Summary
Den nuværende protokol beskriver en vævsrensningsmetode og helmonteret immunfluorescerende farvning til tredimensionel (3D) nyrebilleddannelse. Denne teknik kan tilbyde makroskopiske perspektiver i nyrepatologi, hvilket fører til nye biologiske opdagelser.
Abstract
Selvom konventionel patologi gav mange oplysninger om nyremikrostruktur, var det svært at kende den præcise struktur af blodkar, proksimale tubuli, opsamlingskanaler, glomeruli og sympatiske nerver i nyrerne på grund af manglen på tredimensionel (3D) information. Optisk clearing er en god strategi til at overvinde denne store forhindring. Flere celler i et helt organ kan analyseres ved enkeltcelleopløsning ved at kombinere vævsrensning og 3D-billeddannelsesteknik. Imidlertid forbliver cellemærkningsmetoder til helorganbilleddannelse underudviklede. Især er helmonteret organfarvning udfordrende på grund af vanskeligheden ved antistofindtrængning. Den nuværende protokol udviklede en helmonteret musenyrefarvning til 3D-billeddannelse med CUBIC (Clear, Unobstructed Brain / Body Imaging Cocktails and Computational analysis) vævsrensningsmetode. Protokollen har muliggjort visualisering af nyresympatisk denervation efter iskæmi-reperfusionsskade og glomerulomegali i det tidlige stadium af diabetisk nyresygdom fra et omfattende synspunkt. Således kan denne teknik føre til nye opdagelser inden for nyreforskning ved at give et makroskopisk perspektiv.
Introduction
Nyren består af forskellige cellepopulationer. Selvom konventionel patologi giver os meget information om nyremikromiljøet, er tredimensionel (3D) billeddannelse nødvendig for præcist at forstå den intercellulære krydstale under nyresygdomsprogression. Tidligere skulle der udføres et stort antal seriel sektionering og billedrekonstruktion til hele orglet 3D-billeddannelse1. Denne metode krævede imidlertid for meget indsats og havde problemer med hensyn til reproducerbarhed.
Optisk clearing er en god strategi til at overvinde denne forhindring 2,3. Vævsopacitet skyldes hovedsageligt lysspredning og absorption, fordi hvert organ består af forskellige stoffer, herunder vand, protein og lipider. Således erstatter den grundlæggende strategi for vævsrensning vand og lipider i væv med brydningsindeks (RI) matchende reagenser, der har de samme optiske egenskaber som proteiner4. For at observere en gennemsigtig prøve er en lysark fluorescerende mikroskopi nyttig5. Lysark belyser den gennemsigtige prøve fra siden, og excitationssignaler erhverves gennem objektivlinsen placeret i lodret position6. Denne mikroskopi opnår tværsnitsinformation i en enkelt fejning, som adskiller sig fra den konfokale eller multifoton fluorescerende mikroskopi. Således kan den hurtigt erhverve z-stack-billeder med et lavt niveau af fotobleaching.
Clear, Unobstructed Brain / Body Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) er en af de vævsrensningsmetoder, der muliggør helorganbilleddannelse ved lysark fluorescerende mikroskopi 2,7,8. CUBIC og helmonteret immunfluorescerende farvning er optimeret i denne undersøgelse til at visualisere musenyre 3D-strukturer 9,10,11. Ved hjælp af denne helmonterede farvningsmetode visualiseres ændringen i nyresympatiske nerver efter iskæmi-reperfusionsskade 9,10 og glomerulomegali i det tidlige stadium af diabetisk nyresygdom 11 samt blodkar, proksimale tubuli og opsamlingskanaler i en hel nyre9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter blev godkendt af University of Tokyo Institutional Review Board. Alle dyreforsøg blev udført i henhold til National Institutes of Health retningslinjer. C57BL/6NJcl-hanmus, 8 uger gamle, blev anvendt til denne undersøgelse. Musene blev hentet fra kommercielle kilder (se Materialetabel).
1. Dyreforberedelse og nyrefiksering
- Udfør perfusionsfiksering ved at følge nedenstående trin.
- Anæstetik musen ved indånding af isofluran (3%, 2,0 L/min) og intraperitoneal administration af medetomidinhydrochlorid (0,3 mg/kg), butorphanol-tartrat (5 mg/kg) og midazolam (4 mg/kg) (se materialetabel).
- Dyret perfuses med 20 ml PBS (pH 7,4) og 30 ml 4% PFA i fosfatbuffer (PB) gennem hjertets venstre ventrikel12.
- Udfør nedsænkningsfiksering lige efter perfusionsfiksering og nyreprøvetagning9.
- Nyren nedsænkes i 4% PFA ved 4 °C i yderligere 16 timer, og vask den derefter med PBS i 2 timer (tre gange)9 (figur 1).
FORSIGTIG: Formaldehyd og paraformaldehyd er giftige irriterende stoffer. Håndter reagenser i en røghætte med passende personlige værnemidler.
- Nyren nedsænkes i 4% PFA ved 4 °C i yderligere 16 timer, og vask den derefter med PBS i 2 timer (tre gange)9 (figur 1).
2. Affarvning og delipidering
- Forbered CUBIC-L til affarvning og delipidering bestående af 10 vægt% Triton X-100 og 10 vægt% N-buthyldiethanolamin (se Materialetabel) efter tidligere offentliggjorte rapporter 4,8,9.
- Udfør affarvning og delipidering af CUBIC-L ved at følge nedenstående trin.
- Nedsænk den faste nyre i 7 ml 50% (v / v) CUBIC-L (1: 1 blanding af vand og CUBIC-L) i et 14 ml rundt bundrør (se Materialetabel) med blid omrystning ved stuetemperatur i 6 timer (figur 2A). Derefter nedsænkes det i 7 ml CUBIC-L i et 14 ml rundt bundrør med blid omrystning ved 37 ° C i 5 dage.
- Opdater CUBIC-L hver dag under denne proces. Efter affarvnings- og delipideringsprocessen vaskes nyren med PBS ved stuetemperatur i 2 timer (tre gange)9 (figur 1). Brug en dispenseringsske til prøvehåndtering (figur 2B).
3. Helmonteret immunfluorescerende farvning
- Forbered farvningsbuffere.
- Forbered farvningsbufferen til primære antistoffer ved at blande 0,5% (v/v) Triton X-100, 0,5% kasein i PBS og 0,05% natriumazid9.
- Forbered farvningsbufferen til sekundære antistoffer ved at blande 0,5% (v/v) Triton X-100, 0,1% kasein i PBS og 0,05% natriumazid9.
- Udfør farvning med primære antistoffer.
- Immunostain den delipiderede nyre med primære antistoffer (1:100 eller 1:200, se Materialetabel) i farvningsbufferen ved 37 °C med blid omrystning i 7 dage.
BEMÆRK: Mængden af farvningsbufferen, der er nødvendig for en nyre, er 500-600 μL (figur 2C). - Nyren vaskes med 0,5% (v/v) Triton X-100 i PBS (PBST) ved stuetemperatur i 1 dag9 (figur 1).
- Immunostain den delipiderede nyre med primære antistoffer (1:100 eller 1:200, se Materialetabel) i farvningsbufferen ved 37 °C med blid omrystning i 7 dage.
- Udfør farvning med sekundære antistoffer.
- Immunostain nyren med sekundære antistoffer (1:100 eller 1:200, se Materialetabel) i farvningsbufferen ved 37 °C med skånsom omrystning i 7 dage. Nyren vaskes med PBST ved stuetemperatur i 1 dag9 (figur 1).
- Efter fiksering9 nedsænkes nyren i 1% formaldehyd i PB (1:36 blanding af 37% formaldehyd og PB) i 3 timer, og vask den med PBS ved stuetemperatur i 6 timer (figur 1).
4. Matchning af brydningsindeks (RI)
- Forbered CUBIC-R+.
- Der fremstilles CUBIC-R ved at blande 45 vægt% 2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolon/antipyrin og 30 vægt% nikotinamid (se materialetabel).
- Forbered CUBIC-R+ til brydningsindeks (RI) matchning ved at tilføje 0,5 v% N-buthyldiethanolamin til CUBIC-R efter de tidligere offentliggjorte rapporter 4,8,9.
- Udfør RI-matchningen.
- Nedsænk nyren i 7 ml 50% (v / v) CUBIC-R + (1: 1 blanding af vand og CUBIC-R +) i et 14 ml rundt bundrør med blid omrystning ved stuetemperatur i 1 dag. Derefter nedsænkes det i 7 ml CUBIC-R + i et 14 ml rundt bundrør med blid omrystning ved stuetemperatur i 2 dage9 (figur 1).
BEMÆRK: Selvom nyren flyder i 50% CUBIC-R+ i begyndelsen af RI-matchningen, synker den og bliver gennemsigtig i CUBIC-R+ i slutningen af processen (figur 2D).
- Nedsænk nyren i 7 ml 50% (v / v) CUBIC-R + (1: 1 blanding af vand og CUBIC-R +) i et 14 ml rundt bundrør med blid omrystning ved stuetemperatur i 1 dag. Derefter nedsænkes det i 7 ml CUBIC-R + i et 14 ml rundt bundrør med blid omrystning ved stuetemperatur i 2 dage9 (figur 1).
5. Erhvervelse og rekonstruktion af billeder
- Nedsænk den RI-matchede nyre i en blanding af siliciumolie (RI = 1.555) og mineralolie (RI = 1.467) (55:45) under billedoptagelse (RI = 1.51)5 (figur 3).
- Få 3D-billeder af hele nyren med et specialbygget9 lysark fluorescerende mikroskop (se Materialetabel). Saml alle rå billeddata i et 16-bit TIFF-format. Visualiser og optag de 3D-gengivne billeder med billedanalysesoftwaren (Imaris, se Materialetabel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af denne farvningsmetode blev sympatiske nerver [anti-tyrosinhydroxylase (TH) antistof] og arterier [anti-α-glat muskelactin (αSMA) antistof] i en hel nyre (figur 4A, B og video 1) visualiseret9. Unormale nyresympatiske nerver blev også visualiseret efter iskæmi/reperfusionsskade (IRI)9,10 (figur 4C). Desuden blev visualisering af sympatiske nerver i hele milten13 opnået ved hjælp af denne protokol (figur 4D). Et eksempel på kvantificering af 3D-immunfluorescerende data er vist i figur 5.
Derudover var visualisering af opsamlingskanaler [anti-aquaporin 2 (AQP2) antistof], S1-segmentet af proksimale tubuli [anti-natriumglucose cotransporter 2 (SGLT2) antistof] og glomeruli (anti-podocin-antistof) i en hel nyre9 vellykket (figur 6A). Ved hjælp af denne 3D-billeddannelse af glomeruli blev glomerulomegali (anti-podocin-antistof) visualiseret i de tidlige stadier af diabetisk nyresygdom, som blev undertrykt ved lægemiddeladministration11 (figur 6B).
Figur 1: Vævsrensning og helmonteret immunfluorescerende farvning. Vævsrensning af CUBIC er en to-trins proces: delipidation (CUBIC-L) og brydningsindeks (RI) matchning (CUBIC-R +). Helmonteret farvning udføres efter delipideringsprocessen. Skalastang = 10 mm. Billedet er gengivet fra Hasegawa et al.9. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Billeder af håndteringsprocessen . (A) Prøven nedsænkes i 7 ml 50% eller 100% CUBIC-L i et 14 ml rundt bundrør. Røret holdes vandret med blid omrystning under delipideringsprocessen. (B) En dispenseringsske anvendes til prøvehåndtering. (C) Mængden af farvningsbufferen, der er nødvendig for en nyre, er 500-600 μL. Røret holdes lodret under farvningsprocessen. (D) Selv om prøven flyder i 50 % KUBIC-R+ i begyndelsen af RI-matchningen, synker den og bliver gennemsigtig i CUBIC-R+ ved afslutningen af processen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Lysark fluorescerende mikroskopi til 3D-billeddannelse af hele nyrerne. Lysarkfluorescerende mikroskopi (LSFM) muliggør tredimensionel (3D) billeddannelse af gennemsigtige prøver. Dette billede er gengivet fra Hasegawa et al.9. Nedsænkningsolie bruges under dataindsamling. Lysark fra begge sider belyser prøven. Excitationssignalerne erhverves gennem objektivlinsen placeret i lodret position. Scenen bevæger sig i aksial retning, og z-stack-billeder opnås. Skalastang = 10 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4. Hele nyre tredimensionel billeddannelse af sympatiske nerver og arterier. (A) Sympatiske nerver [anti-tyrosinhydroxylase (TH) antistof, grønt] og arterier [anti-α-glat muskelactin (αSMA) antistof, magenta] visualiseres i en hel nyre. (B) Det forstørrede x-y planbillede af (A) er vist [anti-TH-antistof, grønt; anti-αSMA-antistof, magenta]. (C) Vedvarende denervation efter nyreiskæmi-reperfusionsskade (IRI) visualiseres. (D) Sympatiske nerver i en milt visualiseres også i en hel milt af den nuværende protokol. Dette billede er gengivet fra Hasegawa et al.9. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Kvantificering af tredimensionel immunfluorescerende farvning. Processen med at kvantificere forholdet mellem signalpositivt volumen og total nyrevolumen vises. Binær konvertering udføres i henhold til hver tærskel. Volumenerne opnås ved at beregne integralet af interesseområdet (voxelstørrelse: x = 6, 45 μm, y = 6, 45 μm, z = 7 μm). Billedet er gengivet fra Hasegawa et al.9. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Hele nyre tredimensionel billeddannelse af opsamlingskanaler, proksimale tubuli og glomeruli. (A) Indsamling af kanaler [anti-aquaporin 2 (AQP2) antistof], S1-segment af proksimale tubuli [anti-natriumglucose cotransporter 2 (SGLT2) antistof] og glomeruli (anti-podocin-antistof) visualiseres henholdsvis i en hel nyre. Billedet er gengivet fra Hasegawa et al.9. (B) Glomerulomegali observeres i det tidlige stadium af diabetisk nyresygdom (anti-podocin-antistof), som undertrykkes ved lægemiddeladministration. Billedet er gengivet fra Hasegawa et al.11. Klik her for at se en større version af denne figur.
Video 1: Roterende film af nyrerne. Den roterende film af nyren i figur 4A er vist. Sympatiske nerver [anti-tyrosinhydroxylase (TH) antistof, grønt] og arterier [anti-α-glat muskel actin (αSMA) antistof, magenta] visualiseres. Klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nuværende protokol tillod 3D-billeddannelse af hele nyrerne af forskellige strukturer såsom sympatiske nerver, opsamlingskanaler, arterier, proksimale tubuli og glomeruli 9,10,11. Denne farvningsmetode tilbød makroskopisk observation og førte til nye biologiske opdagelser ved at visualisere ændringen i nyresympatiske nerver efter iskæmi-reperfusionsskade 9,10 og glomerulomegali i den indledende fase af diabetisk nyresygdom 11.
Opacitet er afledt af optisk inhomogenitet i et væv5. Det almindelige princip for forskellige vævsrensningsmetoder er at fjerne lysspredere / absorbenter og opfylde rummet med RI-matchende reagenser. Sammenlignet med organiske opløsningsmiddelbaserede metoder såsom 3D-billeddannelse af opløsningsmiddelryddede organer (3DISCO/iDISCO)3,14 er CUBIC baseret på hydrofile reagenser og er dermed overlegen i fluorescerende konservering5. Denne egenskab ved CUBIC gør det muligt for forskere at observere fluorescerende signaler fra reportermusstammer2 samt signaler fra helmonteret immunfluorescerende farvning, hvilket giver flere muligheder for en omfattende forståelse af 3D-organstrukturerne.
Den nuværende CUBIC-baserede vævsclearingprotokol kan opnå høj gennemsigtighed for 3D-billeddannelse sammenlignet med tidligere forskning i rensning af musenyrer15. Det skal dog bemærkes, at denne clearingprotokol er velegnet til musenyrer. En stærkere delipideringsproces er nødvendig for at rydde menneskelige nyrer. For eksempel præsenterede Zhao et al. for nylig en tilgang til kortlægning af intakte menneskelige organer ved at udvikle den effektive vævsclearingmetode ved navn SHANEL (small-micelle-medieret human organ efficient clearing and labeling)16. Som stærkere delipidation skader prøver, forskere nødt til at vælge en passende væv clearing metode i henhold til deres formål.
Helmonteret organfarvning er udfordrende på grund af vanskeligheden ved antistofindtrængning; Den nuværende protokol er blevet etableret efter forsøg og fejl. Da farvningsstabiliteten prioriteres, kan inkubationstiden være længere end det krævede minimum. Som et resultat har denne protokol demonstreret højkvalitets helmonteret farvning af nyrerne ved antistofferne. Der er dog en mulighed for, at det muligvis ikke fungerer godt, afhængigt af målantigenerne, som vi ikke har prøvet. En nylig undersøgelse har vist, at totrinsfarvning ved hjælp af primære og sekundære antistoffer som den nuværende protokol i nogle tilfælde ikke er optimal til helmonteret farvning af musehjerner17. Dette skyldes, at når målmængden er stor, fylder dets primære antistof prøven, hvilket gør det vanskeligt for det sekundære antistof at trænge dybt ind i vævet17. Således er det fluorescerende mærkede primære antistof eller komplekset af det primære antistof og det sekundære Fab-fragment17 værd at prøve, hvis penetrationen af antistoffer ikke er effektiv.
Hvad angår billeddannelsesprocessen, skal forskere vælge en passende type mikroskopi og billedopløsning i henhold til deres formål. Hvis forskere ønsker at udføre 3D-billeddannelse af hele nyrerne som præsenteret i denne undersøgelse, er det bedre at bruge lysark fluorescerende mikroskopi, fordi det hurtigt kan erhverve brede z-stack-billeder med et lavt niveau af fotobleaching. Da filstørrelsen på 3D-billeddata er enorm, bør billedopløsningen reduceres i det omfang, som helorganbilleddannelse kan stå. I modsætning hertil kan forskere også bruge konfokale eller multifotonmikroskopier, når de får 3D-billeddata med høj opløsning i smalt rum.
Afslutningsvis har den nuværende undersøgelse udviklet helmonteret nyrefarvning til 3D-billeddannelse med vævsrensningsmetoden CUBIC. Protokollen tillader visualisering af 3D-strukturer i en hel nyre, hvilket giver et makroskopisk perspektiv til nyreforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
En del af dette arbejde blev udført gennem samarbejde med Prof. Hiroki R. Ueda (University of Tokyo), Prof. Etsuo A. Susaki (Juntendo University), Prof. Tetsuhiro Tanaka (Tohoku University), Prof. Masafumi Fukagawa, Dr. Takehiko Wada og Dr. Hirotaka Komaba (Tokai University).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube | Falcon | 352059 | Tissue clearing, staining, wash |
| 2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine | Tokyo Chemical Industry | D1876 | CUBIC-R+ |
| 37%-Formaldehyde Solution | Nacalai Tesque | 16223-55 | Post fixation |
| 4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Nacalai Tesque | 09154-85 | Kidney fixation |
| Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody | Invitrogen | A-21436 | Secondary antibody (1:100) |
| Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | A-31573 | Secondary antibody (1:200) |
| Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody | Abcam | ab199975 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-podocin antibody | Sigma-Aldrich | P0372 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody | Abcam | ab85626 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody | Abcam | ab113 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody | Abcam | ab5694 | Primary antibody (1:200) |
| Blocker Casein in PBS | Thermo Fisher Scientific | 37528 | Staining buffer |
| Butorphanol Tartrate | Meiji | 005526 | Anesthetic |
| C57BL/6NJcl | Nippon Bio-Supp.Center | N/A | Mouse strain |
| Imaris | Bitplane | N/A | Imaging analysis software |
| Macro-zoom microscope | OLYMPUS | MVX10 | The observation unit of the custom-built microscope |
| Medetomidine Hydrochloride | Kyoritsu-Seiyaku | 008656 | Anesthetic |
| Midazolam | SANDOZ | 27803229 | Anesthetic |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Immersion oil |
| N-buthyldiethanolamine | Tokyo Chemical Industry | B0725 | CUBIC-L, CUBIC-R+ |
| Nicotinamide | Tokyo Chemical Industry | N0078 | CUBIC-R+ |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | CUBIC-L, PBST |
| Silicon oil HIVAC-F4 | Shin-Etsu Chemical | 50449832 | Immersion oil |
| Sodium azide | Wako | 195-11092 | Staining buffer |
References
- Velez-Fort, M., et al. The stimulus selectivity and connectivity of layer six principal cells reveals cortical microcircuits underlying visual processing. Neuron. 83 (6), 1431-1443 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Tainaka, K., et al. Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Hasegawa, S., et al. Comprehensive three-dimensional analysis (CUBIC-kidney) visualizes abnormal renal sympathetic nerves after ischemia/reperfusion injury. Kidney International. 96 (1), 129-138 (2019).
- Hasegawa, S., Inoue, T., Inagi, R. Neuroimmune interactions and kidney disease. Kidney Research and Clinical Practice. 38 (3), 282-294 (2019).
- Hasegawa, S., et al. The oral hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor enarodustat counteracts alterations in renal energy metabolism in the early stages of diabetic kidney disease. Kidney International. 97 (5), 934-950 (2020).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hasegawa, S., et al. Activation of sympathetic signaling in macrophages blocks systemic inflammation and protects against renal ischemia-reperfusion injury. Journal of the American Society of Nephrology. 32 (7), 1599-1615 (2021).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1-22 (2020).
