Summary
Mevcut protokol, üç boyutlu (3D) böbrek görüntüleme için bir doku temizleme yöntemi ve tam montajlı immünofloresan boyama yöntemini tanımlamaktadır. Bu teknik, böbrek patolojisinde makroskopik perspektifler sunarak yeni biyolojik keşiflere yol açabilir.
Abstract
Konvansiyonel patoloji böbrek mikroyapısı hakkında çok sayıda bilgi vermesine rağmen, üç boyutlu (3D) bilgi eksikliği nedeniyle böbrekteki kan damarlarının, proksimal tübüllerin, toplama kanallarının, glomerüllerin ve sempatik sinirlerin kesin yapısını bilmek zordu. Optik temizleme, bu büyük engelin üstesinden gelmek için iyi bir stratejidir. Bütün bir organdaki çoklu hücreler, doku temizleme ve 3D görüntüleme tekniği birleştirilerek tek hücre çözünürlüğünde analiz edilebilir. Bununla birlikte, tüm organ görüntüleme için hücre etiketleme yöntemleri az gelişmiş kalmaktadır. Özellikle, antikor penetrasyonundaki zorluk nedeniyle tüm organ boyama zordur. Mevcut protokol, CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis) doku temizleme yöntemi ile 3D görüntüleme için tam montajlı bir fare böbrek boyama geliştirdi. Protokol, iskemi-reperfüzyon hasarı sonrası renal sempatik denervasyonun ve diyabetik böbrek hastalığının erken evresinde glomerülomegalinin kapsamlı bir bakış açısıyla görselleştirilmesini sağlamıştır. Böylece, bu teknik makroskopik bir bakış açısı sağlayarak böbrek araştırmalarında yeni keşiflere yol açabilir.
Introduction
Böbrek çeşitli hücre popülasyonlarından oluşur. Konvansiyonel patoloji bize böbrek mikroçevresi hakkında çok fazla bilgi vermesine rağmen, böbrek hastalığı progresyonu sırasında hücreler arası çapraz konuşmayı tam olarak anlamak için üç boyutlu (3D) görüntülemeye ihtiyaç vardır. Geçmişte, tüm organ 3D görüntüleme1 için çok sayıda seri kesitleme ve görüntü rekonstrüksiyonu yapılması gerekiyordu. Ancak bu yöntem çok fazla çaba gerektiriyordu ve tekrarlanabilirlik açısından sorunlar yaşıyordu.
Optik temizleme, bu engelin üstesinden gelmek için iyi bir stratejidir 2,3. Doku opaklığı esas olarak ışık saçılması ve emiliminden kaynaklanır, çünkü her organ su, protein ve lipitler dahil olmak üzere çeşitli maddelerden oluşur. Bu nedenle, doku temizlemenin temel stratejisi, dokulardaki su ve lipitleri, proteinlerle aynı optik özelliklere sahip kırılma indisi (RI) eşleşen reaktiflerle değiştirmektir4. Şeffaf bir örneği gözlemlemek için, hafif bir tabaka floresan mikroskobu yararlıdır5. Işık tabakaları şeffaf numuneyi yandan aydınlatır ve uyarma sinyalleri dikey konumda bulunan objektif lens aracılığıyla elde edilir6. Bu mikroskopi, konfokal veya multifoton floresan mikroskopisinden farklı olan tek bir taramada kesit bilgisi elde eder. Böylece, düşük fotobeyazlatma seviyesine sahip z-stack görüntülerini hızlı bir şekilde elde edebilir.
Net, Engelsiz Beyin/Vücut Görüntüleme Kokteylleri ve Hesaplamalı Analiz (CUBIC), ışık tabakası floresan mikroskobuile tüm organların görüntülenmesini sağlayan doku temizleme yöntemlerinden biridir 2,7,8. KÜBİK ve tam montajlı immünofloresan boyama, fare böbrek 3D yapılarını görselleştirmek için bu çalışmada optimize edilmiştir 9,10,11. Bu bütünsel boyama yöntemini kullanarak, böbrek sempatik sinirlerindeki değişiklik, diyabetikböbrek hastalığı 11'in erken evresinde iskemi-reperfüzyon hasarı 9,10 ve glomerülomegaliden sonra, ayrıca kan damarları, proksimal tübüller ve bütün bir böbrekte toplama kanalları9 olarak görselleştirilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler Tokyo Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylandı. Tüm hayvan prosedürleri Ulusal Sağlık Enstitüleri kılavuzlarına göre gerçekleştirildi. Bu çalışmada 8 haftalık erkek C57BL/6NJcl fareler kullanıldı. Fareler ticari kaynaklardan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu).
1. Hayvan hazırlığı ve böbrek fiksasyonu
- Aşağıdaki adımları izleyerek perfüzyon fiksasyonu gerçekleştirin.
- İzofluran (% 3, 2.0 L / dak) solunması ve intraperitoneal medetomidin hidroklorür (0.3 mg / kg), butorphanol tartarat (5 mg / kg) ve midazolam (4 mg / kg) (bkz.
- Hayvanı kalbin sol ventrikülünden fosfat tamponunda (PB) 20 mL PBS (pH 7.4) ve 30 mL% 4 PFA ile perfüze edin12.
- Daldırma fiksasyonunu perfüzyon fiksasyonundan ve böbrek örneklemesinden hemen sonra gerçekleştirin9.
- Böbreği 4 °C'de %4 PFA'ya 16 saat daha batırın, ardından PBS ile 2 saat (üç kez)9 yıkayın (Şekil 1).
DİKKAT: Formaldehit ve paraformaldehit toksik tahriş edicilerdir. Reaktifleri uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla bir duman başlığında tutun.
- Böbreği 4 °C'de %4 PFA'ya 16 saat daha batırın, ardından PBS ile 2 saat (üç kez)9 yıkayın (Şekil 1).
2. Renk giderme ve delipidasyon
- Daha önce yayınlanan 4,8,9 raporlarını takiben, ağırlıkça% 10 Triton X-100 ve ağırlıkça% 10 N-bütildietanolamin'den oluşan renk giderme ve delipidasyon için CUBIC-L'yi hazırlayın (bakınız Malzeme Tablosu).
- Aşağıdaki adımları izleyerek CUBIC-L ile renk giderme ve delipidasyon gerçekleştirin.
- Sabit böbreği, oda sıcaklığında 6 saat boyunca hafifçe sallanarak 14 mL'lik yuvarlak tabanlı bir tüpe (bkz. Malzeme Tablosu) 7 mL'lik %50 (v/v) CUBIC-L'lik (1:1 su ve CUBIC-L karışımı) batırın (Şekil 2A). Daha sonra, 5 gün boyunca 37 ° C'de hafifçe sallanan 14 mL'lik yuvarlak bir alt tüpe 7 mL CUBIC-L'ye batırın.
- Bu işlem sırasında CUBIC-L'yi her gün yenileyin. Renk giderme ve delipidasyon işleminden sonra, böbreği PBS ile oda sıcaklığında 2 saat (üç kez)9 yıkayın (Şekil 1). Numune işleme için bir dağıtım kaşığı kullanın (Şekil 2B).
3. Tam montajlı immünofloresan boyama
- Boyama tamponlarını hazırlayın.
- PBS'de% 0.5 (v / v) Triton X-100,% 0.5 kazein ve% 0.05 sodyum azid9 karıştırarak birincil antikorlar için boyama tamponunu hazırlayın.
- PBS'de% 0.5 (v / v) Triton X-100,% 0.1 kazein ve% 0.05 sodyum azid9 karıştırarak ikincil antikorlar için boyama tamponunu hazırlayın.
- Birincil antikorlarla boyama yapın.
- Delipide böbreği primer antikorlarla (1:100 veya 1:200, bakınız Malzeme Tablosu) 37 °C'de boyama tamponunda 7 gün boyunca hafifçe sallayarak immünoboyayın.
NOT: Bir böbrek için gerekli boyama tamponu miktarı 500-600 μL'dir (Şekil 2C). - Böbreği PBS'de (PBST) %0,5 (v/v) Triton X-100 ile oda sıcaklığında 1 gün9 boyunca yıkayın (Şekil 1).
- Delipide böbreği primer antikorlarla (1:100 veya 1:200, bakınız Malzeme Tablosu) 37 °C'de boyama tamponunda 7 gün boyunca hafifçe sallayarak immünoboyayın.
- İkincil antikorlarla boyama yapın.
- Böbreği ikincil antikorlarla (1:100 veya 1:200, bakınız Malzeme Tablosu) 37 ° C'de boyama tamponunda 7 gün boyunca hafifçe sallayarak immünoboyayın. Böbreği PBST ile oda sıcaklığında 1 gün9 boyunca yıkayın (Şekil 1).
- Fiksasyon9 sonrası, böbreği 3 saat boyunca PB'de% 1 formaldehit (% 37 formaldehit ve PB karışımı% 1: 36 karışımı) içine batırın ve 6 saat boyunca oda sıcaklığında PBS ile yıkayın (Şekil 1).
4. Kırılma indisi (RI) eşleştirmesi
- CUBIC-R+'ı hazırlayın.
- Ağırlıkça% 45 2,3-dimetil-1-fenil-5-pirazolon / antipirin ve ağırlıkça% 30 nikotinamid karıştırarak CUBIC-R hazırlayın (bkz.
- Daha önce yayınlanan 4,8,9 raporlarını takiben CUBIC-R'ye N-bütildietanolaminin% 0,5 v'sini ekleyerek kırılma indisi (RI) eşleşmesi için CUBIC-R + hazırlayın.
- RI eşleştirmesini gerçekleştirin.
- Böbreği, 1 gün boyunca oda sıcaklığında hafifçe çalkalanan 14 mL'lik yuvarlak tabanlı bir tüp içinde 7 mL'lik %50 (v/v) CUBIC-R+ (1:1 su ve CUBIC-R+) karışımına batırın. Ardından, 2 gün9 boyunca oda sıcaklığında hafifçe sallanan 14 mL'lik yuvarlak alt tüpe 7 mL CUBIC-R + 'ya batırın (Şekil 1).
NOT: Böbrek, RI eşleşmesinin başlangıcında% 50 CUBIC-R + 'da yüzmesine rağmen, işlemin sonunda CUBIC-R + 'da batar ve şeffaf hale gelir (Şekil 2D).
- Böbreği, 1 gün boyunca oda sıcaklığında hafifçe çalkalanan 14 mL'lik yuvarlak tabanlı bir tüp içinde 7 mL'lik %50 (v/v) CUBIC-R+ (1:1 su ve CUBIC-R+) karışımına batırın. Ardından, 2 gün9 boyunca oda sıcaklığında hafifçe sallanan 14 mL'lik yuvarlak alt tüpe 7 mL CUBIC-R + 'ya batırın (Şekil 1).
5. Görüntü toplama ve yeniden yapılandırma
- Görüntü yakalama sırasında (RI = 1.51)5 (Şekil 3) RI uyumlu böbreği silikon yağı (RI = 1.555) ve mineral yağ (RI = 1.467) (55:45) karışımına batırın.
- Özel yapım9 ışık tabakası floresan mikroskop ile tüm böbreğin 3D görüntülerini elde edin (bkz. Tüm ham görüntü verilerini 16 bit TIFF biçiminde toplayın. Görüntüleme analiz yazılımı ile 3B olarak işlenmiş görüntüleri görselleştirin ve yakalayın (Imaris, bkz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu boyama yöntemi kullanılarak bütün böbrekte sempatik sinirler [anti-tirozin hidroksilaz (TH) antikoru] ve arterler [anti-α-düz kas aktin (αSMA) antikoru] (Şekil 4A,B ve Video 1) görselleştirildi9. İskemi/reperfüzyon hasarı (IRI)9,10 sonrası anormal renal sempatik sinirler de görüntülendi (Şekil 4C). Ayrıca, tüm dalak13'teki sempatik sinirlerin görselleştirilmesi bu protokol kullanılarak sağlanmıştır (Şekil 4D). 3D immünofloresan verilerin nicelleştirilmesine bir örnek Şekil 5'te gösterilmiştir.
Ek olarak, toplama kanallarının [anti-aquaporin 2 (AQP2) antikoru], proksimal tübüllerin S1 segmentinin [anti-sodyum glukoz kotransporter 2 (SGLT2) antikoru] ve bütün bir böbrek9'daki glomerüllerin (anti-podocin antikoru) görselleştirilmesi başarılı olmuştur (Şekil 6A). Glomerüllerin bu 3D görüntülemesi kullanılarak, glomerülomegali (anti-podocin antikoru), ilaç uygulaması11 ile baskılanan diyabetik böbrek hastalığının erken evrelerinde görselleştirildi (Şekil 6B).
Şekil 1: Doku temizleme ve tam montajlı immünofloresan boyama. CUBIC ile doku temizliği iki aşamalı bir işlemdir: delipidasyon (CUBIC-L) ve kırılma indisi (RI) eşleşmesi (CUBIC-R +). Tam montajlı boyama, delipidasyon işleminden sonra gerçekleştirilir. Ölçek çubuğu = 10 mm. Görüntü Hasegawa ve ark.9'dan çoğaltılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Elleçleme işleminin görüntüleri . (A) Numune, 14 mL'lik yuvarlak tabanlı bir tüp içinde 7 mL'lik %50 veya %100 CUBIC-L'ye daldırılır. Tüp, delipidasyon işlemi sırasında hafifçe sallanarak yatay tutulur. (B) Numune işleme için bir dağıtım kaşığı kullanılır. (C) Bir böbrek için gerekli boyama tamponu miktarı 500-600 μL'dir. Boyama işlemi sırasında tüp dikey tutulur. (D) Numune, RI eşleşmesinin başlangıcında %50 CUBIC-R+'da yüzmesine rağmen, işlemin sonunda CUBIC-R+'da batar ve saydam hale gelir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Tüm böbrek 3D görüntüleme için ışık tabakası floresan mikroskopi. Işık tabakası floresan mikroskobu (LSFM), şeffaf numunelerin üç boyutlu (3D) görüntülenmesini sağlar. Bu görüntü Hasegawa ve ark.9'dan çoğaltılmıştır. Daldırma yağı veri toplama sırasında kullanılır. Her iki taraftaki ışık tabakaları numuneyi aydınlatır. Uyarma sinyalleri, dikey konumda bulunan objektif lens aracılığıyla elde edilir. Sahne alanı eksenel yönde hareket eder ve z-yığını görüntüleri elde edilir. Ölçek çubuğu = 10 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. Sempatik sinir ve arterlerin tüm böbrek üç boyutlu görüntülenmesi. (A) Sempatik sinirler [anti-tirozin hidroksilaz (TH) antikoru, yeşil] ve arterler [anti-α-düz kas aktin (αSMA) antikoru, macenta] bütün bir böbrekte görselleştirilir. (B) (A)'nın büyütülmüş x-y düzlemi görüntüsü gösterilmiştir [anti-TH antikoru, yeşil; anti-αSMA antikoru, macenta]. (C) Renal iskemi-reperfüzyon hasarı (IRI) sonrası kalıcı denervasyon görselleştirilir. (D) Bir dalaktaki sempatik sinirler de mevcut protokol tarafından bütün bir dalakta görselleştirilir. Bu görüntü Hasegawa ve ark.9'dan çoğaltılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Üç boyutlu immünofloresan boyamanın miktarı. Sinyal-pozitif hacmin toplam böbrek hacmine oranını ölçme işlemi gösterilmiştir. İkili dönüştürme her eşiğe göre gerçekleştirilir. Hacimler, ilgi alanının integralinin hesaplanmasıyla elde edilir (voksel boyutu: x = 6.45 μm, y = 6.45 μm, z = 7 μm). Görüntü Hasegawa ve ark.9'dan çoğaltılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Toplama kanallarının, proksimal tübüllerin ve glomerüllerin tüm böbrek üç boyutlu görüntülenmesi. (A) Toplama kanalları [anti-aquaporin 2 (AQP2) antikoru], proksimal tübüllerin S1 segmenti [anti-sodyum glukoz kotransporter 2 (SGLT2) antikoru] ve glomerüller (anti-podocin antikoru) sırasıyla bütün bir böbrekte görselleştirilir. Görüntü Hasegawa ve ark.9'dan çoğaltılmıştır. (B) Glomerülomegali, ilaç uygulaması ile baskılanan diyabetik böbrek hastalığının (anti-podocin antikoru) erken evresinde gözlenir. Görüntü Hasegawa ve ark.11'den çoğaltılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Video 1: Böbreğin dönen filmi. Şekil 4A'da böbreğin dönen filmi gösterilmiştir. Sempatik sinirler [anti-tirozin hidroksilaz (TH) antikoru, yeşil] ve arterler [anti-α-düz kas aktin (αSMA) antikoru, macenta] görselleştirilir. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut protokol, sempatik sinirler, toplama kanalları, arterler, proksimal tübüller ve glomerüller 9,10,11 gibi çeşitli yapıların tüm böbrek 3D görüntülenmesine izin verdi. Bu boyama yöntemi, iskemi-reperfüzyon hasarı 9,10 ve diyabetik böbrek hastalığının ilk aşamasında glomerülomegali sonrası renal sempatik sinirlerdeki değişimi görselleştirerek makroskopik gözlem sağladı ve yeni biyolojik keşiflere yol açtı 11.
Opaklık, bir dokudaki optik homojensizlikten türetilir5. Çeşitli doku temizleme yöntemlerinin ortak prensibi, ışık saçılımcılarının/emicilerinin uzaklaştırılması ve alanın RI ile eşleşen reaktiflerle doldurulmasıdır. Solventten arındırılmış organların 3D görüntülenmesi (3DISCO / iDISCO) 3,14 gibi organik solvent bazlı yöntemlerle karşılaştırıldığında, CUBIC hidrofilik reaktiflere dayanır ve bu nedenle floresan korumada üstündür5. KÜBİK'in bu özelliği, araştırmacıların muhabir fare suşları2'den gelen floresan sinyalleri ve ayrıca tam montajlı immünofloresan boyamadan gelen sinyalleri gözlemlemelerini sağlayarak 3D organ yapılarının kapsamlı bir şekilde anlaşılması için daha fazla seçenek sunar.
Mevcut CUBIC tabanlı doku temizleme protokolü, önceki fare böbrek temizleme araştırmasına kıyasla 3D görüntüleme için yüksek şeffaflık elde edebilir15. Bununla birlikte, bu temizleme protokolünün fare böbrekleri için uygun olduğu belirtilmelidir. İnsan böbreklerini temizlemek için daha güçlü bir delipidasyon işlemine ihtiyaç vardır. Örneğin, Zhao ve ark. yakın zamanda SHANEL (küçük misel aracılı insan organı verimli temizleme ve etiketleme) adlı etkili doku temizleme yöntemini geliştirerek bozulmamış insan organı haritalaması için bir yaklaşım sunmuşlardır16. Daha güçlü delipidasyon örneklere zarar verdiğinden, araştırmacıların amaçlarına göre uygun bir doku temizleme yöntemi seçmeleri gerekir.
Tüm organ boyama işlemi, antikor penetrasyonundaki zorluk nedeniyle zordur; mevcut protokol deneme yanılma sonrasında oluşturulmuştur. Boyama stabilitesine öncelik verildiğinden, inkübasyon süresi gereken minimum süreden daha uzun olabilir. Sonuç olarak, bu protokol böbreklerin antikorlar tarafından yüksek kalitede tam montajlı boyandığını göstermiştir. Bununla birlikte, denemediğimiz hedef antijenlere bağlı olarak iyi çalışmama olasılığı vardır. Yakın zamanda yapılan bir çalışma, mevcut protokol gibi birincil ve ikincil antikorları kullanan iki aşamalı boyamanın, bazı durumlarda fare beyinlerinin tamamen boyanması için en uygun olmadığını göstermiştir17. Bunun nedeni, hedef miktar büyük olduğunda, birincil antikorunun numuneyi doldurması ve ikincil antikorun doku17'nin derinliklerine nüfuz etmesini zorlaştırmasıdır. Bu nedenle, floresan etiketli birincil antikor veya birincil antikor ve sekonder Fab fragmanı17'nin kompleksi, antikorların penetrasyonu verimli değilse denemeye değer.
Görüntüleme sürecine gelince, araştırmacıların amaçlarına göre uygun bir mikroskopi ve görüntü çözünürlüğü seçmeleri gerekir. Araştırmacılar bu çalışmada sunulduğu gibi tüm böbrek 3D görüntülemeyi yapmak istiyorlarsa, ışık tabakası floresan mikroskobu kullanmak daha iyidir, çünkü düşük düzeyde fotobeyazlatma ile geniş z-yığını görüntülerini hızlı bir şekilde elde edebilir. 3D görüntüleme verilerinin dosya boyutu çok büyük olduğundan, görüntü çözünürlüğü tüm organ görüntülemenin dayanabileceği ölçüde azaltılmalıdır. Buna karşılık, araştırmacılar dar alanda yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme verileri elde ederken konfokal veya multifoton mikroskopileri de kullanabilirler.
Sonuç olarak, mevcut çalışmada doku temizleme yöntemi CUBIC ile 3D görüntüleme için tam montajlı böbrek boyama geliştirilmiştir. Protokol, tüm böbrekteki 3D yapıların görselleştirilmesine izin vererek böbrek araştırması için makroskopik bir bakış açısı sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışmanın bir kısmı Prof. Hiroki R. Ueda (Tokyo Üniversitesi), Prof. Etsuo A. Susaki (Juntendo Üniversitesi), Prof. Tetsuhiro Tanaka (Tohoku Üniversitesi), Prof. Masafumi Fukagawa, Dr. Takehiko Wada ve Dr. Hirotaka Komaba (Tokai Üniversitesi) ile işbirliği içinde yürütülmüştür.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube | Falcon | 352059 | Tissue clearing, staining, wash |
| 2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine | Tokyo Chemical Industry | D1876 | CUBIC-R+ |
| 37%-Formaldehyde Solution | Nacalai Tesque | 16223-55 | Post fixation |
| 4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Nacalai Tesque | 09154-85 | Kidney fixation |
| Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody | Invitrogen | A-21436 | Secondary antibody (1:100) |
| Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | A-31573 | Secondary antibody (1:200) |
| Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody | Abcam | ab199975 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-podocin antibody | Sigma-Aldrich | P0372 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody | Abcam | ab85626 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody | Abcam | ab113 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody | Abcam | ab5694 | Primary antibody (1:200) |
| Blocker Casein in PBS | Thermo Fisher Scientific | 37528 | Staining buffer |
| Butorphanol Tartrate | Meiji | 005526 | Anesthetic |
| C57BL/6NJcl | Nippon Bio-Supp.Center | N/A | Mouse strain |
| Imaris | Bitplane | N/A | Imaging analysis software |
| Macro-zoom microscope | OLYMPUS | MVX10 | The observation unit of the custom-built microscope |
| Medetomidine Hydrochloride | Kyoritsu-Seiyaku | 008656 | Anesthetic |
| Midazolam | SANDOZ | 27803229 | Anesthetic |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Immersion oil |
| N-buthyldiethanolamine | Tokyo Chemical Industry | B0725 | CUBIC-L, CUBIC-R+ |
| Nicotinamide | Tokyo Chemical Industry | N0078 | CUBIC-R+ |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | CUBIC-L, PBST |
| Silicon oil HIVAC-F4 | Shin-Etsu Chemical | 50449832 | Immersion oil |
| Sodium azide | Wako | 195-11092 | Staining buffer |
References
- Velez-Fort, M., et al. The stimulus selectivity and connectivity of layer six principal cells reveals cortical microcircuits underlying visual processing. Neuron. 83 (6), 1431-1443 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Tainaka, K., et al. Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Hasegawa, S., et al. Comprehensive three-dimensional analysis (CUBIC-kidney) visualizes abnormal renal sympathetic nerves after ischemia/reperfusion injury. Kidney International. 96 (1), 129-138 (2019).
- Hasegawa, S., Inoue, T., Inagi, R. Neuroimmune interactions and kidney disease. Kidney Research and Clinical Practice. 38 (3), 282-294 (2019).
- Hasegawa, S., et al. The oral hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor enarodustat counteracts alterations in renal energy metabolism in the early stages of diabetic kidney disease. Kidney International. 97 (5), 934-950 (2020).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hasegawa, S., et al. Activation of sympathetic signaling in macrophages blocks systemic inflammation and protects against renal ischemia-reperfusion injury. Journal of the American Society of Nephrology. 32 (7), 1599-1615 (2021).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1-22 (2020).
