Summary
Настоящий протокол описывает метод очистки тканей и полноразмерное иммунофлуоресцентное окрашивание для трехмерной (3D) визуализации почек. Этот метод может предложить макроскопические перспективы в патологии почек, что приводит к новым биологическим открытиям.
Abstract
Хотя обычная патология предоставляла многочисленные сведения о микроструктуре почек, было трудно узнать точную структуру кровеносных сосудов, проксимальных канальцев, собирающих протоков, клубочков и симпатических нервов в почках из-за отсутствия трехмерной (3D) информации. Оптическая очистка является хорошей стратегией для преодоления этого большого препятствия. Несколько клеток в целом органе могут быть проанализированы с одноклеточным разрешением, сочетая очистку тканей и технику 3D-визуализации. Тем не менее, методы маркировки клеток для визуализации всего органа остаются недостаточно развитыми. В частности, окрашивание целых органов является сложной задачей из-за сложности проникновения антител. Настоящий протокол разработал окрашивание почек мыши для 3D-визуализации с помощью метода очистки тканей CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis). Протокол позволил визуализировать почечную симпатическую денервацию после ишемии-реперфузионного повреждения и гломеруломегалию на ранней стадии диабетической болезни почек с комплексной точки зрения. Таким образом, этот метод может привести к новым открытиям в исследованиях почек, обеспечивая макроскопическую перспективу.
Introduction
Почка состоит из различных клеточных популяций. Хотя обычная патология дает нам много информации о микроокружении почек, трехмерная (3D) визуализация необходима для точного понимания межклеточных перекрестных помех во время прогрессирования заболевания почек. В прошлом для 3D-визуализации всего органа1 требовалось выполнить огромное количество серийных секций и реконструкций изображений. Однако этот метод требовал слишком больших усилий и имел проблемы с точки зрения воспроизводимости.
Оптический клиринг является хорошей стратегией для преодоления этого препятствия 2,3. Помутнение тканей в основном связано с рассеянием и поглощением света, потому что каждый орган состоит из различных веществ, включая воду, белок и липиды. Таким образом, основной стратегией очистки тканей является замена воды и липидов в тканях реагентами, соответствующими показателю преломления (RI), которые обладают теми же оптическими свойствами, что и белки4. Для того чтобы наблюдать прозрачный образец, полезна световая листовая флуоресцентная микроскопия5. Световые листы освещают прозрачный образец сбоку, а сигналы возбуждения принимаются через объектив, расположенный в вертикальном положении6. Эта микроскопия получает информацию о поперечном сечении за один развертку, которая отличается от конфокальной или многофотонной флуоресцентной микроскопии. Таким образом, он может быстро получать z-стековые изображения с низким уровнем фотоотбеливания.
Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) является одним из методов очистки тканей, который позволяет визуализировать весь орган с помощью флуоресцентной микроскопиисветового листа 2,7,8. CUBIC и цельное иммунофлуоресцентное окрашивание оптимизированы в настоящем исследовании для визуализации 3D-структур почек мыши 9,10,11. С помощью этого цельно-монтажного метода окрашивания визуализируется изменение почечных симпатических нервов после ишемии-реперфузионного повреждения 9,10 и клубомерулегалии на ранней стадии диабетической болезни почек11, а также кровеносных сосудов, проксимальных канальцев и собирающих протоков во всей почке9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты были одобрены Советом по институциональному обзору Токийского университета. Все процедуры для животных были выполнены в соответствии с руководящими принципами Национального института здравоохранения. Для настоящего исследования использовались самцы мышей C57BL/6NJcl в возрасте 8 недель. Мыши были получены из коммерческих источников (см. Таблицу материалов).
1. Подготовка животных и фиксация почек
- Выполните фиксацию перфузии, выполнив следующие действия.
- Обезболивают мышь путем вдыхания изофлурана (3%, 2,0 л/мин) и внутрибрюшинного введения медетомидина гидрохлорида (0,3 мг/кг), тартрата буторфанола (5 мг/кг) и мидазолама (4 мг/кг) (см. Таблицу материалов).
- Перфузируйте животное 20 мл PBS (рН 7,4) и 30 мл 4% PFA в фосфатном буфере (PB) через левый желудочек сердца12.
- Выполните фиксацию погружения сразу после фиксации перфузии и забора проб почек9.
- Погрузите почку в 4% PFA при 4 °C еще на 16 ч, затем промыть ее PBS в течение 2 ч (три раза)9 (рисунок 1).
ВНИМАНИЕ: Формальдегид и параформальдегид являются токсичными раздражителями. Обращайтесь с реагентами в вытяжном шкафу с соответствующими средствами индивидуальной защиты.
- Погрузите почку в 4% PFA при 4 °C еще на 16 ч, затем промыть ее PBS в течение 2 ч (три раза)9 (рисунок 1).
2. Обесцвечивание и делипидирование
- Готовят CUBIC-L для обесцвечивания и делипидирования, состоящие из 10 мас.% тритона X-100 и 10 мас.% N-бутгилдиэтаноламина (см. Таблицу материалов), следуя ранее опубликованным отчетам 4,8,9.
- Выполните обесцвечивание и делипидацию CUBIC-L, выполнив следующие действия.
- Погрузить неподвижную почку в 7 мл 50% (v/v) CUBIC-L (смесь воды 1:1 и CUBIC-L) в трубку круглого дна объемом 14 мл (см. Таблицу материалов) с легким встряхиванием при комнатной температуре в течение 6 ч (рисунок 2A). Затем погрузите его в 7 мл CUBIC-L в трубку круглого дна объемом 14 мл с легким встряхиванием при 37 °C в течение 5 дней.
- Обновляйте CUBIC-L каждый день во время этого процесса. После процесса обесцвечивания и делипидации промыть почки ПБС комнатной температурой в течение 2 ч (трижды)9 (фиг.1). Используйте дозирующую ложку для обработки проб (рисунок 2B).
3. Цельное иммунофлуоресцентное окрашивание
- Подготовьте буферы окрашивания.
- Подготовьте окрашивающий буфер для первичных антител путем смешивания 0,5% (v/v) Triton X-100, 0,5% казеина в PBS и 0,05% азида натрия9.
- Подготовьте буфер окрашивания для вторичных антител путем смешивания 0,5% (v/v) Triton X-100, 0,1% казеина в PBS и 0,05% азида натрия9.
- Выполняют окрашивание первичными антителами.
- Иммуноокрашить делипидированную почку первичными антителами (1:100 или 1:200, см. Таблицу материалов) в окрашивающем буфере при 37 °C с легким встряхиванием в течение 7 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество окрашивающего буфера, необходимого для одной почки, составляет 500-600 мкл (рисунок 2C). - Промыть почки 0,5% (v/v) Тритон Х-100 в PBS (PBST) при комнатной температуре в течение 1 дня9 (Фиг.1).
- Иммуноокрашить делипидированную почку первичными антителами (1:100 или 1:200, см. Таблицу материалов) в окрашивающем буфере при 37 °C с легким встряхиванием в течение 7 дней.
- Выполняют окрашивание вторичными антителами.
- Иммуноокрашить почку вторичными антителами (1:100 или 1:200, см. Таблицу материалов) в окрашивающем буфере при 37 °C с легким встряхиванием в течение 7 дней. Промыть почки ПБСТ при комнатной температуре в течение 1 дня9 (рисунок 1).
- После фиксации9 погружают почку в 1% формальдегид в ПБ (смесь 1:36 37% формальдегида и ПБ) в течение 3 ч, и промывают ее ПБС при комнатной температуре в течение 6 ч (рисунок 1).
4. Сопоставление показателя преломления (RI)
- Приготовьте CUBIC-R+.
- Получают CUBIC-R путем смешивания 45 мас.% 2,3-диметил-1-фенил-5-пиразолона/антипирина и 30 мас.% никотинамида (см. Таблицу материалов).
- Подготовьте CUBIC-R+ для сопоставления показателя преломления (RI), добавив 0,5 V% N-бутилдиэтаноламина в CUBIC-R после ранее опубликованных отчетов 4,8,9.
- Выполните сопоставление RI.
- Погрузить почку в 7 мл 50% (v/v) CUBIC-R+ (смесь воды 1:1 и CUBIC-R+) в трубку круглого дна объемом 14 мл с легким встряхиванием при комнатной температуре в течение 1 дня. Затем погрузите его в 7 мл CUBIC-R+ в 14 мл круглодонной трубки с легким встряхиванием при комнатной температуре в течение 2 дней9 (рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя почка плавает в 50% CUBIC-R+ в начале сопоставления RI, она опускается и становится прозрачной в CUBIC-R+ в конце процесса (рисунок 2D).
- Погрузить почку в 7 мл 50% (v/v) CUBIC-R+ (смесь воды 1:1 и CUBIC-R+) в трубку круглого дна объемом 14 мл с легким встряхиванием при комнатной температуре в течение 1 дня. Затем погрузите его в 7 мл CUBIC-R+ в 14 мл круглодонной трубки с легким встряхиванием при комнатной температуре в течение 2 дней9 (рисунок 1).
5. Получение и реконструкция изображений
- Погружайте RI-согласованную почку в смесь кремниевого масла (RI = 1,555) и минерального масла (RI = 1,467) (55: 45) во время получения изображения (RI = 1,51)5 (Рисунок 3).
- Получайте 3D-изображения всей почки с помощью люминесцентного микроскопа на9 световых листов (см. Таблицу материалов). Соберите все необработанные данные изображения в 16-битном формате TIFF. Визуализируйте и захватывайте 3D-изображения с помощью программного обеспечения для анализа изображений (Imaris, см. Таблицу материалов).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя этот метод окрашивания, симпатические нервы [антитирозингидроксилазное (TH) антитело] и артерии [антитело против α гладкомышечных актинов (αSMA)] во всей почке (Рисунок 4A, B и Видео 1) были визуализированы9. Аномальные почечные симпатические нервы также визуализировались после ишемии/реперфузионного повреждения (IRI)9,10 (Рисунок 4C). Более того, визуализация симпатических нервов во всей селезенке13 была достигнута с помощью этого протокола (рисунок 4D). Один из примеров количественной оценки 3D-иммунофлуоресцентных данных показан на рисунке 5.
Кроме того, была успешной визуализация собирающих протоков [анти-аквапориновое антитело 2 (AQP2)], сегмента S1 проксимальных канальцев [анти-натриевого глюкозотранспортера 2 (SGLT2) антитела] и клубочков (анти-подоциновое антитело) во всей почке9 была успешной (Рисунок 6A). Используя эту 3D-визуализацию клубочков, гломеруломегалия (антитело против подоцина) была визуализирована на ранних стадиях диабетической болезни почек, которая была подавлена введением препарата11 (Рисунок 6B).
Рисунок 1: Очистка тканей и полноразмерное иммунофлуоресцентное окрашивание. Очистка тканей с помощью CUBIC представляет собой двухэтапный процесс: делипидация (CUBIC-L) и согласование показателя преломления (RI) (CUBIC-R+). Окрашивание цельным креплением выполняется после процесса делипидации. Шкала стержня = 10 мм. Изображение воспроизводится из Hasegawa et al.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Изображения процесса обработки. (A) Образец погружают в 7 мл 50% или 100% CUBIC-L в трубке с круглым дном объемом 14 мл. Трубка держится горизонтально с легким встряхиванием во время процесса делипидации. (B) Для обработки проб используется дозирующая ложка. (C) Количество окрашивающего буфера, необходимого для одной почки, составляет 500-600 мкл. Трубка держится вертикально во время процесса окрашивания. (D) Хотя образец плавает в 50% CUBIC-R+ в начале сопоставления RI, он опускается и становится прозрачным в CUBIC-R+ в конце процесса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Флуоресцентная микроскопия светового листа для 3D-визуализации всей почки. Световая листовая флуоресцентная микроскопия (LSFM) позволяет получать трехмерную (3D) визуализацию прозрачных образцов. Это изображение воспроизводится из Hasegawa et al.9. При сборе данных используется погружное масло. Световые листы с обеих сторон освещают образец. Сигналы возбуждения принимаются через объективную линзу, расположенную в вертикальном положении. Стадия движется в осевом направлении, и получаются изображения z-стека. Шкала = 10 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4. Цельнопочковая трехмерная визуализация симпатических нервов и артерий. (A) Симпатические нервы [антитирозингидроксилаза (TH) антитело, зеленый] и артерии [антитело против α гладкомышечных актинов (αSMA), пурпурный] визуализируются во всей почке. (B) Показано увеличенное изображение плоскости x-y (A) [анти-TH антитело, зеленый; анти-αSMA антитело, пурпурный]. (C) Визуализируется стойкая денервация после почечной ишемии-реперфузионной травмы (ИРИ). (D) Симпатические нервы в селезенке также визуализируются во всей селезенке по текущему протоколу. Это изображение воспроизводится из Hasegawa et al.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Количественная оценка трехмерного иммунофлуоресцентного окрашивания. Показан процесс количественной оценки отношения сигнально-положительного объема к общему объему почек. Двоичное преобразование выполняется в соответствии с каждым порогом. Объемы получаются путем вычисления интеграла интересующей площади (размер вокселя: x = 6,45 мкм, y = 6,45 мкм, z = 7 мкм). Изображение воспроизводится из Hasegawa et al.9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Трехмерная визуализация цельной почки собирающих протоков, проксимальных канальцев и клубочков. (A) Сборные протоки [антитело против аквапорина 2 (AQP2)], сегмент S1 проксимальных канальцев [антитело к глюкозе против натрия 2 (SGLT2)] и клубочки (антиподоциновое антитело) соответственно визуализируются во всей почке. Изображение воспроизводится из Hasegawa et al.9. (Б) Гломеруломегалия наблюдается на ранней стадии диабетической болезни почек (антиподоциновое антитело), которая подавляется при введении препарата. Изображение воспроизводится из Hasegawa et al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Видео 1: Вращающийся ролик почки. Показан вращающийся ролик почки на рисунке 4А . Визуализируются симпатические нервы [антитирозингидроксилазное (TH) антитело, зеленый] и артерии [антитело против α гладкомышечного актина (αSMA), пурпурное]. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Настоящий протокол позволял проводить 3D-визуализацию всей почки различных структур, таких как симпатические нервы, собирающие протоки, артерии, проксимальные канальцы и клубочки 9,10,11. Этот метод окрашивания предложил макроскопическое наблюдение и привел к новым биологическим открытиям, визуализируя изменение почечных симпатических нервов после ишемии-реперфузионного повреждения 9,10 и гломеруломегалии в начальной стадии диабетической болезни почек11.
Непрозрачность выводится из оптической неоднородности в ткани5. Общим принципом различных методов очистки тканей является удаление рассеивателей /поглотителей света и заполнение пространства реагентами, соответствующими RI. По сравнению с методами на основе органических растворителей, такими как 3D-визуализация органов, очищенных растворителем (3DISCO/iDISCO)3,14, CUBIC основан на гидрофильных реагентах и, таким образом, превосходит флуоресцентную сохранность5. Эта характеристика CUBIC позволяет исследователям наблюдать флуоресцентные сигналы от репортерных штаммов мыши2, а также сигналы от иммунофлуоресцентного окрашивания, предоставляя больше возможностей для всестороннего понимания структур 3D-органов.
Настоящий протокол очистки тканей на основе CUBIC может достичь высокой прозрачности для 3D-визуализации по сравнению с предыдущим исследованием очистки почек мышей15. Тем не менее, следует отметить, что этот протокол очистки подходит для почек мыши. Более сильный процесс делипидации необходим для очистки почек человека. Например, Zhao et al. недавно представили подход к картированию интактных органов человека путем разработки эффективного метода очистки тканей под названием SHANEL (small-micelle-mediated human organ efficient clearing and labeling)16. Поскольку более сильная делипидация повреждает образцы, исследователи должны выбрать подходящий метод очистки тканей в соответствии с их назначением.
Окрашивание органов с цельным креплением является сложной задачей из-за трудностей в проникновении антител; настоящий протокол был разработан после проб и ошибок. Поскольку стабильность окрашивания является приоритетной, время инкубации может быть больше, чем требуемый минимум. В результате этот протокол продемонстрировал высококачественное окрашивание почек антителами. Тем не менее, существует вероятность того, что он может не работать хорошо, в зависимости от целевых антигенов, которые мы не пробовали. Недавнее исследование показало, что двухэтапное окрашивание с использованием первичных и вторичных антител, подобных текущему протоколу, не является оптимальным в некоторых случаях для окрашивания мозга мыши17. Это связано с тем, что когда целевое количество велико, его первичное антитело заполняет образец, затрудняя проникновение вторичного антитела глубоко вткань 17. Таким образом, флуоресцентно меченое первичное антитело, или комплекс первичного антитела и вторичного фрагмента Fab17, стоит попробовать, если проникновение антител неэффективно.
Что касается процесса визуализации, исследователи должны выбрать соответствующий тип микроскопии и разрешение изображения в соответствии с их назначением. Если исследователи хотят провести 3D-визуализацию всей почки, как представлено в этом исследовании, лучше использовать флуоресцентную микроскопию, потому что она может быстро получать широкие изображения z-стека с низким уровнем фотоотбеливания. Поскольку размер файла данных 3D-визуализации огромен, разрешение изображения должно быть уменьшено до такой степени, что может выдержать визуализация всего органа. Напротив, исследователи также могут использовать конфокальные или многофотонные микроскопии при получении данных 3D-изображений с высоким разрешением в узком пространстве.
В заключение, текущее исследование разработало полностью установленное окрашивание почек для 3D-визуализации с помощью метода очистки тканей CUBIC. Протокол позволяет визуализировать 3D-структуры во всей почке, обеспечивая макроскопическую перспективу для исследования почек.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Часть этой работы была проведена в сотрудничестве с профессором Хироки Р. Уэда (Токийский университет), профессором Эцуо А. Сусаки (Университет Дзюнтендо), профессором Тецухиро Танака (Университет Тохоку), профессором Масафуми Фукагава, доктором Такехико Вада и доктором Хиротакой Комаба (Университет Токай).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube | Falcon | 352059 | Tissue clearing, staining, wash |
| 2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine | Tokyo Chemical Industry | D1876 | CUBIC-R+ |
| 37%-Formaldehyde Solution | Nacalai Tesque | 16223-55 | Post fixation |
| 4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Nacalai Tesque | 09154-85 | Kidney fixation |
| Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody | Invitrogen | A-21436 | Secondary antibody (1:100) |
| Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | A-31573 | Secondary antibody (1:200) |
| Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody | Abcam | ab199975 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-podocin antibody | Sigma-Aldrich | P0372 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody | Abcam | ab85626 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody | Abcam | ab113 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody | Abcam | ab5694 | Primary antibody (1:200) |
| Blocker Casein in PBS | Thermo Fisher Scientific | 37528 | Staining buffer |
| Butorphanol Tartrate | Meiji | 005526 | Anesthetic |
| C57BL/6NJcl | Nippon Bio-Supp.Center | N/A | Mouse strain |
| Imaris | Bitplane | N/A | Imaging analysis software |
| Macro-zoom microscope | OLYMPUS | MVX10 | The observation unit of the custom-built microscope |
| Medetomidine Hydrochloride | Kyoritsu-Seiyaku | 008656 | Anesthetic |
| Midazolam | SANDOZ | 27803229 | Anesthetic |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Immersion oil |
| N-buthyldiethanolamine | Tokyo Chemical Industry | B0725 | CUBIC-L, CUBIC-R+ |
| Nicotinamide | Tokyo Chemical Industry | N0078 | CUBIC-R+ |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | CUBIC-L, PBST |
| Silicon oil HIVAC-F4 | Shin-Etsu Chemical | 50449832 | Immersion oil |
| Sodium azide | Wako | 195-11092 | Staining buffer |
References
- Velez-Fort, M., et al. The stimulus selectivity and connectivity of layer six principal cells reveals cortical microcircuits underlying visual processing. Neuron. 83 (6), 1431-1443 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Tainaka, K., et al. Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Hasegawa, S., et al. Comprehensive three-dimensional analysis (CUBIC-kidney) visualizes abnormal renal sympathetic nerves after ischemia/reperfusion injury. Kidney International. 96 (1), 129-138 (2019).
- Hasegawa, S., Inoue, T., Inagi, R. Neuroimmune interactions and kidney disease. Kidney Research and Clinical Practice. 38 (3), 282-294 (2019).
- Hasegawa, S., et al. The oral hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor enarodustat counteracts alterations in renal energy metabolism in the early stages of diabetic kidney disease. Kidney International. 97 (5), 934-950 (2020).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hasegawa, S., et al. Activation of sympathetic signaling in macrophages blocks systemic inflammation and protects against renal ischemia-reperfusion injury. Journal of the American Society of Nephrology. 32 (7), 1599-1615 (2021).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1-22 (2020).
