본 프로토콜은 3차원(3D) 신장 영상을 위한 조직 투명화 방법 및 전체-마운트 면역형광 염색을 기술한다. 이 기술은 신장 병리학에서 거시적 관점을 제공하여 새로운 생물학적 발견으로 이어질 수 있습니다.
Abstract
기존의 병리학은 신장 미세 구조에 대한 많은 정보를 제공했지만 3차원(3D) 정보가 부족하여 신장의 혈관, 근위 세뇨관, 수집 관, 사구체 및 교감 신경의 정확한 구조를 알기가 어려웠습니다. 광학 클리어링은 이 큰 장애물을 극복하기 위한 좋은 전략입니다. 전체 장기의 여러 세포는 조직 투명화와 3D 이미징 기술을 결합하여 단일 세포 분해능으로 분석할 수 있습니다. 그러나 전체 장기 이미징을위한 세포 표지 방법은 아직 개발되지 않았습니다. 특히, 전체 장착 장기 염색은 항체 침투의 어려움 때문에 어렵습니다. 본 프로토콜은 CUBIC (투명하고 방해받지 않는 뇌 / 신체 이미징 칵테일 및 전산 분석) 조직 투명화 방법을 사용하여 3D 이미징을위한 전체 마운트 마우스 신장 염색을 개발했습니다. 이 프로토콜은 포괄적 인 관점에서 당뇨병 성 신장 질환의 초기 단계에서 허혈 재관류 손상 및 사구체 비대 후 신장 교감 신경 탈신경을 시각화 할 수있게했습니다. 따라서이 기술은 거시적 관점을 제공함으로써 신장 연구에서 새로운 발견으로 이어질 수 있습니다.
Introduction
신장은 다양한 세포 집단으로 구성됩니다. 기존의 병리학은 신장 미세 환경에 대한 많은 정보를 제공하지만 신장 질환 진행 중 세포 간 누화를 정확하게 이해하려면 3차원(3D) 영상이 필요합니다. 과거에는 전체 장기 3D 이미징1을 위해 수많은 연속 절단 및 이미지 재구성을 수행해야 했습니다. 그러나이 방법은 너무 많은 노력이 필요하고 재현성 측면에서 문제가있었습니다.
광학 클리어링은 이 장애물 2,3을 극복하기 위한 좋은 전략입니다. 조직 불투명도는 각 기관이 물, 단백질 및 지질을 포함한 다양한 물질로 구성되어 있기 때문에 주로 광산란 및 흡수로 인한 것입니다. 따라서 조직 청소의 기본 전략은 조직의 물과 지질을 단백질4와 동일한 광학적 특성을 갖는 굴절률(RI) 일치 시약으로 대체하는 것입니다. 투명한 시편을 관찰하기 위해서는, 라이트 시트 형광 현미경이 유용하다5. 라이트 시트는 측면에서 투명한 시편을 비추고 여기 신호는 수직 위치6에 위치한 대물 렌즈를 통해 획득됩니다. 이 현미경은 단일 스윕으로 단면 정보를 얻으며, 이는 컨포칼 또는 다광자 형광 현미경과 다릅니다. 따라서 낮은 수준의 광퇴색으로 z 스택 이미지를 빠르게 획득할 수 있습니다.
투명하고 방해받지 않는 뇌/신체 영상 칵테일 및 전산 분석(CUBIC)은 광학 시트 형광 현미경 2,7,8로 전체 장기 이미징을 가능하게 하는 조직 투명화 방법 중 하나입니다. CUBIC 및 전체 장착 면역형광 염색은 마우스 신장 3D 구조 9,10,11을 시각화하기 위해 본 연구에서 최적화되었습니다. 이 전체 장착 염색 방법을 사용하여 허혈 재관류 손상 9,10 및 당뇨병 성 신장 질환 11의 초기 단계의 사구체 비대뿐만 아니라 혈관, 근위 세뇨관 및 전체 신장 9의 수집 덕트 후에 신장 교감 신경의 변화를 시각화합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 실험은 도쿄 대학 기관 검토위원회의 승인을 받았습니다. 모든 동물 절차는 국립 보건원 지침에 따라 수행되었습니다. 8주령의 수컷 C57BL/6NJcl 마우스를 본 연구에 사용하였다. 마우스는 상업적 출처로부터 수득하였다( 재료 표 참조).
1. 동물 준비 및 신장 고정
- 아래 단계에 따라 관류 고정을 수행하십시오.
- 이소플루란(3%, 2.0L/min)을 흡입하고 메데토미딘 염산염(0.3mg/kg), 부토르파놀 타르트레이트(5mg/kg) 및 미다졸람(4mg/kg)을 복강내 투여하여 마우스를 마취시킵니다( 재료 표 참조).
- 동물을 20mL의 PBS(pH 7.4) 및 30mL의 4% PFA로 인산염 완충액(PB)으로 관류시킨다(12).
- 관류 고정 직후 침지 고정을 수행하고 신장 샘플링9.
- 신장을 4°C에서 4% PFA에 16시간 더 담근 다음 PBS로 2시간(3회)9 동안 세척합니다(그림 1).
주의 : 포름 알데히드와 파라 포름 알데히드는 독성 자극제입니다. 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 흄 후드에서 시약을 취급하십시오.
- 신장을 4°C에서 4% PFA에 16시간 더 담근 다음 PBS로 2시간(3회)9 동안 세척합니다(그림 1).
2. 탈색 및 탈색
- 이전에 발표 된 보고서 4,8,9에 따라 10wt %의 Triton X-100과 10wt %의 N- 부틸 디 에탄올 아민 (재료 표 참조)으로 구성된 탈색 및 탈색을 위해 CUBIC-L을 준비하십시오.
- 아래 단계에 따라 CUBIC-L에 의한 탈색 및 탈색을 수행하십시오.
- 고정된 신장을 14mL 둥근 바닥 튜브(재료 표 참조)에 넣고 7mL의 50%(v/v) CUBIC-L(물과 CUBIC-L의 1:1 혼합물)에 담그고 실온에서 6시간 동안 부드럽게 흔듭니다(그림 2A). 그런 다음 14mL 둥근 바닥 튜브에 7mL의 CUBIC-L에 담그고 37°C에서 5일 동안 부드럽게 흔듭니다.
- 이 과정에서 매일 CUBIC-L을 새로 고칩니다. 탈색 및 탈색 과정 후 실온에서 PBS로 신장을 2시간(3회)9 세척합니다(그림 1). 시료 취급을 위해 분주 스푼을 사용하십시오(그림 2B).
3. 전체 마운트 면역 형광 염색
- 염색 완충액을 준비한다.
- PBS에 0.5%(v/v) Triton X-100, 0.5% 카제인, 0.05% 아지드화나트륨9를 혼합하여 1차 항체용 염색 완충액을 준비합니다.
- PBS에 0.5%(v/v) Triton X-100, 0.1% 카제인, 0.05% 아지드화나트륨9를 혼합하여 2차 항체용 염색 완충액을 준비합니다.
- 1 차 항체로 염색을 수행하십시오.
- 37°C에서 염색 완충액에서 1차 항체(1:100 또는 1:200, 재료 표 참조)로 지질된 신장을 면역염색하고 7일 동안 부드럽게 흔들었다.
참고: 한 신장에 필요한 염색 완충액의 양은 500-600 μL입니다(그림 2C). - 신장을 PBS(PBST)의 0.5%(v/v) 트리톤 X-100으로 실온에서1일 동안 세척합니다(그림 1).
- 37°C에서 염색 완충액에서 1차 항체(1:100 또는 1:200, 재료 표 참조)로 지질된 신장을 면역염색하고 7일 동안 부드럽게 흔들었다.
- 2 차 항체로 염색을 수행하십시오.
- 37°C에서 염색 완충액에서 2차 항체(1:100 또는 1:200, 재료 표 참조)로 신장을 면역염색하고 7일 동안 부드럽게 흔들었다. 실온에서 PBST로 신장을1일 동안 세척합니다(그림 1).
- 고정후 9, 신장을 PB의 1% 포름알데히드(37% 포름알데히드와 PB의 혼합물 1:36)에 3시간 동안 담그고 실온에서 PBS로 6시간 동안 세척합니다(그림 1).
4. 굴절률 (RI) 일치
- 큐빅-R+를 준비합니다.
- 45wt%의 2,3-디메틸-1-페닐-5-피라졸론/안티피린과 30wt%의 니코틴아미드를 혼합하여 CUBIC-R을 준비합니다( 재료 표 참조).
- 이전에 발표 된 보고서 4,8,9에 따라 CUBIC-R에 N- 부틸 디 에탄올 아민 0.5 v%를 추가하여 굴절률 (RI) 일치를 위해 CUBIC-R +를 준비합니다.
- RI 일치를 수행합니다.
- 신장을 14mL 둥근 바닥 튜브에 넣고 14mL 둥근 바닥 튜브에 50%(v/v) CUBIC-R+(물과 CUBIC-R+의 1:1 혼합물) 7mL에 담그고 실온에서 1일 동안 부드럽게 흔듭니다. 그런 다음 14mL 둥근 바닥 튜브에 7mL의 CUBIC-R+를 담그고 실온에서2일 동안 부드럽게 흔들어 9(그림 1).
참고: 신장은 RI 매칭이 시작될 때 50% CUBIC-R+에 떠 있지만 프로세스가 끝나면 CUBIC-R+에서 가라앉고 투명해집니다(그림 2D).
- 신장을 14mL 둥근 바닥 튜브에 넣고 14mL 둥근 바닥 튜브에 50%(v/v) CUBIC-R+(물과 CUBIC-R+의 1:1 혼합물) 7mL에 담그고 실온에서 1일 동안 부드럽게 흔듭니다. 그런 다음 14mL 둥근 바닥 튜브에 7mL의 CUBIC-R+를 담그고 실온에서2일 동안 부드럽게 흔들어 9(그림 1).
5. 이미지 획득 및 재구성
- 이미지 획득 중에 RI 매칭 신장을 실리콘 오일(RI = 1.555)과 미네랄 오일(RI = 1.467)(55:45)의 혼합물에 담그십시오(RI = 1.51)5 (그림 3).
- 맞춤형9 라이트 시트 형광 현미경으로 전체 신장의 3D 이미지를 획득합니다( 재료 표 참조). 모든 원시 이미지 데이터를 16비트 TIFF 형식으로 수집합니다. 이미징 분석 소프트웨어로 3D 렌더링 이미지를 시각화하고 캡처합니다(Imaris, 재료 표 참조).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 염색 방법을 사용하여 전체 신장 (그림 4A, B 및 비디오 1)의 교감 신경 [항 티로신 하이드 록 실라 제 (TH) 항체] 및 동맥 [항 α 평활근 액틴 (αSMA) 항체]을 시각화했습니다9. 비정상적인 신장 교감 신경은 허혈 / 재관류 손상 (IRI) 9,10 후에 시각화되었습니다 (그림 4C). 더욱이, 전체 비장(13)에서 교감신경 시각화는 이 프로토콜을 사용하여 달성되었다(도 4D). 3D 면역형광 데이터를 정량화하는 한 가지 예가 도 5에 도시되어 있다.
또한,전체 신장에서 수집 덕트 [항 아쿠아 포린 2 (AQP2) 항체], 근위 세뇨관의 S1 세그먼트 [항 나트륨 포도당 공동 수송 체 2 (SGLT2) 항체] 및 사구체 (항 포도 신 항체)를 시각화하는 데 성공했습니다 9 (그림 6A). 사구체의 이 3D 이미징을 사용하여, 사구체 비대(항-포도신 항체)를 당뇨병성 신장 질환의 초기 단계에서 시각화하였고, 이는약물 투여에 의해 억제되었다(도 6B).
그림 1: 조직 투명화 및 전체 마운트 면역형광 염색. CUBIC 에 의한 조직 청소는 지질 (CUBIC-L) 및 굴절률 (RI) 일치 (CUBIC-R +)의 2 단계 프로세스입니다. 전체 마운트 염색은 탈지화 공정 후에 수행됩니다. 스케일 바 = 10mm. 이미지는 Hasegawa et al.9에서 재현되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 취급 과정의 이미지 . (A) 샘플을 14mL 둥근 바닥 튜브에 50% 또는 100% CUBIC-L 7mL에 담근다. 튜브는 탈지화 과정에서 부드럽게 흔들면서 수평으로 유지됩니다. (B) 디스펜싱 스푼은 샘플 취급에 사용됩니다. (C) 하나의 신장에 필요한 염색 완충액의 양은 500-600 μL입니다. 튜브는 염색 과정에서 수직으로 유지됩니다. (D) 샘플은 RI 매칭이 시작될 때 50 % CUBIC-R +에 떠 있지만 프로세스가 끝나면 CUBIC-R +에서 가라 앉고 투명해진다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 전체 신장 3D 이미징을 위한 라이트 시트 형광 현미경. 라이트 시트 형광 현미경(LSFM)은 투명 샘플의 3차원(3D) 이미징을 가능하게 합니다. 이 이미지는 Hasegawa et al.9에서 재현 한 것입니다. 침지 오일은 데이터 수집 중에 사용됩니다. 양쪽의 라이트 시트가 샘플을 비춥니다. 여기 신호는 수직 위치에 위치한 대물 렌즈를 통해 수집됩니다. 스테이지가 축 방향으로 이동하고 z 스택 이미지가 획득됩니다. 스케일 바 = 10mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 교감 신경과 동맥의 전체 신장 3 차원 영상. (A) 교감 신경 [항 티로신 하이드 록 실라 제 (TH) 항체, 녹색]과 동맥 [항 α 평활근 액틴 (αSMA) 항체, 자홍색]이 전체 신장에서 시각화됩니다. (B) (A)의 확대된 x-y 평면 이미지가 [항-TH 항체, 녹색; 항-αSMA 항체, 마젠타]로 표시됩니다. (C) 신장 허혈 재관류 손상 (IRI) 후 지속적인 탈 신경이 시각화됩니다. (D) 비장의 교감 신경은 또한 현재 프로토콜에 의해 전체 비장에서 시각화됩니다. 이 이미지는 Hasegawa et al.9에서 재현 한 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 3차원 면역형광염색의 정량화. 총 신장 부피에 대한 신호 양성 부피의 비율을 정량화하는 과정이 표시됩니다. 이진 변환은 각 임계값에 따라 수행됩니다. 부피는 관심 영역의 적분을 계산하여 얻습니다 (복셀 크기 : x = 6.45 μm, y = 6.45 μm, z = 7 μm). 이미지는 Hasegawa et al.9에서 재현되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 수집 관, 근위 세뇨관 및 사구체의 전체 신장 3차원 이미징. (A) 수집 덕트 [항 아쿠아 포린 2 (AQP2) 항체], 근위 세뇨관의 S1 세그먼트 [항 나트륨 포도당 공동 수송 체 2 (SGLT2) 항체] 및 사구체 (항 포도 신 항체)를 각각 전체 신장에서 시각화합니다. 이미지는 Hasegawa et al.9에서 재현되었습니다. (B) 사구체 비대는 약물 투여에 의해 억제되는 당뇨병 성 신장 질환 (항 포도 신 항체)의 초기 단계에서 관찰됩니다. 이미지는 Hasegawa et al.11에서 재현되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
동영상 1: 신장의 회전 동영상. 신장의 회전 동영상을 도 4A에 도시하고 있다. 교감 신경 [항 티로신 하이드 록 실라 제 (TH) 항체, 녹색]과 동맥 [항 α 평활근 액틴 (αSMA) 항체, 자홍색]이 시각화됩니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
본 프로토콜은 교감 신경, 수집 관, 동맥, 근위 세뇨관 및 사구체 9,10,11과 같은 다양한 구조의 전체 신장 3D 이미징을 허용했습니다. 이 염색 방법은 거시적 관찰을 제공하고 허혈 재관류 손상 9,10 후 신장 교감 신경의 변화와 당뇨병 신장 질환 11의 초기 단계에서 사구체 비대를 시각화함으로써 새로운 생물학적 발견으로 이어졌습니다.
혼탁은 조직5의 광학적 불균일성으로부터 유도된다. 다양한 조직 투명화 방법의 공통 원리는 광산란자/흡수체를 제거하고 RI 일치 시약으로 공간을 채우는 것입니다. 용매 제거 장기의 3D 이미징(3DISCO/iDISCO)3,14과 같은 유기 용매 기반 방법과 비교하여 CUBIC 친수성 시약을 기반으로 하므로형광 보존이 우수합니다5. CUBIC의 이러한 특성을 통해 연구자들은 리포터 마우스 균주2의 형광 신호와 전체 마운트 면역형광 염색의 신호를 관찰할 수 있어 3D 장기 구조를 포괄적으로 이해할 수 있는 더 많은 옵션을 제공합니다.
본 CUBIC-기반 조직 투명화 프로토콜은 이전의 마우스 신장 투명화 연구(15)와 비교하여 3D 이미징에 대해 높은 투명성을 달성할 수 있다. 그러나이 클리어링 프로토콜은 마우스 신장에 적합하다는 점에 유의해야합니다. 인간의 신장을 깨끗이하기 위해서는 더 강력한 탈지 과정이 필요합니다. 예를 들어, Zhao 등은 최근 SHANEL(소미셀 매개 인간 장기 효율적인 제거 및 라벨링)16이라는 효율적인 조직 제거 방법을 개발하여 온전한 인간 장기 매핑을 위한 접근 방식을 제시했습니다. 더 강한 탈지질이 샘플을 손상시키므로 연구자들은 목적에 따라 적절한 조직 제거 방법을 선택해야 합니다.
전체 마운트 장기 염색은 항체 침투의 어려움 때문에 어렵습니다. 현재 프로토콜은 시행 착오 끝에 확립되었습니다. 염색의 안정성이 우선시되기 때문에 배양 시간이 필요한 최소값보다 길어질 수 있습니다. 결과적으로,이 프로토콜은 항체에 의한 신장의 고품질 전체 마운트 염색을 입증했습니다. 그러나 우리가 시도하지 않은 표적 항원에 따라 잘 작동하지 않을 가능성이 있습니다. 최근의 한 연구는 현재 프로토콜과 같은 1차 및 2차 항체를 사용하는 2단계 염색이 일부 경우에 마우스 뇌의 전체-마운트 염색에 최적이 아님을 보여주었다17. 이는 목표량이 많을 때, 그의 1차 항체가 샘플을 채우고, 2차 항체가 조직 내로 깊숙이 침투하기 어렵게 하기 때문이다(17). 따라서, 형광 표지된 1차 항체, 또는 1차 항체와 2차 Fab 단편의 복합체(17)는, 항체의 침투가 효율적이지 않은 경우 시도할 가치가 있다.
이미징 과정과 관련하여 연구원은 목적에 따라 적절한 유형의 현미경 및 이미지 해상도를 선택해야 합니다. 연구자가이 연구에서 제시 한대로 전체 신장 3D 이미징을 수행하려는 경우 낮은 수준의 광 퇴색으로 넓은 z 스택 이미지를 빠르게 획득 할 수 있기 때문에 광학 시트 형광 현미경을 사용하는 것이 좋습니다. 3D 이미징 데이터의 파일 크기가 엄청나기 때문에 전체 장기 이미징이 견딜 수 있을 정도로 이미지 해상도를 줄여야 합니다. 대조적으로, 연구원은 좁은 공간에서 고해상도로 3D 이미징 데이터를 얻을 때 컨포칼 또는 다광자 현미경을 사용할 수도 있습니다.
결론적으로, 현재 연구는 조직 제거 방법 CUBIC을 사용하여 3D 이미징을위한 전체 마운트 신장 염색을 개발했습니다. 이 프로토콜을 사용하면 전체 신장에서 3D 구조를 시각화하여 신장 연구를 위한 거시적 관점을 제공할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구의 일부는 우에다 히로키 교수(도쿄대학), 스사키 에츠오 A. 교수(준텐도 대학), 다나카 테츠히로 교수(도호쿠 대학), 후카가와 마사후미 교수, 와다 타케히코 박사, 고마바 히로타카 박사(도카이 대학)와의 협력을 통해 수행되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube | Falcon | 352059 | Tissue clearing, staining, wash |
| 2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine | Tokyo Chemical Industry | D1876 | CUBIC-R+ |
| 37%-Formaldehyde Solution | Nacalai Tesque | 16223-55 | Post fixation |
| 4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Nacalai Tesque | 09154-85 | Kidney fixation |
| Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody | Invitrogen | A-21436 | Secondary antibody (1:100) |
| Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | A-31573 | Secondary antibody (1:200) |
| Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody | Abcam | ab199975 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-podocin antibody | Sigma-Aldrich | P0372 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody | Abcam | ab85626 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody | Abcam | ab113 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody | Abcam | ab5694 | Primary antibody (1:200) |
| Blocker Casein in PBS | Thermo Fisher Scientific | 37528 | Staining buffer |
| Butorphanol Tartrate | Meiji | 005526 | Anesthetic |
| C57BL/6NJcl | Nippon Bio-Supp.Center | N/A | Mouse strain |
| Imaris | Bitplane | N/A | Imaging analysis software |
| Macro-zoom microscope | OLYMPUS | MVX10 | The observation unit of the custom-built microscope |
| Medetomidine Hydrochloride | Kyoritsu-Seiyaku | 008656 | Anesthetic |
| Midazolam | SANDOZ | 27803229 | Anesthetic |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Immersion oil |
| N-buthyldiethanolamine | Tokyo Chemical Industry | B0725 | CUBIC-L, CUBIC-R+ |
| Nicotinamide | Tokyo Chemical Industry | N0078 | CUBIC-R+ |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | CUBIC-L, PBST |
| Silicon oil HIVAC-F4 | Shin-Etsu Chemical | 50449832 | Immersion oil |
| Sodium azide | Wako | 195-11092 | Staining buffer |
References
- Velez-Fort, M., et al. The stimulus selectivity and connectivity of layer six principal cells reveals cortical microcircuits underlying visual processing. Neuron. 83 (6), 1431-1443 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Tainaka, K., et al. Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Hasegawa, S., et al. Comprehensive three-dimensional analysis (CUBIC-kidney) visualizes abnormal renal sympathetic nerves after ischemia/reperfusion injury. Kidney International. 96 (1), 129-138 (2019).
- Hasegawa, S., Inoue, T., Inagi, R. Neuroimmune interactions and kidney disease. Kidney Research and Clinical Practice. 38 (3), 282-294 (2019).
- Hasegawa, S., et al. The oral hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor enarodustat counteracts alterations in renal energy metabolism in the early stages of diabetic kidney disease. Kidney International. 97 (5), 934-950 (2020).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hasegawa, S., et al. Activation of sympathetic signaling in macrophages blocks systemic inflammation and protects against renal ischemia-reperfusion injury. Journal of the American Society of Nephrology. 32 (7), 1599-1615 (2021).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1-22 (2020).
