Summary
Denne protokollen beskriver en vevsryddingsmetode og helmontert immunfluorescerende farging for tredimensjonal (3D) nyreavbildning. Denne teknikken kan tilby makroskopiske perspektiver i nyrepatologi, noe som fører til nye biologiske funn.
Abstract
Selv om konvensjonell patologi ga mange opplysninger om nyremikrostruktur, var det vanskelig å vite den nøyaktige strukturen til blodkar, proksimale tubuli, samlekanaler, glomeruli og sympatiske nerver i nyrene på grunn av mangel på tredimensjonal (3D) informasjon. Optisk clearing er en god strategi for å overvinne denne store hindringen. Flere celler i et helt organ kan analyseres ved enkeltcelleoppløsning ved å kombinere vevsrydding og 3D-avbildningsteknikk. Imidlertid forblir cellemerkingsmetoder for helorganavbildning underutviklet. Spesielt er helmontert organfarging utfordrende på grunn av vanskeligheten med antistoffpenetrasjon. Den nåværende protokollen utviklet en helmontert mus nyrefarging for 3D-avbildning med CUBIC (Clear, Unobstructed Brain / Body Imaging Cocktails and Computational analysis) vevsryddingsmetode. Protokollen har gjort det mulig å visualisere renal sympatisk denervering etter iskemi-reperfusjonsskade og glomerulomegali i tidlig stadium av diabetisk nyresykdom fra et omfattende synspunkt. Dermed kan denne teknikken føre til nye funn i nyreforskning ved å gi et makroskopisk perspektiv.
Introduction
Nyren består av ulike cellepopulasjoner. Selv om konvensjonell patologi gir oss mye informasjon om nyremikromiljøet, er det nødvendig med tredimensjonal (3D) avbildning for å forstå den intercellulære krysstalen under nyresykdomsprogresjon. Tidligere måtte et stort antall serielle seksjonerings- og bilderekonstruksjoner utføres for 3D-avbildningen av hele orgelet1. Denne metoden krevde imidlertid for mye innsats og hadde problemer med hensyn til reproduserbarhet.
Optisk clearing er en god strategi for å overvinne denne hindringen 2,3. Vevsopasitet skyldes hovedsakelig lysspredning og absorpsjon fordi hvert organ består av forskjellige stoffer, inkludert vann, protein og lipider. Dermed er den grunnleggende strategien for vevsrydding å erstatte vann og lipider i vev med brytningsindeks (RI) matchende reagenser som har samme optiske egenskaper som proteiner4. For å observere en gjennomsiktig prøve, er et lysark fluorescerende mikroskopi nyttig5. Lysark lyser opp den gjennomsiktige prøven fra siden, og eksitasjonssignaler oppnås gjennom objektivlinsen plassert i vertikal stilling6. Denne mikroskopien får tverrsnittsinformasjon i en enkelt feie, som er forskjellig fra konfokal eller multifoton fluorescerende mikroskopi. Dermed kan den raskt skaffe z-stack-bilder med lavt nivå av fotobleking.
Clear, Unobstructed Brain / Body Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) er en av vevsryddingsmetodene som muliggjør helorganavbildning ved lysarkfluorescerende mikroskopi 2,7,8. CUBIC og helmontert immunfluorescerende farging er optimalisert i denne studien for å visualisere mus nyre 3D strukturer 9,10,11. Ved hjelp av denne helmonterte fargemetoden visualiseres endringen i nyresympatiske nerver etter iskemi-reperfusjonsskade 9,10 og glomerulomegali i tidlig stadium av diabetisk nyresykdom 11, samt blodkar, proksimale tubuli og samlekanaler i en hel nyre9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter ble godkjent av University of Tokyo Institutional Review Board. Alle dyreprosedyrer ble utført i henhold til National Institutes of Health retningslinjer. Mannlige C57BL/6NJcl-mus, 8 uker gamle, ble brukt i denne studien. Musene ble hentet fra kommersielle kilder (se materialtabell).
1. Dyrepreparat og nyrefiksering
- Utfør perfusjonsfiksering ved å følge trinnene nedenfor.
- Bedøv musen ved inhalasjon av isofluran (3 %, 2,0 l/min) og intraperitoneal administrering av medetomidinhydroklorid (0,3 mg/kg), butorfanoltartrat (5 mg/kg) og midazolam (4 mg/kg) (se materialfortegnelse).
- Persuse dyret med 20 ml PBS (pH 7,4) og 30 ml 4% PFA i fosfatbuffer (PB) gjennom hjertets venstre ventrikel12.
- Utfør nedsenkningsfiksering like etter perfusjonsfiksering og nyreprøve9.
- Senk nyrene i 4% PFA ved 4 ° C i ytterligere 16 timer, vask den deretter med PBS i 2 timer (tre ganger) 9 (figur 1).
FORSIKTIG: Formaldehyd og paraformaldehyd er giftige irriterende stoffer. Håndter reagenser i en avtrekksvifte med passende personlig verneutstyr.
- Senk nyrene i 4% PFA ved 4 ° C i ytterligere 16 timer, vask den deretter med PBS i 2 timer (tre ganger) 9 (figur 1).
2. Avfarging og delipidering
- Forbered CUBIC-L for avfarging og delipidering bestående av 10 vekt% Triton X-100 og 10 vekt% N-butyldietanolamin (se materialtabell), etter tidligere publiserte rapporter 4,8,9.
- Utfør avfarging og delipidering av CUBIC-L ved å følge trinnene nedenfor.
- Senk den faste nyren i 7 ml 50% (v / v) CUBIC-L (1: 1 blanding av vann og CUBIC-L) i et 14 ml rundbunnsrør (se materialtabell) med forsiktig risting ved romtemperatur i 6 timer (figur 2A). Senk den deretter i 7 ml CUBIC-L i et 14 ml rundbunnsrør med forsiktig risting ved 37 ° C i 5 dager.
- Oppdater CUBIC-L hver dag under denne prosessen. Etter avfargings- og delipideringsprosessen, vask nyrene med PBS ved romtemperatur i 2 timer (tre ganger)9 (figur 1). Bruk en dispenseringsskje til prøvehåndtering (figur 2B).
3. Helmontert immunfluorescerende farging
- Forbered fargebufferne.
- Forbered fargebufferen for primære antistoffer ved å blande 0,5 % (v/v) Triton X-100, 0,5 % kasein i PBS og 0,05 % natriumazid9.
- Forbered fargebufferen for sekundære antistoffer ved å blande 0,5 % (v/v) Triton X-100, 0,1 % kasein i PBS og 0,05 % natriumazid9.
- Utfør farging med primære antistoffer.
- Immunstain den delipiderte nyren med primære antistoffer (1:100 eller 1:200, se materialtabell) i fargebufferen ved 37 °C med forsiktig risting i 7 dager.
MERK: Mengden av fargebufferen som trengs for en nyre er 500-600 μL (figur 2C). - Vask nyrene med 0,5 % (v/v) Triton X-100 i PBS (PBST) ved romtemperatur i 1 dag9 (figur 1).
- Immunstain den delipiderte nyren med primære antistoffer (1:100 eller 1:200, se materialtabell) i fargebufferen ved 37 °C med forsiktig risting i 7 dager.
- Utfør farging med sekundære antistoffer.
- Immunstain nyrene med sekundære antistoffer (1:100 eller 1:200, se Materialtabell) i fargebufferen ved 37 °C med forsiktig risting i 7 dager. Vask nyrene med PBST ved romtemperatur i 1 dag9 (figur 1).
- Etter fiksering9, senk nyrene i 1% formaldehyd i PB (1:36 blanding av 37% formaldehyd og PB) i 3 timer, og vask den med PBS ved romtemperatur i 6 timer (figur 1).
4. Samsvar med brytningsindeks (RI)
- Forbered CUBIC-R+.
- Forbered CUBIC-R ved å blande 45 vekt% av 2,3-dimetyl-1-fenyl-5-pyrazolon / antipyrin og 30 vekt% nikotinamid (se tabell over materialer).
- Forbered CUBIC-R + for brytningsindeksmatching (RI) ved å legge til 0,5 v% N-butyldietanolamin til CUBIC-R etter de tidligere publiserte rapportene 4,8,9.
- Utfør RI-matchingen.
- Senk nyrene i 7 ml 50% (v / v) CUBIC-R + (1: 1 blanding av vann og CUBIC-R +) i et 14 ml rundt bunnrør med forsiktig risting ved romtemperatur i 1 dag. Senk den deretter i 7 ml CUBIC-R+ i et 14 ml rundbunnsrør med forsiktig risting ved romtemperatur i 2 dager9 (figur 1).
MERK: Selv om nyrene flyter i 50% CUBIC-R + i begynnelsen av RI-matchingen, synker den og blir gjennomsiktig i CUBIC-R + på slutten av prosessen (figur 2D).
- Senk nyrene i 7 ml 50% (v / v) CUBIC-R + (1: 1 blanding av vann og CUBIC-R +) i et 14 ml rundt bunnrør med forsiktig risting ved romtemperatur i 1 dag. Senk den deretter i 7 ml CUBIC-R+ i et 14 ml rundbunnsrør med forsiktig risting ved romtemperatur i 2 dager9 (figur 1).
5. Bildeoppkjøp og rekonstruksjon
- Senk den RI-matchede nyren i en blanding av silisiumolje (RI = 1,555) og mineralolje (RI = 1,467) (55:45) under bildeopptak (RI = 1,51)5 (figur 3).
- Skaff 3D-bilder av hele nyren med et spesialbygd9 lysarkfluorescerende mikroskop (se Materialtabell). Samle alle rå bildedata i et 16-biters TIFF-format. Visualiser og ta de 3D-gjengitte bildene med bildeanalyseprogramvaren (Imaris, se Materialfortegnelse).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av denne fargemetoden ble sympatiske nerver [anti-tyrosinhydroksylase (TH) antistoff] og arterier [anti-α-glatt muskelaktin (αSMA) antistoff] i en hel nyre (figur 4A, B og video 1) visualisert9. Unormale nyresympatiske nerver ble også visualisert etter iskemi/reperfusjonsskade (IRI)9,10 (figur 4C). Videre ble visualisering av sympatiske nerver i hele milten13 oppnådd ved hjelp av denne protokollen (figur 4D). Et eksempel på kvantifisering av 3D-immunfluorescerende data er vist i figur 5.
I tillegg var visualisering av oppsamlingskanaler [anti-akvaporin 2 (AQP2) antistoff], S1-segmentet av proksimale tubuli [antinatriumglukose-kotransportør 2 (SGLT2) antistoff] og glomeruli (anti-podocinantistoff) i en hel nyre9 vellykket (figur 6A). Ved hjelp av denne 3D-avbildningen av glomeruli ble glomerulomegali (anti-podocinantistoff) visualisert i de tidlige stadiene av diabetisk nyresykdom, som ble undertrykt av legemiddeladministrasjon11 (figur 6B).
Figur 1: Vevsrydding og helmontert immunfluoriserende farging. Vevsrydding ved CUBIC er en to-trinns prosess: delipidering (CUBIC-L) og brytningsindeks (RI) matching (CUBIC-R+). Helmontert farging utføres etter delipideringsprosessen. Skala bar = 10 mm. Bildet er gjengitt fra Hasegawa et al.9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Bilder av håndteringsprosessen . (A) Prøven er nedsenket i 7 ml 50% eller 100% CUBIC-L i et 14 ml rundbunnsrør. Røret holdes horisontalt med forsiktig risting under delipideringsprosessen. (B) En dispenseringsskje brukes til prøvehåndtering. (C) Mengden av fargebufferen som trengs for en nyre er 500-600 μL. Røret holdes vertikalt under fargeprosessen. (D) Selv om prøven flyter i 50% CUBIC-R + i begynnelsen av RI-matchingen, synker den og blir gjennomsiktig i CUBIC-R + på slutten av prosessen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Lysstofffluorescerende mikroskopi for full-nyre 3D-avbildning. Lysarkfluorescerende mikroskopi (LSFM) muliggjør tredimensjonal (3D) avbildning av gjennomsiktige prøver. Dette bildet er gjengitt fra Hasegawa et al.9. Immersion olje brukes under datainnsamling. Lysplater fra begge sider lyser opp prøven. Eksitasjonssignalene oppnås gjennom objektivlinsen i vertikal stilling. Scenen beveger seg i aksial retning, og z-stack-bilder oppnås. Skala bar = 10 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Hel-nyre tredimensjonal avbildning av sympatiske nerver og arterier. (A) Sympatiske nerver [anti-tyrosinhydroksylase (TH) antistoff, grønn] og arterier [anti-α-glatt muskelaktin (αSMA) antistoff, magenta] visualiseres i en hel nyre. (B) Det forstørrede x-y-planbildet av (A) er vist [anti-TH antistoff, grønt; anti-αSMA antistoff, magenta]. (C) Vedvarende denervering etter renal iskemi-reperfusjonsskade (IRI) er visualisert. (D) Sympatiske nerver i en milt er også visualisert i en hel milt av gjeldende protokoll. Dette bildet er gjengitt fra Hasegawa et al.9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Kvantifisering av tredimensjonal immunfluoriserende farging. Prosessen med å kvantifisere forholdet mellom signalpositivt volum og totalt nyrevolum er vist. Binær konvertering utføres i henhold til hver terskel. Volumene oppnås ved å beregne integralet av interesseområdet (voxelstørrelse: x = 6, 45 μm, y = 6, 45 μm, z = 7 μm). Bildet er gjengitt fra Hasegawa et al.9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Tredimensjonal avbildning av oppsamlingskanaler, proksimale tubuli og glomeruli. (A) Oppsamlingskanaler [anti-akvaporin 2 (AQP2) antistoff], S1 segment av proksimale tubuli [anti-natriumglukose cotransporter 2 (SGLT2) antistoff], og glomeruli (anti-podocin antistoff) er henholdsvis visualisert i en hel nyre. Bildet er gjengitt fra Hasegawa et al.9. (B) Glomerulomegali observeres i tidlig stadium av diabetisk nyresykdom (anti-podocin antistoff), som undertrykkes ved legemiddeladministrasjon. Bildet er gjengitt fra Hasegawa et al.11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Video 1: Roterende film av nyrene. Den roterende filmen av nyrene i figur 4A vises. Sympatiske nerver [anti-tyrosinhydroksylase (TH) antistoff, grønn] og arterier [anti-α-glatt muskelaktin (αSMA) antistoff, magenta] visualiseres. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nåværende protokollen tillot hel-nyre 3D-avbildning av ulike strukturer som sympatiske nerver, samlekanaler, arterier, proksimale tubuli og glomeruli 9,10,11. Denne fargemetoden tilbød makroskopisk observasjon og førte til nye biologiske funn, ved å visualisere endringen i nyresympatiske nerver etter iskemi-reperfusjonsskade 9,10 og glomerulomegali i begynnelsen av diabetisk nyresykdom 11.
Opasitet er avledet fra optisk inhomogenitet i et vev5. Det vanlige prinsippet for ulike vevsryddingsmetoder er å fjerne lysspredere / absorbenter og oppfylle plassen med RI-matchende reagenser. Sammenlignet med organiske løsningsmiddelbaserte metoder som 3D-avbildning av løsemiddelklarerte organer (3DISCO/iDISCO)3,14, er CUBIC basert på hydrofile reagenser, og er dermed overlegen i fluorescerende konservering5. Denne egenskapen til CUBIC gjør det mulig for forskere å observere fluorescerende signaler fra reportermusestammer2, samt signaler fra helmontert immunfluorescerende farging, noe som gir flere muligheter for en omfattende forståelse av 3D-organstrukturene.
Den nåværende KUBIC-baserte vevsavregningsprotokollen kan oppnå høy gjennomsiktighet for 3D-avbildning sammenlignet med tidligere musenyreryddingsforskning15. Det må imidlertid bemerkes at denne clearingprotokollen er egnet for mus nyrer. En sterkere delipideringsprosess er nødvendig for å fjerne menneskelige nyrer. For eksempel presenterte Zhao og medarbeidere nylig en tilnærming til intakt kartlegging av menneskelige organer ved å utvikle den effektive vevsryddingsmetoden kalt SHANEL (small-micelle-mediated human organ efficient clearing and labeling)16. Som sterkere delipideringsskader prøver, må forskere velge en passende vevsryddingsmetode i henhold til deres formål.
Helmontert organfarging er utfordrende på grunn av vanskeligheten med antistoffpenetrasjon; Denne protokollen er etablert etter prøving og feiling. Siden stabiliteten til farging prioriteres, kan inkubasjonstiden være lengre enn det minste som kreves. Som et resultat har denne protokollen vist høy kvalitet helmontert farging av nyrene av antistoffene. Det er imidlertid en mulighet for at det kanskje ikke fungerer bra, avhengig av målantigenene som vi ikke har prøvd. En nylig studie har vist at to-trinns farging ved bruk av primære og sekundære antistoffer som gjeldende protokoll ikke er optimal i noen tilfeller for helmontert farging av musehjerner17. Dette skyldes at når målmengden er stor, fyller det primære antistoffet prøven, noe som gjør det vanskelig for det sekundære antistoffet å trenge dypt inn i vevet17. Dermed er det fluorescerende merkede primære antistoffet, eller komplekset av det primære antistoffet og sekundært Fab-fragment17, verdt å prøve hvis penetrasjonen av antistoffer ikke er effektiv.
Når det gjelder bildebehandlingsprosessen, må forskerne velge en passende type mikroskopi og bildeoppløsning i henhold til deres formål. Hvis forskere ønsker å utføre helnyre 3D-bildebehandling som presentert i denne studien, er det bedre å bruke lysarkfluorescerende mikroskopi fordi det raskt kan skaffe seg brede z-stack-bilder med lavt nivå av fotobleking. Siden filstørrelsen på 3D-bildedata er enorm, bør bildeoppløsningen reduseres i den grad at helorganavbildning kan stå. I motsetning til dette kan forskere også bruke konfokale eller multifotonmikroskopier når de oppnår 3D-bildedata med høy oppløsning i trange rom.
Avslutningsvis har den nåværende studien utviklet helmontert nyrefarging for 3D-avbildning med vevsryddingsmetoden CUBIC. Protokollen tillater visualisering av 3D-strukturer i en hel nyre, noe som gir et makroskopisk perspektiv for nyreforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
En del av dette arbeidet ble utført gjennom samarbeid med Prof. Hiroki R. Ueda (University of Tokyo), Prof. Etsuo A. Susaki (Juntendo University), Prof. Tetsuhiro Tanaka (Tohoku University), Prof. Masafumi Fukagawa, Dr. Takehiko Wada, og Dr. Hirotaka Komaba (Tokai University).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube | Falcon | 352059 | Tissue clearing, staining, wash |
| 2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine | Tokyo Chemical Industry | D1876 | CUBIC-R+ |
| 37%-Formaldehyde Solution | Nacalai Tesque | 16223-55 | Post fixation |
| 4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Nacalai Tesque | 09154-85 | Kidney fixation |
| Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody | Invitrogen | A-21436 | Secondary antibody (1:100) |
| Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | A-31573 | Secondary antibody (1:200) |
| Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody | Abcam | ab199975 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-podocin antibody | Sigma-Aldrich | P0372 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody | Abcam | ab85626 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody | Abcam | ab113 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody | Abcam | ab5694 | Primary antibody (1:200) |
| Blocker Casein in PBS | Thermo Fisher Scientific | 37528 | Staining buffer |
| Butorphanol Tartrate | Meiji | 005526 | Anesthetic |
| C57BL/6NJcl | Nippon Bio-Supp.Center | N/A | Mouse strain |
| Imaris | Bitplane | N/A | Imaging analysis software |
| Macro-zoom microscope | OLYMPUS | MVX10 | The observation unit of the custom-built microscope |
| Medetomidine Hydrochloride | Kyoritsu-Seiyaku | 008656 | Anesthetic |
| Midazolam | SANDOZ | 27803229 | Anesthetic |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Immersion oil |
| N-buthyldiethanolamine | Tokyo Chemical Industry | B0725 | CUBIC-L, CUBIC-R+ |
| Nicotinamide | Tokyo Chemical Industry | N0078 | CUBIC-R+ |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | CUBIC-L, PBST |
| Silicon oil HIVAC-F4 | Shin-Etsu Chemical | 50449832 | Immersion oil |
| Sodium azide | Wako | 195-11092 | Staining buffer |
References
- Velez-Fort, M., et al. The stimulus selectivity and connectivity of layer six principal cells reveals cortical microcircuits underlying visual processing. Neuron. 83 (6), 1431-1443 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Tainaka, K., et al. Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Hasegawa, S., et al. Comprehensive three-dimensional analysis (CUBIC-kidney) visualizes abnormal renal sympathetic nerves after ischemia/reperfusion injury. Kidney International. 96 (1), 129-138 (2019).
- Hasegawa, S., Inoue, T., Inagi, R. Neuroimmune interactions and kidney disease. Kidney Research and Clinical Practice. 38 (3), 282-294 (2019).
- Hasegawa, S., et al. The oral hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor enarodustat counteracts alterations in renal energy metabolism in the early stages of diabetic kidney disease. Kidney International. 97 (5), 934-950 (2020).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hasegawa, S., et al. Activation of sympathetic signaling in macrophages blocks systemic inflammation and protects against renal ischemia-reperfusion injury. Journal of the American Society of Nephrology. 32 (7), 1599-1615 (2021).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1-22 (2020).
