Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Gewebereinigungsmethode und eine Whole-Mount-Immunfluoreszenzfärbung für die dreidimensionale (3D) Nierenbildgebung. Diese Technik kann makroskopische Perspektiven in der Nierenpathologie bieten, was zu neuen biologischen Entdeckungen führt.
Abstract
Obwohl die konventionelle Pathologie zahlreiche Informationen über die Nierenmikrostruktur lieferte, war es aufgrund des Mangels an dreidimensionalen (3D) Informationen schwierig, die genaue Struktur von Blutgefäßen, proximalen Tubuli, Sammelkanälen, Glomeruli und sympathischen Nerven in der Niere zu kennen. Optisches Clearing ist eine gute Strategie, um diese große Hürde zu überwinden. Mehrere Zellen in einem ganzen Organ können mit Einzelzellauflösung analysiert werden, indem Gewebereinigung und 3D-Bildgebungstechnik kombiniert werden. Zellmarkierungsmethoden für die Bildgebung ganzer Organe sind jedoch noch unterentwickelt. Insbesondere die Färbung ganzer Organe ist aufgrund der Schwierigkeit der Antikörperpenetration eine Herausforderung. Das vorliegende Protokoll entwickelte eine vollständige Mausnierenfärbung für die 3D-Bildgebung mit der CUBIC-Methode (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis) zur Gewebereinigung. Das Protokoll hat es ermöglicht, die renale sympathische Denervierung nach Ischämie-Reperfusionsverletzung und Glomerulomegalie im Frühstadium der diabetischen Nierenerkrankung aus einem umfassenden Blickwinkel zu visualisieren. So kann diese Technik zu neuen Entdeckungen in der Nierenforschung führen, indem sie eine makroskopische Perspektive bietet.
Introduction
Die Niere besteht aus verschiedenen Zellpopulationen. Obwohl die konventionelle Pathologie uns viele Informationen über die Nierenmikroumgebung liefert, ist eine dreidimensionale (3D) Bildgebung erforderlich, um das interzelluläre Übersprechen während des Fortschreitens der Nierenerkrankung genau zu verstehen. In der Vergangenheit musste eine Vielzahl von seriellen Schnitten und Bildrekonstruktionen für die 3D-Bildgebung des gesamten Organsdurchgeführt werden 1. Diese Methode erforderte jedoch zu viel Aufwand und hatte Probleme in Bezug auf die Reproduzierbarkeit.
Optisches Löschen ist eine gute Strategie, um diese Hürde zu überwinden 2,3. Die Trübung des Gewebes ist hauptsächlich auf Lichtstreuung und -absorption zurückzuführen, da jedes Organ aus verschiedenen Substanzen besteht, darunter Wasser, Protein und Lipide. Daher besteht die grundlegende Strategie der Gewebereinigung darin, Wasser und Lipide in Geweben durch Reagenzien mit Brechungsindex (RI) zu ersetzen, die die gleichen optischen Eigenschaften wie Proteine haben4. Um eine transparente Probe zu beobachten, ist eine Leuchtblatt-Fluoreszenzmikroskopie sinnvoll5. Lichtblätter beleuchten die transparente Probe von der Seite, und Anregungssignale werden durch die Objektivlinse erfasst, die sich in vertikaler Positionbefindet 6. Diese Mikroskopie erhält Querschnittsinformationen in einem einzigen Sweep, die sich von der konfokalen oder Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie unterscheidet. So kann es schnell Z-Stack-Bilder mit einem geringen Maß an Photobleiche aufnehmen.
Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) ist eine der Gewebereinigungsmethoden, die eine Ganzorganbildgebung mittels Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie 2,7,8 ermöglicht. CUBIC und die Whole-Mount-Immunfluoreszenzfärbung werden in der vorliegenden Studie optimiert, um 3D-Strukturen der Mausnierezu visualisieren 9,10,11. Mit dieser Whole-Mount-Färbemethode wird die Veränderung der Nierensympathikusnerven nach Ischämie-Reperfusionsverletzung 9,10 und Glomerulomegalie im Frühstadium der diabetischen Nierenerkrankung 11 sowie Blutgefäßen, proximalen Tubuli und Sammelkanälen in einerganzen Niere 9 visualisiert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Experimente wurden vom University of Tokyo Institutional Review Board genehmigt. Alle Tierverfahren wurden gemäß den Richtlinien der National Institutes of Health durchgeführt. Männliche C57BL/6NJcl-Mäuse, 8 Wochen alt, wurden für die vorliegende Studie verwendet. Die Mäuse wurden aus kommerziellen Quellen gewonnen (siehe Materialtabelle).
1. Tierpräparation und Nierenfixierung
- Führen Sie eine Perfusionsfixierung durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Betäuben Sie die Maus durch Inhalation von Isofluran (3%, 2,0 l/min) und intraperitonealer Verabreichung von Medetomidinhydrochlorid (0,3 mg/kg), Butorphanoltartrat (5 mg/kg) und Midazolam (4 mg/kg) (siehe Materialtabelle).
- Perfusion des Tieres mit 20 ml PBS (pH 7,4) und 30 ml 4% PFA in Phosphatpuffer (PB) durch den linken Ventrikel des Herzens12.
- Führen Sie die Immersionsfixierung unmittelbar nach der Perfusionsfixierung und Nierenprobenahme durch9.
- Tauchen Sie die Niere für weitere 16 Stunden in 4 % PFA bei 4 °C und waschen Sie sie dann 2 h lang (dreimal)9 mit PBS (Abbildung 1).
ACHTUNG: Formaldehyd und Paraformaldehyd sind toxische Reizstoffe. Behandeln Sie Reagenzien in einem Abzug mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung.
- Tauchen Sie die Niere für weitere 16 Stunden in 4 % PFA bei 4 °C und waschen Sie sie dann 2 h lang (dreimal)9 mit PBS (Abbildung 1).
2. Entfärbung und Delipidierung
- Bereiten Sie CUBIC-L zur Entfärbung und Delipidierung vor, das aus 10 Gew.-% Triton X-100 und 10 Gew.-% N-Buthyldiethanolamin besteht (siehe Tabelle der Materialien), gemäß den zuvor veröffentlichten Berichten 4,8,9.
- Führen Sie die Entfärbung und Delipidierung mit CUBIC-L durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Tauchen Sie die festsitzende Niere in 7 ml 50% (v/v) CUBIC-L (1:1 Mischung aus Wasser und CUBIC-L) in ein 14 ml rundes Bodenrohr (siehe Materialtabelle) unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur für 6 h (Abbildung 2A). Dann tauchen Sie es in 7 mL CUBIC-L in ein 14 mL rundes Bodenrohr mit leichtem Schütteln bei 37 ° C für 5 Tage.
- Aktualisieren Sie CUBIC-L jeden Tag während dieses Vorgangs. Nach dem Entfärbungs- und Delipidierungsprozess waschen Sie die Niere mit PBS bei Raumtemperatur für 2 h (dreimal)9 (Abbildung 1). Verwenden Sie einen Dosierlöffel für die Probenhandhabung (Abbildung 2B).
3. Ganzmontage Immunfluoreszenzfärbung
- Bereiten Sie die Färbepuffer vor.
- Bereiten Sie den Färbepuffer für primäre Antikörper vor, indem Sie 0,5% (v/v) Triton X-100, 0,5% Casein in PBS und 0,05% Natriumazid9 mischen.
- Bereiten Sie den Färbepuffer für sekundäre Antikörper vor, indem Sie 0,5% (v/v) Triton X-100, 0,1% Casein in PBS und 0,05% Natriumazid9 mischen.
- Führen Sie eine Färbung mit primären Antikörpern durch.
- Immunfärben Sie die delipidierte Niere mit primären Antikörpern (1:100 oder 1:200, siehe Materialtabelle) im Färbepuffer bei 37 °C unter leichtem Schütteln für 7 Tage.
HINWEIS: Die Menge des Färbepuffers, die für eine Niere benötigt wird, beträgt 500-600 μL (Abbildung 2C). - Waschen Sie die Niere mit 0,5 % (v/v) Triton X-100 in PBS (PBST) bei Raumtemperatur für 1 Tag9 (Abbildung 1).
- Immunfärben Sie die delipidierte Niere mit primären Antikörpern (1:100 oder 1:200, siehe Materialtabelle) im Färbepuffer bei 37 °C unter leichtem Schütteln für 7 Tage.
- Führen Sie eine Färbung mit sekundären Antikörpern durch.
- Immunfärben Sie die Niere mit sekundären Antikörpern (1:100 oder 1:200, siehe Materialtabelle) im Färbepuffer bei 37 °C mit leichtem Schütteln für 7 Tage. Waschen Sie die Niere mit PBST bei Raumtemperatur für 1 Tag9 (Abbildung 1).
- Nach der Fixierung9 tauchen Sie die Niere 3 h lang in 1% Formaldehyd in PB (1:36 Mischung aus 37% Formaldehyd und PB) und waschen Sie sie mit PBS bei Raumtemperatur für 6 h (Abbildung 1).
4. Anpassung des Brechungsindex (RI)
- Bereiten Sie CUBIC-R+ vor.
- CUBIC-R wird durch Mischen von 45 Gew.-% 2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolon/Antipyrin und 30 Gew.-% Nicotinamid hergestellt (siehe Materialtabelle).
- Bereiten Sie CUBIC-R+ für die Anpassung des Brechungsindex (RI) vor, indem 0,5 v% N-Buthyldiethanolamin zu CUBIC-R gemäß den zuvor veröffentlichten Berichten 4,8,9 hinzugefügt werden.
- Führen Sie den RI-Abgleich durch.
- Tauchen Sie die Niere in 7 ml 50% (v/v) CUBIC-R+ (1:1 Mischung aus Wasser und CUBIC-R+) in ein 14 ml rundes Bodenrohr mit leichtem Schütteln bei Raumtemperatur für 1 Tag. Tauchen Sie es dann in 7 ml CUBIC-R+ in ein 14-ml-Rundbodenrohr unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur für 2 Tage9 (Abbildung 1).
HINWEIS: Obwohl die Niere zu Beginn des RI-Abgleichs in 50% CUBIC-R+ schwimmt, sinkt sie ab und wird am Ende des Prozesses in CUBIC-R+ transparent (Abbildung 2D).
- Tauchen Sie die Niere in 7 ml 50% (v/v) CUBIC-R+ (1:1 Mischung aus Wasser und CUBIC-R+) in ein 14 ml rundes Bodenrohr mit leichtem Schütteln bei Raumtemperatur für 1 Tag. Tauchen Sie es dann in 7 ml CUBIC-R+ in ein 14-ml-Rundbodenrohr unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur für 2 Tage9 (Abbildung 1).
5. Bildaufnahme und Rekonstruktion
- Tauchen Sie die RI-angepasste Niere während der Bildaufnahme (RI = 1,51)55 in eine Mischung aus Siliziumöl (RI = 1,555) und Mineralöl (RI = 1,467) (55 :45) (Abbildung 3).
- Erfassen Sie 3D-Bilder der gesamten Niere mit einem speziell angefertigten 9-Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop (siehe Materialtabelle). Sammeln Sie alle Rohbilddaten in einem 16-Bit-TIFF-Format. Visualisieren und erfassen Sie die 3D-gerenderten Bilder mit der Bildanalysesoftware (Imaris, siehe Materialtabelle).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mit dieser Färbemethode wurden sympathische Nerven [Anti-Tyrosinhydroxylase (TH)-Antikörper] und Arterien [Anti-α-glatter Muskelaktin-Antikörper (αSMA)-Antikörper] in einer ganzen Niere sichtbar gemacht (Abbildung 4A,B und Video 1)9. Abnorme renale Sympathikusnerven wurden auch nach Ischämie/Reperfusionsverletzung (IRI) visualisiert9,10 (Abbildung 4C). Darüber hinaus wurde die Visualisierung sympathischer Nerven in der gesamten Milz13 mit diesem Protokoll erreicht (Abbildung 4D). Ein Beispiel für die Quantifizierung der 3D-Immunfluoreszenzdaten ist in Abbildung 5 dargestellt.
Darüber hinaus war die Visualisierung von Sammelkanälen [Anti-Aquaporin 2 (AQP2)-Antikörper], des S1-Segments proximaler Tubuli [Anti-Natrium-Glucose-Cotransporter 2 (SGLT2)-Antikörper] und der Glomeruli (Anti-Podocin-Antikörper) in einer ganzen Niereerfolgreich 9 (Abbildung 6A). Mit dieser 3D-Bildgebung von Glomeruli wurde die Glomerulomegalie (Anti-Podocin-Antikörper) in den frühen Stadien der diabetischen Nierenerkrankung visualisiert, die durch die Arzneimittelverabreichung unterdrückt wurde11 (Abbildung 6B).
Abbildung 1: Gewebereinigung und Whole-mount-Immunfluoreszenzfärbung. Die Gewebereinigung durch CUBIC ist ein zweistufiger Prozess: Delipidierung (CUBIC-L) und Brechungsindexanpassung (RI) (CUBIC-R+). Die Whole-Mount-Färbung wird nach dem Delipidierungsprozess durchgeführt. Maßstabsbalken = 10 mm. Das Bild ist reproduziert von Hasegawa et al.9. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Bilder des Handhabungsprozesses . (A) Die Probe wird in 7 mL 50% oder 100% CUBIC-L in einem 14 mL Rundbodenrohr eingetaucht. Der Schlauch wird während des Delipidierungsprozesses durch leichtes Schütteln horizontal gehalten. (B) Für die Probenhandhabung wird ein Dosierlöffel verwendet. (C) Die Menge des Färbepuffers, die für eine Niere benötigt wird, beträgt 500-600 μL. Das Röhrchen wird während des Färbevorgangs senkrecht gehalten. (D) Obwohl die Probe zu Beginn des RI-Abgleichs in 50% CUBIC-R+ schwimmt, sinkt sie ab und wird am Ende des Prozesses in CUBIC-R+ transparent. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie für die 3D-Bildgebung der ganzen Niere. Die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM) ermöglicht die dreidimensionale (3D) Abbildung transparenter Proben. Dieses Bild ist reproduziert von Hasegawa et al.9. Bei der Datenerfassung wird Immersionsöl verwendet. Lichtblätter von beiden Seiten beleuchten die Probe. Die Anregungssignale werden durch die Objektivlinse erfasst, die sich in vertikaler Position befindet. Der Tisch bewegt sich in axialer Richtung, und es werden Z-Stack-Bilder erhalten. Maßstabsbalken = 10 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4. Ganznieren-dreidimensionale Bildgebung von sympathischen Nerven und Arterien. (A) Sympathische Nerven [Anti-Tyrosin-Hydroxylase (TH)-Antikörper, grün] und Arterien [Anti-α-glatter Muskelaktin-Antikörper (αSMA), Magenta] werden in einer ganzen Niere visualisiert. (B) Das vergrößerte Bild der x-y-Ebene von (A) ist dargestellt [Anti-TH-Antikörper, grün; Anti-αSMA-Antikörper, Magenta]. (C) Anhaltende Denervierung nach renaler Ischämie-Reperfusionsverletzung (IRI) wird visualisiert. (D) Sympathische Nerven in einer Milz werden durch das aktuelle Protokoll auch in einer ganzen Milz visualisiert. Dieses Bild ist reproduziert von Hasegawa et al.9. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Quantifizierung der dreidimensionalen Immunfluoreszenzfärbung. Der Prozess der Quantifizierung des Verhältnisses von signalpositivem Volumen zu Gesamtnierenvolumen wird gezeigt. Die binäre Konvertierung wird entsprechend jedem Schwellenwert durchgeführt. Die Volumina erhalten man durch Berechnung des Integrals der interessierenden Fläche (Voxelgröße: x = 6,45 μm, y = 6,45 μm, z = 7 μm). Das Bild ist reproduziert von Hasegawa et al.9. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Ganznieren-dreidimensionale Bildgebung von Sammelkanälen, proximalen Tubuli und Glomeruli. (A) Sammelkanäle [Anti-Aquaporin 2 (AQP2)-Antikörper], S1-Segment proximaler Tubuli [Anti-Natrium-Glucose-Cotransporter 2 (SGLT2)-Antikörper] und Glomeruli (Anti-Podocin-Antikörper) werden jeweils in einer ganzen Niere visualisiert. Das Bild ist reproduziert von Hasegawa et al.9. (B) Glomerulomegalie wird im Frühstadium der diabetischen Nierenerkrankung (Anti-Podocin-Antikörper) beobachtet, die durch die Arzneimittelverabreichung unterdrückt wird. Das Bild ist reproduziert von Hasegawa et al.11. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Video 1: Rotierender Film der Niere. Der rotierende Film der Niere in Abbildung 4A ist dargestellt. Sympathische Nerven [Anti-Tyrosin-Hydroxylase (TH)-Antikörper, grün] und Arterien [Anti-α-glatter Muskelaktin-Antikörper (αSMA), Magenta] werden visualisiert. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Das vorliegende Protokoll ermöglichte die 3D-Bildgebung verschiedener Strukturen wie Sympathikusnerven, Sammelkanäle, Arterien, proximaler Tubuli und Glomeruli 9,10,11. Diese Färbemethode bot makroskopische Beobachtung und führte zu neuen biologischen Entdeckungen, indem sie die Veränderung der Nierensympathikusnerven nach Ischämie-Reperfusionsverletzung 9,10 und Glomerulomegalie im Anfangsstadium der diabetischen Nierenerkrankung sichtbar machte 11.
Die Opazität wird von der optischen Inhomogenität in einem Gewebe abgeleitet5. Das gemeinsame Prinzip verschiedener Gewebereinigungsmethoden besteht darin, Lichtstreuer/-absorber zu entfernen und den Raum mit RI-passenden Reagenzien zu füllen. Im Vergleich zu organischen lösemittelbasierten Methoden wie der 3D-Bildgebung lösemittelfreier Organe (3DISCO/iDISCO)3,14 basiert CUBIC auf hydrophilen Reagenzien und ist damit der Fluoreszenzkonservierung überlegen5. Diese Eigenschaft von CUBIC ermöglicht es Forschern, fluoreszierende Signale von Reportermausstämmen2 sowie Signale von Ganzmontage-Immunfluoreszenzfärbungen zu beobachten, was mehr Optionen für ein umfassendes Verständnis der 3D-Organstrukturen bietet.
Das vorliegende CUBIC-basierte Gewebereinigungsprotokoll kann im Vergleich zu früheren Nierenreinigungsuntersuchungen an Mäusen eine hohe Transparenz für die 3D-Bildgebung erreichen15. Es muss jedoch beachtet werden, dass dieses Clearing-Protokoll für Mäusenieren geeignet ist. Ein stärkerer Delipidierungsprozess ist erforderlich, um die menschlichen Nieren zu reinigen. Zum Beispiel haben Zhao et al. kürzlich einen Ansatz für die Kartierung intakter menschlicher Organe vorgestellt, indem sie die effiziente Gewebereinigungsmethode namens SHANEL (small-micelle-mediated human organ efficient clearing and labeling) entwickelt haben16. Da eine stärkere Delipidierung die Proben schädigt, müssen die Forscher eine geeignete Gewebereinigungsmethode entsprechend ihrem Zweck auswählen.
Die Färbung ganzer Organe ist aufgrund der Schwierigkeit der Antikörperpenetration eine Herausforderung. Das vorliegende Protokoll wurde nach Versuch und Irrtum erstellt. Da die Stabilität der Färbung priorisiert wird, kann die Inkubationszeit länger als das erforderliche Minimum sein. Als Ergebnis hat dieses Protokoll eine qualitativ hochwertige Ganzmount-Färbung der Nieren durch die Antikörper gezeigt. Es besteht jedoch die Möglichkeit, dass es nicht gut funktioniert, abhängig von den Zielantigenen, die wir nicht ausprobiert haben. Eine kürzlich durchgeführte Studie hat gezeigt, dass eine zweistufige Färbung mit primären und sekundären Antikörpern wie das aktuelle Protokoll in einigen Fällen nicht optimal für die gesamte Färbung von Mäusegehirnen ist17. Dies liegt daran, dass, wenn die Zielmenge groß ist, sein primärer Antikörper die Probe füllt, was es für den sekundären Antikörper schwierig macht, tief in das Gewebe einzudringen17. Daher ist der fluoreszenzmarkierte primäre Antikörper oder der Komplex aus dem primären Antikörper und dem sekundären Fab-Fragment17 einen Versuch wert, wenn die Penetration von Antikörpern nicht effizient ist.
Was das Bildgebungsverfahren betrifft, müssen Forscher eine geeignete Art der Mikroskopie und Bildauflösung entsprechend ihrem Zweck auswählen. Wenn Forscher eine 3D-Bildgebung der ganzen Niere durchführen möchten, wie in dieser Studie vorgestellt, ist es besser, die Leuchtblatt-Fluoreszenzmikroskopie zu verwenden, da sie schnell breite Z-Stack-Bilder mit einem geringen Maß an Photobleiche aufnehmen kann. Da die Dateigröße von 3D-Bilddaten enorm ist, sollte die Bildauflösung so weit reduziert werden, dass die Ganzorganbildgebung standhält. Im Gegensatz dazu können Forscher auch konfokale oder Multiphotonenmikroskopie verwenden, um 3D-Bilddaten mit hoher Auflösung auf engstem Raum zu erhalten.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die aktuelle Studie eine Whole-Mount-Nierenfärbung für die 3D-Bildgebung mit der Gewebereinigungsmethode CUBIC entwickelt hat. Das Protokoll ermöglicht die Visualisierung von 3D-Strukturen in einer ganzen Niere und bietet eine makroskopische Perspektive für die Nierenforschung.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Ein Teil dieser Arbeit wurde in Zusammenarbeit mit Prof. Hiroki R. Ueda (Universität Tokio), Prof. Etsuo A. Susaki (Juntendo University), Prof. Tetsuhiro Tanaka (Tohoku University), Prof. Masafumi Fukagawa, Dr. Takehiko Wada und Dr. Hirotaka Komaba (Tokai University) durchgeführt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube | Falcon | 352059 | Tissue clearing, staining, wash |
| 2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine | Tokyo Chemical Industry | D1876 | CUBIC-R+ |
| 37%-Formaldehyde Solution | Nacalai Tesque | 16223-55 | Post fixation |
| 4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Nacalai Tesque | 09154-85 | Kidney fixation |
| Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody | Invitrogen | A-21436 | Secondary antibody (1:100) |
| Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | A-31573 | Secondary antibody (1:200) |
| Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody | Abcam | ab199975 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-podocin antibody | Sigma-Aldrich | P0372 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody | Abcam | ab85626 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody | Abcam | ab113 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody | Abcam | ab5694 | Primary antibody (1:200) |
| Blocker Casein in PBS | Thermo Fisher Scientific | 37528 | Staining buffer |
| Butorphanol Tartrate | Meiji | 005526 | Anesthetic |
| C57BL/6NJcl | Nippon Bio-Supp.Center | N/A | Mouse strain |
| Imaris | Bitplane | N/A | Imaging analysis software |
| Macro-zoom microscope | OLYMPUS | MVX10 | The observation unit of the custom-built microscope |
| Medetomidine Hydrochloride | Kyoritsu-Seiyaku | 008656 | Anesthetic |
| Midazolam | SANDOZ | 27803229 | Anesthetic |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Immersion oil |
| N-buthyldiethanolamine | Tokyo Chemical Industry | B0725 | CUBIC-L, CUBIC-R+ |
| Nicotinamide | Tokyo Chemical Industry | N0078 | CUBIC-R+ |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | CUBIC-L, PBST |
| Silicon oil HIVAC-F4 | Shin-Etsu Chemical | 50449832 | Immersion oil |
| Sodium azide | Wako | 195-11092 | Staining buffer |
References
- Velez-Fort, M., et al. The stimulus selectivity and connectivity of layer six principal cells reveals cortical microcircuits underlying visual processing. Neuron. 83 (6), 1431-1443 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Tainaka, K., et al. Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Hasegawa, S., et al. Comprehensive three-dimensional analysis (CUBIC-kidney) visualizes abnormal renal sympathetic nerves after ischemia/reperfusion injury. Kidney International. 96 (1), 129-138 (2019).
- Hasegawa, S., Inoue, T., Inagi, R. Neuroimmune interactions and kidney disease. Kidney Research and Clinical Practice. 38 (3), 282-294 (2019).
- Hasegawa, S., et al. The oral hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor enarodustat counteracts alterations in renal energy metabolism in the early stages of diabetic kidney disease. Kidney International. 97 (5), 934-950 (2020).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hasegawa, S., et al. Activation of sympathetic signaling in macrophages blocks systemic inflammation and protects against renal ischemia-reperfusion injury. Journal of the American Society of Nephrology. 32 (7), 1599-1615 (2021).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1-22 (2020).
