Summary
El presente protocolo describe un método de limpieza de tejidos y tinción inmunofluorescente de montaje completo para imágenes renales tridimensionales (3D). Esta técnica puede ofrecer perspectivas macroscópicas en patología renal, lo que lleva a nuevos descubrimientos biológicos.
Abstract
Aunque la patología convencional proporcionó numerosa información sobre la microestructura renal, fue difícil conocer la estructura precisa de los vasos sanguíneos, los túbulos proximales, los conductos colectores, los glomérulos y los nervios simpáticos en el riñón debido a la falta de información tridimensional (3D). El despeje óptico es una buena estrategia para superar este gran obstáculo. Se pueden analizar múltiples células en un órgano completo a una resolución de una sola célula combinando la limpieza de tejidos y la técnica de imágenes 3D. Sin embargo, los métodos de etiquetado celular para imágenes de órganos completos siguen estando poco desarrollados. En particular, la tinción de órganos de montaje completo es un desafío debido a la dificultad en la penetración de anticuerpos. El presente protocolo desarrolló una tinción renal de ratón de montaje completo para imágenes 3D con el método de limpieza de tejidos CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis). El protocolo ha permitido visualizar la denervación simpática renal tras lesión por isquemia-reperfusión y glomerulomegalia en el estadio precoz de la enfermedad renal diabética desde un punto de vista integral. Por lo tanto, esta técnica puede conducir a nuevos descubrimientos en la investigación renal al proporcionar una perspectiva macroscópica.
Introduction
El riñón está compuesto por varias poblaciones celulares. Aunque la patología convencional nos da mucha información sobre el microambiente renal, se necesitan imágenes tridimensionales (3D) para comprender con precisión la diafonía intercelular durante la progresión de la enfermedad renal. En el pasado, era necesario realizar una gran cantidad de seccionamiento en serie y reconstrucción de imágenes para las imágenes 3D de órgano completo1. Sin embargo, este método requería demasiado esfuerzo y tenía problemas en términos de reproducibilidad.
El clearing óptico es una buena estrategia para superar este obstáculo 2,3. La opacidad tisular se debe principalmente a la dispersión y absorción de la luz porque cada órgano consta de varias sustancias, incluyendo agua, proteínas y lípidos. Por lo tanto, la estrategia básica de limpieza de tejidos es reemplazar el agua y los lípidos en los tejidos con reactivos que coinciden con el índice de refracción (IR) que tienen las mismas propiedades ópticas que las proteínas4. Para observar una muestra transparente, una microscopía fluorescente de lámina de luz es útil5. Las láminas de luz iluminan la muestra transparente desde el lado, y las señales de excitación se adquieren a través de la lente del objetivo ubicada en posición vertical6. Esta microscopía obtiene información de sección transversal en un solo barrido, que es diferente de la microscopía fluorescente confocal o multifotónica. Por lo tanto, puede adquirir rápidamente imágenes z-stack con un bajo nivel de fotoblanqueo.
Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) es uno de los métodos de limpieza de tejidos que permite obtener imágenes de órganos completos mediante microscopía fluorescente de lámina de luz 2,7,8. La tinción inmunofluorescente cúbica y de montaje completo se optimiza en el presente estudio para visualizar estructuras 3D de riñón de ratón 9,10,11. Utilizando este método de tinción de montaje completo, la alteración de los nervios simpáticos renales se visualiza después de la lesión por isquemia-reperfusión 9,10 y glomerulomegalia en la etapa temprana de la enfermedad renal diabética 11, así como los vasos sanguíneos, los túbulos proximales y los conductos colectores en un riñón completo9.
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Protocol
Todos los experimentos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Tokio. Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las pautas de los Institutos Nacionales de Salud. Para el presente estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6NJcl, de 8 semanas de edad. Los ratones se obtuvieron de fuentes comerciales (ver Tabla de materiales).
1. Preparación animal y fijación renal
- Realice la fijación de perfusión siguiendo los pasos a continuación.
- Anestesiar al ratón por inhalación de isoflurano (3%, 2,0 L/min) y administración intraperitoneal de clorhidrato de medetomidina (0,3 mg/kg), tartrato de butorfanol (5 mg/kg) y midazolam (4 mg/kg) (ver Tabla de materiales).
- Perfundir al animal con 20 mL de PBS (pH 7.4) y 30 mL de PFA al 4% en tampón fosfato (PB) a través del ventrículo izquierdo del corazón12.
- Realizar la fijación por inmersión justo después de la fijación de perfusión y muestreo renal9.
- Sumerja el riñón en PFA al 4% a 4 °C durante 16 h adicionales, luego lávelo con PBS durante 2 h (tres veces)9 (Figura 1).
PRECAUCIÓN: El formaldehído y el paraformaldehído son irritantes tóxicos. Manipule los reactivos en una campana extractora con el equipo de protección personal adecuado.
- Sumerja el riñón en PFA al 4% a 4 °C durante 16 h adicionales, luego lávelo con PBS durante 2 h (tres veces)9 (Figura 1).
2. Decoloración y deslipidación
- Preparar CUBIC-L para la decoloración y la delipidación que consiste en 10% en peso de Tritón X-100 y 10% en peso de N-butildietanolamina (ver Tabla de Materiales), siguiendo informes publicados previamente 4,8,9.
- Realice la decoloración y la delipidación por CUBIC-L siguiendo los pasos a continuación.
- Sumerja el riñón fijo en 7 ml de CUBIC-L al 50% (v/v) (mezcla 1:1 de agua y CUBIC-L) en un tubo inferior redondo de 14 ml (consulte la Tabla de materiales) con agitación suave a temperatura ambiente durante 6 h (Figura 2A). Luego, sumérjalo en 7 ml de CUBIC-L en un tubo de fondo redondo de 14 ml con agitación suave a 37 °C durante 5 días.
- Actualice CUBIC-L todos los días durante este proceso. Después del proceso de decoloración y deslipidación, lavar el riñón con PBS a temperatura ambiente durante 2 h (tres veces)9 (Figura 1). Utilice una cuchara dispensadora para manipular muestras (Figura 2B).
3. Tinción inmunofluorescente de montaje completo
- Prepare los tampones de tinción.
- Prepare el tampón de tinción para anticuerpos primarios mezclando Triton X-100 al 0,5% (v/v), caseína al 0,5% en PBS y azida sódica9 al 0,05%.
- Prepare el tampón de tinción para anticuerpos secundarios mezclando Triton X-100 al 0,5% (v/v), caseína al 0,1% en PBS y azida sódica9 al 0,05%.
- Realizar tinción con anticuerpos primarios.
- Inmunotinción del riñón deslipinado con anticuerpos primarios (1:100 o 1:200, ver Tabla de materiales) en el tampón de tinción a 37 °C con agitación suave durante 7 días.
NOTA: La cantidad de tampón de tinción necesaria para un riñón es de 500-600 μL (Figura 2C). - Lave el riñón con Triton X-100 al 0,5% (v/v) en PBS (PBST) a temperatura ambiente durante 1 día9 (Figura 1).
- Inmunotinción del riñón deslipinado con anticuerpos primarios (1:100 o 1:200, ver Tabla de materiales) en el tampón de tinción a 37 °C con agitación suave durante 7 días.
- Realizar tinción con anticuerpos secundarios.
- Inmunoteñir el riñón con anticuerpos secundarios (1:100 o 1:200, ver Tabla de materiales) en el tampón de tinción a 37 °C con agitación suave durante 7 días. Lave el riñón con PBST a temperatura ambiente durante 1 día9 (Figura 1).
- Después de la fijación9, sumergir el riñón en formaldehído al 1% en PB (mezcla 1:36 de formaldehído al 37% y PB) durante 3 h, y lavarlo con PBS a temperatura ambiente durante 6 h (Figura 1).
4. Coincidencia del índice de refracción (IR)
- Prepare CUBIC-R+.
- Prepare CUBIC-R mezclando 45 % en peso de 2,3-dimetil-1-fenil-5-pirazolona/antipirina y 30 % en peso de nicotinamida (ver Tabla de materiales).
- Preparar CUBIC-R+ para la correspondencia del índice de refracción (IR) agregando 0,5 v% de N-butildietanolamina a CUBIC-R siguiendo los informes publicados anteriormente 4,8,9.
- Realice la coincidencia de RI.
- Sumerja el riñón en 7 ml de CUBIC-R+ al 50% (v/v) (mezcla 1:1 de agua y CUBIC-R+) en un tubo inferior redondo de 14 ml con agitación suave a temperatura ambiente durante 1 día. Luego, sumérjalo en 7 ml de CUBIC-R+ en un tubo de fondo redondo de 14 ml con agitación suave a temperatura ambiente durante 2 días9 (Figura 1).
NOTA: Aunque el riñón flota en 50% CUBIC-R+ al comienzo de la coincidencia RI, se hunde y se vuelve transparente en CUBIC-R+ al final del proceso (Figura 2D).
- Sumerja el riñón en 7 ml de CUBIC-R+ al 50% (v/v) (mezcla 1:1 de agua y CUBIC-R+) en un tubo inferior redondo de 14 ml con agitación suave a temperatura ambiente durante 1 día. Luego, sumérjalo en 7 ml de CUBIC-R+ en un tubo de fondo redondo de 14 ml con agitación suave a temperatura ambiente durante 2 días9 (Figura 1).
5. Adquisición y reconstrucción de imágenes
- Sumerja el riñón emparejado con RI en una mezcla de aceite de silicio (RI = 1.555) y aceite mineral (RI = 1.467) (55:45) durante la adquisición de imágenes (RI = 1.51)5 (Figura 3).
- Adquiera imágenes en 3D de todo el riñón con un microscopio fluorescente de9 hojas de luz personalizado (consulte la Tabla de materiales). Recopile todos los datos de imagen sin procesar en un formato TIFF de 16 bits. Visualice y capture las imágenes renderizadas en 3D con el software de análisis de imágenes (Imaris, consulte Tabla de materiales).
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Representative Results
Utilizando este método de tinción, se visualizaron nervios simpáticos [anticuerpo antitirosina hidroxilasa (TH)] y arterias [anticuerpo anti-α-actina músculo liso (αSMA)] en un riñón entero (Figura 4A, B y Video 1)9. También se visualizaron nervios simpáticos renales anormales después de la lesión por isquemia/reperfusión (IRI)9,10 (Figura 4C). Además, la visualización de los nervios simpáticos en todo el bazo13 se logró utilizando este protocolo (Figura 4D). Un ejemplo de cuantificación de los datos inmunofluorescentes 3D se muestra en la Figura 5.
Además, la visualización de los conductos colectores [anticuerpo antiacuaporina 2 (AQP2)], el segmento S1 de los túbulos proximales [anticuerpo anti-cotransportador de glucosa sódica 2 (SGLT2)] y los glomérulos (anticuerpo anti-podocina) en un riñón completo9 fue exitosa (Figura 6A). Utilizando esta imagen 3D de glomérulos, la glomerulomegalia (anticuerpo anti-podocina) fue visualizada en las primeras etapas de la enfermedad renal diabética, que fue suprimida por la administración de fármacos11 (Figura 6B).
Figura 1: Limpieza de tejidos y tinción inmunofluorescente de montaje completo. La limpieza de tejidos mediante CUBIC es un proceso de dos pasos: deslipidación (CUBIC-L) y coincidencia del índice de refracción (RI) (CUBIC-R+). La tinción de montaje completo se realiza después del proceso de deslipidación. Barra de escala = 10 mm. La imagen es una reproducción de Hasegawa et al.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes del proceso de manipulación . (A) La muestra se sumerge en 7 ml de 50% o 100% CUBIC-L en un tubo de fondo redondo de 14 ml. El tubo se mantiene horizontal con agitación suave durante el proceso de deslipidación. (B) Se utiliza una cuchara dispensadora para la manipulación de muestras. (C) La cantidad de tampón de tinción necesaria para un riñón es de 500-600 μL. El tubo se mantiene vertical durante el proceso de tinción. (D) Aunque la muestra flota en 50% CUBIC-R+ al comienzo de la correspondencia RI, se hunde y se vuelve transparente en CUBIC-R+ al final del proceso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Microscopía fluorescente de hoja de luz para imágenes 3D de riñón completo. La microscopía fluorescente de lámina de luz (LSFM) permite obtener imágenes tridimensionales (3D) de muestras transparentes. Esta imagen es una reproducción de Hasegawa et al.9. El aceite de inmersión se utiliza durante la adquisición de datos. Las hojas de luz de ambos lados iluminan la muestra. Las señales de excitación se adquieren a través de la lente del objetivo ubicada en posición vertical. El escenario se mueve en la dirección axial, y se obtienen imágenes z-stack. Barra de escala = 10 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Imágenes tridimensionales de riñón entero de nervios y arterias simpáticas. (A) Los nervios simpáticos [anticuerpo anti-tirosina hidroxilasa (TH), verde] y las arterias [anticuerpo anti-α-actina del músculo liso (αSMA), magenta] se visualizan en todo un riñón. (B) Se muestra la imagen ampliada del plano x-y de (A) [anticuerpo anti-TH, verde; anticuerpo anti-αSMA, magenta]. (C) Se visualiza la denervación persistente después de la lesión por isquemia-reperfusión renal (IRI). (D) Los nervios simpáticos en un bazo también se visualizan en todo un bazo por el protocolo actual. Esta imagen es una reproducción de Hasegawa et al.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Cuantificación de la tinción inmunofluorescente tridimensional. Se muestra el proceso de cuantificación de la relación entre el volumen positivo de señal y el volumen total del riñón. La conversión binaria se realiza de acuerdo con cada umbral. Los volúmenes se obtienen calculando la integral del área de interés (tamaño del vóxel: x = 6,45 μm, y = 6,45 μm, z = 7 μm). La imagen es una reproducción de Hasegawa et al.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Imágenes tridimensionales de todo el riñón de conductos colectores, túbulos proximales y glomérulos. (A) Los conductos colectores [anticuerpo antiacuaporina 2 (AQP2)], el segmento S1 de los túbulos proximales [anticuerpo anti-cotransportador de glucosa sódica 2 (SGLT2)] y los glomérulos (anticuerpo anti-podocina) se visualizan respectivamente en un riñón completo. La imagen es una reproducción de Hasegawa et al.9. (B) La glomerulomegalia se observa en la etapa temprana de la enfermedad renal diabética (anticuerpo anti-podocina), que se suprime mediante la administración de fármacos. La imagen es una reproducción de Hasegawa et al.11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video 1: Película giratoria del riñón. Se muestra la película giratoria del riñón en la Figura 4A . Se visualizan los nervios simpáticos [anticuerpo anti-tirosina hidroxilasa (TH), verde] y las arterias [anticuerpo anti-α-actina del músculo liso (αSMA), magenta]. Haga clic aquí para descargar este video.
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Discussion
El presente protocolo permitió obtener imágenes 3D de todo el riñón de varias estructuras, como nervios simpáticos, conductos colectores, arterias, túbulos proximales y glomérulos 9,10,11. Este método de tinción ofreció observación macroscópica y condujo a nuevos descubrimientos biológicos, al visualizar la alteración en los nervios simpáticos renales después de la lesión por isquemia-reperfusión 9,10 y glomerulomegalia en la etapa inicial de la enfermedad renal diabética 11.
La opacidad se deriva de la falta de homogeneidad óptica en un tejido5. El principio común de varios métodos de limpieza de tejidos es eliminar los dispersores / absorbentes de luz y llenar el espacio con reactivos que corresponden a RI. En comparación con los métodos orgánicos basados en disolventes, como las imágenes 3D de órganos eliminados con disolvente (3DISCO/iDISCO)3,14, CUBIC se basa en reactivos hidrófilos y, por lo tanto, es superior en la preservación fluorescente5. Esta característica de CUBIC permite a los investigadores observar señales fluorescentes de cepas de ratones reporteros2, así como señales de tinción inmunofluorescente de montaje completo, proporcionando más opciones para una comprensión integral de las estructuras de órganos 3D.
El presente protocolo de limpieza de tejidos basado en CUBIC puede lograr una alta transparencia para las imágenes 3D en comparación con la investigación previa de limpieza de riñón de ratón15. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que este protocolo de limpieza es adecuado para los riñones de ratón. Se necesita un proceso de deslipidación más fuerte para limpiar los riñones humanos. Por ejemplo, Zhao et al. presentaron recientemente un enfoque para el mapeo de órganos humanos intactos mediante el desarrollo del método eficiente de limpieza de tejidos llamado SHANEL (small-micelle-mediated human organ efficient clearing and labeling)16. Como una deslipidación más fuerte daña las muestras, los investigadores deben elegir un método apropiado de limpieza de tejidos de acuerdo con su propósito.
La tinción de órganos de montaje completo es un desafío debido a la dificultad en la penetración de anticuerpos; El presente Protocolo se ha establecido después de prueba y error. Como se prioriza la estabilidad de la tinción, el tiempo de incubación puede ser más largo que el mínimo requerido. Como resultado, este protocolo ha demostrado una tinción de montaje completo de alta calidad de los riñones por los anticuerpos. Sin embargo, existe la posibilidad de que no funcione bien, dependiendo de los antígenos objetivo que no hayamos probado. Un estudio reciente ha demostrado que la tinción en dos pasos con anticuerpos primarios y secundarios como el protocolo actual no es óptima en algunos casos para la tinción de montaje completo de cerebros de ratones17. Esto se debe a que cuando la cantidad objetivo es grande, su anticuerpo primario llena la muestra, lo que dificulta que el anticuerpo secundario penetre profundamente en el tejido17. Por lo tanto, vale la pena probar el anticuerpo primario marcado con fluorescencia, o el complejo del anticuerpo primario y el fragmento Fabsecundario 17, si la penetración de anticuerpos no es eficiente.
En cuanto al proceso de imagen, los investigadores deben elegir un tipo apropiado de microscopía y resolución de imagen de acuerdo con su propósito. Si los investigadores desean realizar imágenes 3D de riñón completo como se presenta en este estudio, es mejor usar microscopía fluorescente de hoja de luz porque puede adquirir rápidamente imágenes amplias de pila z con un bajo nivel de fotoblanqueo. Como el tamaño del archivo de los datos de imágenes 3D es enorme, la resolución de la imagen debe reducirse en la medida en que las imágenes de todo el órgano puedan soportar. Por el contrario, los investigadores también pueden usar microscopías confocales o multifotónicas al obtener datos de imágenes 3D con alta resolución en espacios estrechos.
En conclusión, el estudio actual ha desarrollado la tinción renal de montaje completo para imágenes 3D con el método de limpieza de tejidos CUBIC. El protocolo permite la visualización de estructuras 3D en un riñón completo, proporcionando una perspectiva macroscópica para la investigación renal.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Parte de este trabajo se llevó a cabo a través de la colaboración con el Prof. Hiroki R. Ueda (Universidad de Tokio), el Prof. Etsuo A. Susaki (Universidad de Juntendo), el Prof. Tetsuhiro Tanaka (Universidad de Tohoku), el Prof. Masafumi Fukagawa, el Dr. Takehiko Wada y el Dr. Hirotaka Komaba (Universidad de Tokai).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube | Falcon | 352059 | Tissue clearing, staining, wash |
| 2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine | Tokyo Chemical Industry | D1876 | CUBIC-R+ |
| 37%-Formaldehyde Solution | Nacalai Tesque | 16223-55 | Post fixation |
| 4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Nacalai Tesque | 09154-85 | Kidney fixation |
| Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody | Invitrogen | A-21436 | Secondary antibody (1:100) |
| Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | A-31573 | Secondary antibody (1:200) |
| Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody | Abcam | ab199975 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-podocin antibody | Sigma-Aldrich | P0372 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody | Abcam | ab85626 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody | Abcam | ab113 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody | Abcam | ab5694 | Primary antibody (1:200) |
| Blocker Casein in PBS | Thermo Fisher Scientific | 37528 | Staining buffer |
| Butorphanol Tartrate | Meiji | 005526 | Anesthetic |
| C57BL/6NJcl | Nippon Bio-Supp.Center | N/A | Mouse strain |
| Imaris | Bitplane | N/A | Imaging analysis software |
| Macro-zoom microscope | OLYMPUS | MVX10 | The observation unit of the custom-built microscope |
| Medetomidine Hydrochloride | Kyoritsu-Seiyaku | 008656 | Anesthetic |
| Midazolam | SANDOZ | 27803229 | Anesthetic |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Immersion oil |
| N-buthyldiethanolamine | Tokyo Chemical Industry | B0725 | CUBIC-L, CUBIC-R+ |
| Nicotinamide | Tokyo Chemical Industry | N0078 | CUBIC-R+ |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | CUBIC-L, PBST |
| Silicon oil HIVAC-F4 | Shin-Etsu Chemical | 50449832 | Immersion oil |
| Sodium azide | Wako | 195-11092 | Staining buffer |
References
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