Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल तीन आयामी (3 डी) किडनी इमेजिंग के लिए एक ऊतक समाशोधन विधि और पूरे-माउंट इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधलापन का वर्णन करता है। यह तकनीक गुर्दे की विकृति में मैक्रोस्कोपिक दृष्टिकोण प्रदान कर सकती है, जिससे नई जैविक खोजें हो सकती हैं।
Abstract
यद्यपि पारंपरिक पैथोलॉजी ने गुर्दे के माइक्रोस्ट्रक्चर के बारे में कई जानकारी प्रदान की, लेकिन त्रि-आयामी (3 डी) जानकारी की कमी के कारण गुर्दे में रक्त वाहिकाओं, समीपस्थ नलिकाओं, एकत्र नलिकाओं, ग्लोमेरुली और सहानुभूति तंत्रिकाओं की सटीक संरचना को जानना मुश्किल था। ऑप्टिकल क्लियरिंग इस बड़ी बाधा को दूर करने के लिए एक अच्छी रणनीति है। ऊतक समाशोधन और 3 डी इमेजिंग तकनीक के संयोजन से एक पूरे अंग में कई कोशिकाओं का विश्लेषण एकल-कोशिका संकल्प पर किया जा सकता है। हालांकि, पूरे अंग इमेजिंग के लिए सेल लेबलिंग विधियां अविकसित बनी हुई हैं। विशेष रूप से, एंटीबॉडी प्रवेश में कठिनाई के कारण पूरे-माउंट अंग धुंधला करना चुनौतीपूर्ण है। वर्तमान प्रोटोकॉल ने क्यूबिक (क्लियर, अनऑब्स्ट्रक्टेड ब्रेन/बॉडी इमेजिंग कॉकटेल और कम्प्यूटेशनल एनालिसिस) टिशू क्लियरिंग मेथड के साथ 3डी इमेजिंग के लिए एक होल-माउंट माउस किडनी स्टेनिंग विकसित की है। प्रोटोकॉल ने एक व्यापक दृष्टिकोण से मधुमेह गुर्दे की बीमारी के शुरुआती चरण में इस्केमिया-रीपरफ्यूजन चोट और ग्लोमेरुलोमेगाली के बाद गुर्दे की सहानुभूति को देखने में सक्षम बनाया है। इस प्रकार, यह तकनीक मैक्रोस्कोपिक परिप्रेक्ष्य प्रदान करके गुर्दे के अनुसंधान में नई खोजों का नेतृत्व कर सकती है।
Introduction
गुर्दे विभिन्न कोशिका आबादी से बना है। यद्यपि पारंपरिक पैथोलॉजी हमें गुर्दे के माइक्रोएन्वायरमेंट के बारे में बहुत जानकारी देती है, गुर्दे की बीमारी की प्रगति के दौरान अंतरकोशिकीय क्रॉसस्टॉक को ठीक से समझने के लिए त्रि-आयामी (3 डी) इमेजिंग की आवश्यकता होती है। अतीत में, पूरे अंग 3 डी इमेजिंग1 के लिए बड़ी संख्या में सीरियल सेक्शनिंग और छवि पुनर्निर्माण करने की आवश्यकता थी। हालांकि, इस विधि को बहुत अधिक प्रयास की आवश्यकता थी और प्रजनन क्षमता के मामले में समस्याएं थीं।
ऑप्टिकल क्लियरिंग इस बाधा 2,3 को दूर करने के लिए एक अच्छी रणनीति है। ऊतक अस्पष्टता मुख्य रूप से प्रकाश प्रकीर्णन और अवशोषण के कारण होती है क्योंकि प्रत्येक अंग में पानी, प्रोटीन और लिपिड सहित विभिन्न पदार्थ होते हैं। इस प्रकार, ऊतक समाशोधन की मूल रणनीति अपवर्तक सूचकांक (आरआई) मिलान अभिकर्मकों के साथ ऊतकों में पानी और लिपिड को प्रतिस्थापित कर रही है जिसमें प्रोटीन4 के समान ऑप्टिकल गुण होते हैं। एक पारदर्शी नमूना का निरीक्षण करने के लिए, एक प्रकाश शीट फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी उपयोगी है। प्रकाश शीट साइड से पारदर्शी नमूने को रोशन करती हैं, और उत्तेजना संकेतों को ऊर्ध्वाधर स्थिति 6 में स्थित उद्देश्य लेंस के माध्यम से प्राप्त किया जाताहै। यह माइक्रोस्कोपी एक एकल स्वीप में क्रॉस-सेक्शन जानकारी प्राप्त करती है, जो कॉन्फोकल या मल्टीफोटॉन फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी से अलग है। इस प्रकार, यह फोटोब्लीचिंग के निम्न स्तर के साथ जेड-स्टैक छवियों को जल्दी से प्राप्त कर सकता है।
बॉडी इमेजिंग कॉकटेल और कम्प्यूटेशनल एनालिसिस (क्यूबिक) ऊतक समाशोधन विधियों में से एक है जो प्रकाश शीट फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी 2,7,8 द्वारा पूरे अंग इमेजिंग को सक्षम बनाता है। माउस किडनी 3 डी संरचनाओं 9,10,11 की कल्पना करने के लिए वर्तमान अध्ययन में क्यूबिक और होल-माउंट इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग को अनुकूलित किया गया है। इस संपूर्ण-माउंट धुंधला विधि का उपयोग करके, मधुमेह गुर्देकी बीमारी 11 के शुरुआती चरण में इस्केमिया-रीपरफ्यूजन चोट 9,10 और ग्लोमेरुलोमेगाली के साथ-साथ रक्त वाहिकाओं, समीपस्थ नलिकाओं और पूरेगुर्दे में नलिकाओं को इकट्ठा करने के बाद गुर्दे की सहानुभूति तंत्रिकाओं में परिवर्तन की कल्पना की जाती है।
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Protocol
सभी प्रयोगों को टोक्यो संस्थागत समीक्षा बोर्ड विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था। सभी पशु प्रक्रियाओं को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था। 8 सप्ताह पुराने नर C57BL / 6NJcl चूहों का उपयोग वर्तमान अध्ययन के लिए किया गया था। चूहों को वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।
1. पशु तैयारी और गुर्दे निर्धारण
- नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए छिड़काव निर्धारण करें।
- आइसोफ्लुरेन (3%, 2.0 एल / मिनट) और मेडेटोमिडीन हाइड्रोक्लोराइड (0.3 मिलीग्राम / किग्रा), ब्यूटोरफेनोल टार्टरेट (5 मिलीग्राम / किग्रा), और मिडाज़ोलम (4 मिलीग्राम / किग्रा) के इंट्रापरिटोनियल प्रशासन के साँस लेने से माउस को एनेस्थेटाइज करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- दिल के बाएं वेंट्रिकल के माध्यम से फॉस्फेट बफर (पीबी) में 20 एमएल पीबीएस (पीएच 7.4) और 4% पीएफए के 30 एमएल के साथ जानवर को खिलाएं।
- छिड़काव निर्धारण और गुर्देके नमूने के ठीक बाद विसर्जन निर्धारण करें।
- अतिरिक्त 16 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पीएफए में गुर्दे को डुबोएं, फिर इसे 2 घंटे (तीन बार) 9 (चित्रा 1) के लिए पीबीएस के साथ धो लें।
चेतावनी: फॉर्मलाडेहाइड और पैराफॉर्मलडिहाइड विषाक्त परेशानियां हैं। उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण के साथ एक फ्यूम हुड में अभिकर्मकों को संभालें।
- अतिरिक्त 16 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पीएफए में गुर्दे को डुबोएं, फिर इसे 2 घंटे (तीन बार) 9 (चित्रा 1) के लिए पीबीएस के साथ धो लें।
2. रंग-परिवर्तन और विरूपण
- पहले प्रकाशित रिपोर्ट 4,8,9 के बाद ट्राइटन एक्स -100 के 10 डब्ल्यूटी% और एन-बुथाइल्डिथेनामाइन के 10 डब्ल्यूटी% (सामग्री की तालिका देखें) से युक्त डीकलराइजेशन और डिलिपिडेशन के लिए क्यूबिक-एल तैयार करें।
- नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए क्यूबिक-एल द्वारा डिकलराइजेशन और डिलिपिडेशन करें।
- 6 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर कोमल झटकों के साथ 14 एमएल गोल तल ट्यूब ( सामग्री की तालिका देखें) में 50% (v/v) CUBIC-L (पानी और CUBIC-L का 1: 1 मिश्रण) के 7 एमएल में स्थिर गुर्दे को डुबोएं (चित्र 2A)। फिर, इसे 5 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोमल झटकों के साथ 14 एमएल गोल तल ट्यूब में 7 एमएल क्यूबिक-एल में डुबोएं।
- इस प्रक्रिया के दौरान हर दिन क्यूबिक-एल को रिफ्रेश करें। डिकलराइजेशन और डिलिपिडेशन प्रक्रिया के बाद, कमरे के तापमान पर पीबीएस के साथ किडनी को 2 घंटे (तीन बार) 9 (चित्रा 1) के लिए धोएं। नमूना हैंडलिंग के लिए एक डिस्पेंसिंग चम्मच का उपयोग करें (चित्रा 2 बी)।
3. होल-माउंट इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधलापन
- धुंधला बफर तैयार करें।
- प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए धुंधला बफर तैयार करें, जिसमें पीबीएस में 0.5% (वी / वी) ट्राइटन एक्स -100, 0.5% कैसिइन और 0.05% सोडियम एज़ाइड 9 मिलायाजाए।
- 0.5% (v/v) ट्राइटन X-100, PBS में 0.1% कैसिइन और 0.05% सोडियम एज़ाइड9 को मिलाकर द्वितीयक एंटीबॉडी के लिए धुंधला बफर तैयार करें।
- प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ धुंधलापन करें।
- इम्यूनोस्टेन प्राथमिक एंटीबॉडी (1: 100 या 1: 200, सामग्री की तालिका देखें) के साथ डिलिपिडेटेड किडनी 37 डिग्री सेल्सियस पर धुंधला बफर में 7 दिनों के लिए कोमल झटकों के साथ।
नोट: एक गुर्दे के लिए आवश्यक धुंधला बफर की मात्रा 500-600 μL है (चित्रा 2 सी)। - 1 दिन9 के लिए कमरे के तापमान पर पीबीएस (पीबीएसटी) में 0.5% (वी / वी) ट्राइटन एक्स -100 के साथ किडनी धोएं (चित्रा 1)।
- इम्यूनोस्टेन प्राथमिक एंटीबॉडी (1: 100 या 1: 200, सामग्री की तालिका देखें) के साथ डिलिपिडेटेड किडनी 37 डिग्री सेल्सियस पर धुंधला बफर में 7 दिनों के लिए कोमल झटकों के साथ।
- द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ धुंधलापन करें।
- द्वितीयक एंटीबॉडी (1: 100 या 1: 200, सामग्री की तालिका देखें) के साथ इम्यूनोस्टेन किडनी 37 डिग्री सेल्सियस पर धुंधला बफर में 7 दिनों के लिए कोमल झटकों के साथ। 1 दिन9 के लिए कमरे के तापमान पर पीबीएसटी के साथ किडनी धोएं (चित्रा 1)।
- निर्धारण9 के बाद, गुर्दे को पीबी में 1% फॉर्मलाडेहाइड में डुबोएं (37% फॉर्मलाडेहाइड और पीबी का 1: 36 मिश्रण) 3 घंटे के लिए, और इसे 6 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर पीबीएस के साथ धो लें (चित्रा 1)।
4. अपवर्तक सूचकांक (आरआई) मिलान
- क्यूबिक-आर + तैयार करें।
- 2,3-डाइमिथाइल-1-फिनाइल-5-पाइराज़ोलोन/एंटीपाइरिन के 45 डब्ल्यूटी% और निकोटिनामाइड के 30 डब्ल्यूटी% को मिलाकर क्यूबिक-आर तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- पहले प्रकाशित रिपोर्ट 4,8,9 के बाद एन-बुथाइल्डीथेनामाइन के 0.5 वी% को क्यूबिक-आर में जोड़कर अपवर्तक सूचकांक (आरआई) मिलान के लिए क्यूबिक-आर + तैयार करें।
- आरआई मिलान करें।
- गुर्दे को 1 दिन के लिए कमरे के तापमान पर कोमल झटकों के साथ 14 एमएल गोल तल ट्यूब में 50% (v/v) CUBIC-R + (पानी और CUBIC-R+का 1: 1 मिश्रण) के 7 एमएल में डुबोएं। फिर, इसे2 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर कोमल झटकों के साथ 14 एमएल गोल तल ट्यूब में 7 एमएल क्यूबिक-आर + में डुबोएं (चित्रा 1)।
नोट: यद्यपि किडनी आरआई मिलान की शुरुआत में 50% क्यूबिक-आर + में तैरती है, यह प्रक्रिया के अंत में क्यूबिक-आर + में डूब जाती है और पारदर्शी हो जाती है (चित्रा 2 डी)।
- गुर्दे को 1 दिन के लिए कमरे के तापमान पर कोमल झटकों के साथ 14 एमएल गोल तल ट्यूब में 50% (v/v) CUBIC-R + (पानी और CUBIC-R+का 1: 1 मिश्रण) के 7 एमएल में डुबोएं। फिर, इसे2 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर कोमल झटकों के साथ 14 एमएल गोल तल ट्यूब में 7 एमएल क्यूबिक-आर + में डुबोएं (चित्रा 1)।
5. छवि अधिग्रहण और पुनर्निर्माण
- छवि अधिग्रहण (आरआई = 1.51)5 (चित्रा 3) के दौरान सिलिकॉन तेल (आरआई = 1.555) और खनिज तेल (आरआई = 1.467) (55:45) के मिश्रण में आरआई-मिलान किडनी को डुबोएं।
- कस्टम-निर्मित9 लाइट-शीट फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ पूरे गुर्दे की 3 डी छवियां प्राप्त करें ( सामग्री की तालिका देखें)। 16-बिट TIFF प्रारूप में सभी कच्चे छवि डेटा एकत्र करें। इमेजिंग विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ 3 डी-रेंडर की गई छवियों को विज़ुअलाइज़ करें और कैप्चर करें (इमारिस, सामग्री की तालिका देखें)।
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Representative Results
इस धुंधला विधि का उपयोग करके, सहानुभूति तंत्रिकाओं [एंटी-टायरोसिन हाइड्रॉक्सिलेज (टीएच) एंटीबॉडी] और धमनियों [एंटी-α-चिकनी मांसपेशी एक्टिन (एसएसएमए) एंटीबॉडी] पूरे गुर्दे में (चित्रा 4 ए, बी और वीडियो 1) की कल्पना की गई थी। इस्किमिया/रीपरफ्यूजन चोट (आईआरआई) 9,10 (चित्रा 4 सी) के बाद असामान्य गुर्दे सहानुभूति तंत्रिकाओं की भी कल्पना की गई थी। इसके अलावा, पूरे प्लीहा13 में सहानुभूति तंत्रिकाओं की कल्पना करना इस प्रोटोकॉल (चित्रा 4 डी) का उपयोग करके हासिल किया गया था। 3 डी इम्यूनोफ्लोरोसेंट डेटा को निर्धारित करने का एक उदाहरण चित्रा 5 में दिखाया गया है।
इसके अलावा, पूरे गुर्दे9 में नलिकाओं [एंटी-एक्वापोरिन 2 (एक्यूपी 2) एंटीबॉडी], समीपस्थ नलिकाओं के एस 1 खंड [एंटी-सोडियम ग्लूकोज कोट्रांसपोर्टर 2 (एसजीएलटी 2) एंटीबॉडी], और ग्लोमेरुली (एंटी-पोडोसिन एंटीबॉडी) को इकट्ठा करने की कल्पना करना सफल रहा (चित्रा 6 ए)। ग्लोमेरुली की इस 3 डी इमेजिंग का उपयोग करते हुए, ग्लोमेरुलोमेगाली (एंटी-पोडोसिन एंटीबॉडी) को मधुमेह गुर्दे की बीमारी के शुरुआती चरणों में कल्पना की गई थी, जिसे दवा प्रशासन11 (चित्रा 6 बी) द्वारा दबा दिया गया था।
चित्रा 1: ऊतक समाशोधन और पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधलापन। क्यूबिक द्वारा ऊतक समाशोधन एक दो-चरणीय प्रक्रिया है: डिलिपिडेशन (क्यूबिक-एल) और अपवर्तक सूचकांक (आरआई) मिलान (क्यूबिक-आर +)। पूरी तरह से माउंट धुंधलापन डिलिपिडेशन प्रक्रिया के बाद किया जाता है। स्केल बार = 10 मिमी। छवि हासेगावा एट अल.9 से पुन: प्रस्तुत की गई है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2: हैंडलिंग प्रक्रिया की छवियां। (A) नमूना 14 एमएल गोल निचले ट्यूब में 50% या 100% क्यूबिक-एल के 7 एमएल में डूबा हुआ है। ट्यूब को डिलिपिडेशन प्रक्रिया के दौरान कोमल झटकों के साथ क्षैतिज रखा जाता है। (बी) नमूना हैंडलिंग के लिए एक डिस्पेंसिंग चम्मच का उपयोग किया जाता है। (सी) एक गुर्दे के लिए आवश्यक धुंधला बफर की मात्रा 500-600 μL है। धुंधला होने की प्रक्रिया के दौरान ट्यूब को ऊर्ध्वाधर रखा जाता है। (डी) यद्यपि नमूना आरआई मिलान की शुरुआत में 50% क्यूबिक-आर + में तैरता है, यह प्रक्रिया के अंत में क्यूबिक-आर + में डूब जाता है और पारदर्शी हो जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: पूरे गुर्दे 3 डी इमेजिंग के लिए लाइट शीट फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी। लाइट शीट फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी (एलएसएफएम) पारदर्शी नमूनों के त्रि-आयामी (3 डी) इमेजिंग को सक्षम बनाता है। यह छवि हासेगावा एट अल.9 से पुन: प्रस्तुत की गई है। डेटा अधिग्रहण के दौरान विसर्जन तेल का उपयोग किया जाता है। दोनों तरफ से हल्की चादरें नमूने को रोशन करती हैं। उत्तेजना संकेतों को ऊर्ध्वाधर स्थिति में स्थित उद्देश्य लेंस के माध्यम से प्राप्त किया जाता है। मंच अक्षीय दिशा में चलता है, और जेड-स्टैक छवियां प्राप्त की जाती हैं। स्केल बार = 10 मिमी . कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 4. सहानुभूति तंत्रिकाओं और धमनियों की पूरे गुर्दे की त्रि-आयामी इमेजिंग। (ए) सहानुभूति तंत्रिकाएं [एंटी-टायरोसिन हाइड्रॉक्सिलेज (टीएच) एंटीबॉडी, हरी] और धमनियां [एंटी-α-चिकनी मांसपेशी एक्टिन (एसएमए) एंटीबॉडी, मैजेंटा] पूरे गुर्दे में कल्पना की जाती हैं। (बी) (ए) की बढ़ी हुई एक्स-वाई प्लेन छवि को दिखाया गया है [एंटी-टीएच एंटीबॉडी, हरा; एंटी-जेएसएमए एंटीबॉडी, मैजेंटा]। (ग) वृक्क इस्किमिया-रीपरफ्यूजन चोट (आईआरआई) के बाद लगातार निर्जलीकरण की कल्पना की जाती है। (डी) एक तिल्ली में सहानुभूति तंत्रिकाओं को वर्तमान प्रोटोकॉल द्वारा एक पूरे प्लीहा में भी देखा जाता है। यह छवि हासेगावा एट अल.9 से पुन: प्रस्तुत की गई है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: त्रि-आयामी इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधलापन का परिमाणीकरण। कुल गुर्दे की मात्रा के लिए सिग्नल-पॉजिटिव वॉल्यूम के अनुपात को निर्धारित करने की प्रक्रिया दिखाई गई है। द्विआधारी रूपांतरण प्रत्येक सीमा के अनुसार किया जाता है। आयतन ब्याज के क्षेत्र के अभिन्न अंग की गणना करके प्राप्त किए जाते हैं (वोक्सेल आकार: x = 6.45 μm, y = 6.45 μm, z = 7 μm)। छवि हासेगावा एट अल.9 से पुन: प्रस्तुत की गई है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 6: नलिकाओं, समीपस्थ नलिकाओं और ग्लोमेरुली को इकट्ठा करने की पूरी किडनी त्रि-आयामी इमेजिंग। (ए) नलिकाओं [एंटी-एक्वापोरिन 2 (एक्यूपी 2) एंटीबॉडी], समीपस्थ नलिकाओं के एस 1 खंड [एंटी-सोडियम ग्लूकोज कोट्रांसपोर्टर 2 (एसजीएलटी 2) एंटीबॉडी], और ग्लोमेरुली (एंटी-पोडोसिन एंटीबॉडी) को क्रमशः पूरे गुर्दे में देखा जाता है। छवि हासेगावा एट अल.9 से पुन: प्रस्तुत की गई है। (बी) ग्लोमेरुलोमेगाली मधुमेह गुर्दे की बीमारी (एंटी-पोडोसिन एंटीबॉडी) के प्रारंभिक चरण में देखा जाता है, जिसे दवा प्रशासन द्वारा दबा दिया जाता है। छवि हासेगावा एट अल.11 से पुन: प्रस्तुत की गई है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
वीडियो 1: गुर्दे की घूर्णन फिल्म। चित्रा 4 ए में गुर्दे की घूर्णन फिल्म दिखाई गई है। सहानुभूति तंत्रिकाओं [एंटी-टायरोसिन हाइड्रॉक्सिलेज (टीएच) एंटीबॉडी, हरा] और धमनियों [एंटी-α-चिकनी मांसपेशी एक्टिन (एसएमए) एंटीबॉडी, मैजेंटा] की कल्पना की जाती है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
वर्तमान प्रोटोकॉल ने सहानुभूति तंत्रिकाओं, नलिकाओं, धमनियों, समीपस्थ नलिकाओं और ग्लोमेरुली 9,10,11 को इकट्ठा करने जैसी विभिन्न संरचनाओं की पूरी-गुर्दे 3 डी इमेजिंग की अनुमति दी। इस धुंधला विधि ने मैक्रोस्कोपिक अवलोकन की पेशकश की और मधुमेह गुर्दे की बीमारी 11 के प्रारंभिक चरण में इस्केमिया-रीपरफ्यूजन चोट 9,10 और ग्लोमेरुलोमेगाली के बाद गुर्दे की सहानुभूति तंत्रिकाओं में परिवर्तन की कल्पना करके नई जैविक खोजों का नेतृत्वकिया।
अस्पष्टता एक ऊतक5 में ऑप्टिकल असमानता से प्राप्त होती है। विभिन्न ऊतक समाशोधन विधियों का सामान्य सिद्धांत प्रकाश पदार्थों / अवशोषकों को हटाना और आरआई-मिलान अभिकर्मकों के साथ स्थान को पूरा करना है। कार्बनिक विलायक-आधारित विधियों जैसे विलायक-साफ़ अंगों की 3 डी इमेजिंग (3DISCO / iDISCO) 3,14 की तुलना में, क्यूबिक हाइड्रोफिलिक अभिकर्मकों पर आधारित है, और इस प्रकार फ्लोरोसेंट संरक्षण5 में बेहतर है। क्यूबिक की यह विशेषता शोधकर्ताओं को रिपोर्टर माउसउपभेदों 2 से फ्लोरोसेंट संकेतों के साथ-साथ पूरे-माउंट इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग से संकेतों का निरीक्षण करने की अनुमति देती है, जो 3 डी-अंग संरचनाओं की व्यापक समझ के लिए अधिक विकल्प प्रदान करती है।
वर्तमान क्यूबिक-आधारित ऊतक समाशोधन प्रोटोकॉल पिछले माउस किडनी क्लियरिंग रिसर्च 15 की तुलना में 3 डी इमेजिंग के लिए उच्च पारदर्शिता प्राप्त करसकता है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यह समाशोधन प्रोटोकॉल माउस गुर्दे के लिए उपयुक्त है। मानव गुर्दे को साफ करने के लिए एक मजबूत डिलिपिडेशन प्रक्रिया की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, झाओ एट अल ने हाल ही में शेनल (छोटे-मिसेल-मध्यस्थता वाले मानव अंग कुशल समाशोधन और लेबलिंग) नामक कुशल ऊतक समाशोधन विधि विकसित करके बरकरार मानव अंग मानचित्रण के लिए एक दृष्टिकोण प्रस्तुत किया। चूंकि मजबूत डिलिपिडेशन नमूनों को नुकसान पहुंचाता है, शोधकर्ताओं को अपने उद्देश्य के अनुसार एक उपयुक्त ऊतक समाशोधन विधि चुनने की आवश्यकता होती है।
एंटीबॉडी प्रवेश में कठिनाई के कारण पूरे-माउंट अंग धुंधला होना चुनौतीपूर्ण है; वर्तमान प्रोटोकॉल परीक्षण और त्रुटि के बाद स्थापित किया गया है। जैसा कि धुंधला होने की स्थिरता को प्राथमिकता दी जाती है, इनक्यूबेशन समय न्यूनतम आवश्यक से अधिक हो सकता है। नतीजतन, इस प्रोटोकॉल ने एंटीबॉडी द्वारा गुर्दे के उच्च गुणवत्ता वाले पूरे माउंट धुंधलापन का प्रदर्शन किया है। हालांकि, एक संभावना है कि यह अच्छी तरह से काम नहीं कर सकता है, लक्ष्य एंटीजन के आधार पर जिसे हमने कोशिश नहीं की है। हाल के एक अध्ययन से पता चला है कि वर्तमान प्रोटोकॉल जैसे प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग करके दो-चरण धुंधला होना कुछ मामलों में माउस दिमाग17 के पूरे माउंट धुंधला होने के लिए इष्टतम नहीं है। ऐसा इसलिए है क्योंकि जब लक्ष्य राशि बड़ी होती है, तो इसका प्राथमिक एंटीबॉडी नमूना भर देता है, जिससे द्वितीयक एंटीबॉडी के लिए ऊतक17 में गहराई से प्रवेश करना मुश्किल हो जाता है। इस प्रकार, फ्लोरोसेंट-लेबल प्राथमिक एंटीबॉडी, या प्राथमिक एंटीबॉडी और माध्यमिक फैब टुकड़े17 का परिसर, कोशिश करने लायक है यदि एंटीबॉडी का प्रवेश कुशल नहीं है।
इमेजिंग प्रक्रिया के लिए, शोधकर्ताओं को अपने उद्देश्य के अनुसार एक उपयुक्त प्रकार की माइक्रोस्कोपी और छवि संकल्प चुनने की आवश्यकता होती है। यदि शोधकर्ता इस अध्ययन में प्रस्तुत पूरे गुर्दे की 3 डी इमेजिंग का संचालन करना चाहते हैं, तो लाइट शीट फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना बेहतर है क्योंकि यह फोटोब्लीचिंग के निम्न स्तर के साथ व्यापक जेड-स्टैक छवियों को जल्दी से प्राप्त कर सकता है। चूंकि 3 डी इमेजिंग डेटा का फ़ाइल आकार बहुत बड़ा है, छवि रिज़ॉल्यूशन को उस हद तक कम किया जाना चाहिए कि पूरे अंग इमेजिंग खड़ी हो सकती है। इसके विपरीत, शोधकर्ता संकीर्ण स्थान में उच्च रिज़ॉल्यूशन के साथ 3 डी इमेजिंग डेटा प्राप्त करते समय कॉन्फोकल या मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी का भी उपयोग कर सकते हैं।
निष्कर्ष में, वर्तमान अध्ययन ने ऊतक समाशोधन विधि क्यूबिक के साथ 3 डी इमेजिंग के लिए पूरे-माउंट किडनी स्टेनिंग विकसित किया है। प्रोटोकॉल एक पूरे गुर्दे में 3 डी संरचनाओं के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है, गुर्दे के अनुसंधान के लिए एक मैक्रोस्कोपिक परिप्रेक्ष्य प्रदान करता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस कार्य का एक हिस्सा प्रोफेसर हिरोकी आर उएडा (टोक्यो विश्वविद्यालय), प्रोफेसर एटसुओ ए सुसाकी (जुनटेंडो विश्वविद्यालय), प्रोफेसर टेटसुहिरो तनाका (तोहोकू विश्वविद्यालय), प्रोफेसर मासाफुमी फुकागावा, डॉ ताकेहिको वाडा और डॉ हिरोताका कोमाबा (टोकाई विश्वविद्यालय) के सहयोग से आयोजित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube | Falcon | 352059 | Tissue clearing, staining, wash |
| 2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine | Tokyo Chemical Industry | D1876 | CUBIC-R+ |
| 37%-Formaldehyde Solution | Nacalai Tesque | 16223-55 | Post fixation |
| 4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Nacalai Tesque | 09154-85 | Kidney fixation |
| Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody | Invitrogen | A-21436 | Secondary antibody (1:100) |
| Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | A-31573 | Secondary antibody (1:200) |
| Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody | Abcam | ab199975 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-podocin antibody | Sigma-Aldrich | P0372 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody | Abcam | ab85626 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody | Abcam | ab113 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody | Abcam | ab5694 | Primary antibody (1:200) |
| Blocker Casein in PBS | Thermo Fisher Scientific | 37528 | Staining buffer |
| Butorphanol Tartrate | Meiji | 005526 | Anesthetic |
| C57BL/6NJcl | Nippon Bio-Supp.Center | N/A | Mouse strain |
| Imaris | Bitplane | N/A | Imaging analysis software |
| Macro-zoom microscope | OLYMPUS | MVX10 | The observation unit of the custom-built microscope |
| Medetomidine Hydrochloride | Kyoritsu-Seiyaku | 008656 | Anesthetic |
| Midazolam | SANDOZ | 27803229 | Anesthetic |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Immersion oil |
| N-buthyldiethanolamine | Tokyo Chemical Industry | B0725 | CUBIC-L, CUBIC-R+ |
| Nicotinamide | Tokyo Chemical Industry | N0078 | CUBIC-R+ |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | CUBIC-L, PBST |
| Silicon oil HIVAC-F4 | Shin-Etsu Chemical | 50449832 | Immersion oil |
| Sodium azide | Wako | 195-11092 | Staining buffer |
References
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