Summary
Il presente protocollo descrive un metodo di pulizia dei tessuti e una colorazione immunofluorescente a montaggio intero per l'imaging renale tridimensionale (3D). Questa tecnica può offrire prospettive macroscopiche nella patologia renale, portando a nuove scoperte biologiche.
Abstract
Sebbene la patologia convenzionale fornisse numerose informazioni sulla microstruttura renale, era difficile conoscere la struttura precisa dei vasi sanguigni, dei tubuli prossimali, dei dotti collettivi, dei glomeruli e dei nervi simpatici nel rene a causa della mancanza di informazioni tridimensionali (3D). La compensazione ottica è una buona strategia per superare questo grande ostacolo. Più cellule in un intero organo possono essere analizzate alla risoluzione di una singola cellula combinando la pulizia dei tessuti e la tecnica di imaging 3D. Tuttavia, i metodi di etichettatura cellulare per l'imaging dell'intero organo rimangono sottosviluppati. In particolare, la colorazione dell'intero organo è difficile a causa della difficoltà nella penetrazione degli anticorpi. Il presente protocollo ha sviluppato una colorazione renale di topo a montaggio intero per l'imaging 3D con il metodo di pulizia dei tessuti CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis). Il protocollo ha permesso di visualizzare la denervazione simpatica renale dopo danno da ischemia-riperfusione e glomerulomegalia nella fase iniziale della malattia renale diabetica da un punto di vista completo. Pertanto, questa tecnica può portare a nuove scoperte nella ricerca sui reni fornendo una prospettiva macroscopica.
Introduction
Il rene è composto da varie popolazioni cellulari. Sebbene la patologia convenzionale ci fornisca molte informazioni sul microambiente renale, è necessaria l'imaging tridimensionale (3D) per comprendere con precisione la diafonia intercellulare durante la progressione della malattia renale. In passato, era necessario eseguire un numero enorme di sezionamenti seriali e ricostruzione delle immagini per l'imaging 3D dell'intero organo1. Tuttavia, questo metodo richiedeva troppo sforzo e presentava problemi in termini di riproducibilità.
La compensazione ottica è una buona strategia per superare questo ostacolo 2,3. L'opacità tissutale è dovuta principalmente alla diffusione e all'assorbimento della luce perché ogni organo è costituito da varie sostanze, tra cui acqua, proteine e lipidi. Pertanto, la strategia di base della pulizia dei tessuti consiste nel sostituire l'acqua e i lipidi nei tessuti con reagenti corrispondenti all'indice di rifrazione (RI) che hanno le stesse proprietà ottiche delle proteine4. Per osservare un campione trasparente, è utile una microscopia fluorescente a foglio di luce5. I fogli luminosi illuminano il campione trasparente dal lato e i segnali di eccitazione vengono acquisiti attraverso la lente dell'obiettivo situata in posizione verticale6. Questa microscopia ottiene informazioni di sezione trasversale in un singolo sweep, che è diverso dalla microscopia fluorescente confocale o multifotone. Pertanto, può acquisire rapidamente immagini z-stack con un basso livello di photobleaching.
Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) è uno dei metodi di pulizia dei tessuti che consente l'imaging dell'intero organo mediante microscopia fluorescente a foglio luminoso 2,7,8. La colorazione immunofluorescente CUBIC e a montaggio intero è ottimizzata nel presente studio per visualizzare le strutture 3D del rene di topo 9,10,11. Utilizzando questo metodo di colorazione a montaggio intero, l'alterazione dei nervi simpatici renali viene visualizzata dopo il danno da ischemia-riperfusione 9,10 e la glomerulomegalia nella fase iniziale della malattia renale diabetica 11, così come i vasi sanguigni, i tubuli prossimali e i dotti collettori in un rene intero9.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati approvati dall'Institutional Review Board dell'Università di Tokyo. Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite secondo le linee guida del National Institutes of Health. Topi maschi C57BL / 6NJcl, di 8 settimane, sono stati utilizzati per il presente studio. I topi sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali).
1. Preparazione animale e fissazione dei reni
- Eseguire la fissazione della perfusione seguendo i passaggi seguenti.
- Anestetizzare il topo per inalazione di isoflurano (3%, 2,0 L/min) e somministrazione intraperitoneale di medetomidina cloridrato (0,3 mg/kg), butorfanolo tartrato (5 mg/kg) e midazolam (4 mg/kg) (vedere Tabella dei materiali).
- Perfondere l'animale con 20 mL di PBS (pH 7,4) e 30 mL di PFA al 4% in tampone fosfato (PB) attraverso il ventricolo sinistro del cuore12.
- Eseguire la fissazione per immersione subito dopo la fissazione della perfusione e il prelievo renale9.
- Immergere il rene in PFA al 4% a 4 °C per altre 16 ore, quindi lavarlo con PBS per 2 ore (tre volte)9 (Figura 1).
ATTENZIONE: Formaldeide e paraformaldeide sono irritanti tossici. Maneggiare i reagenti in una cappa aspirante con adeguati dispositivi di protezione individuale.
- Immergere il rene in PFA al 4% a 4 °C per altre 16 ore, quindi lavarlo con PBS per 2 ore (tre volte)9 (Figura 1).
2. Decolorazione e delipidazione
- Preparare CUBIC-L per la decolorazione e la delipidazione costituito dal 10% in peso di Triton X-100 e dal 10% in peso di N-butildietanolammina (vedere Tabella dei materiali), seguendo i rapporti precedentemente pubblicati 4,8,9.
- Eseguire la decolorazione e la delipidazione mediante CUBIC-L seguendo i passaggi seguenti.
- Immergere il rene fisso in 7 mL di 50% (v/v) CUBIC-L (miscela 1:1 di acqua e CUBIC-L) in un tubo inferiore rotondo da 14 mL (vedi Tabella dei materiali) agitando delicatamente a temperatura ambiente per 6 ore (Figura 2A). Quindi, immergerlo in 7 ml di CUBIC-L in un tubo inferiore rotondo da 14 mL agitando delicatamente a 37 °C per 5 giorni.
- Aggiornare CUBIC-L ogni giorno durante questo processo. Dopo il processo di decolorazione e delipidazione, lavare il rene con PBS a temperatura ambiente per 2 ore (tre volte)9 (Figura 1). Utilizzare un cucchiaio dosatore per la manipolazione del campione (Figura 2B).
3. Colorazione immunofluorescente a montaggio intero
- Preparare i tamponi di colorazione.
- Preparare il tampone colorante per gli anticorpi primari mescolando lo 0,5% (v / v) Triton X-100, lo 0,5% di caseina in PBS e lo 0,05% di azoturo di sodio9.
- Preparare il tampone colorante per gli anticorpi secondari mescolando lo 0,5% (v/v) di Triton X-100, lo 0,1% di caseina in PBS e lo 0,05% di azoturo di sodio9.
- Eseguire la colorazione con anticorpi primari.
- Immunocolorare il rene delipidizzato con anticorpi primari (1:100 o 1:200, vedere Tabella dei materiali) nel tampone colorante a 37 °C agitando delicatamente per 7 giorni.
NOTA: La quantità di tampone colorante necessaria per un rene è 500-600 μL (Figura 2C). - Lavare il rene con Triton X-100 allo 0,5% (v/v) in PBS (PBST) a temperatura ambiente per 1 giorno9 (Figura 1).
- Immunocolorare il rene delipidizzato con anticorpi primari (1:100 o 1:200, vedere Tabella dei materiali) nel tampone colorante a 37 °C agitando delicatamente per 7 giorni.
- Eseguire la colorazione con anticorpi secondari.
- Immunocolorare il rene con anticorpi secondari (1:100 o 1:200, vedere Tabella dei materiali) nel tampone colorante a 37 °C agitando delicatamente per 7 giorni. Lavare il rene con PBST a temperatura ambiente per 1 giorno9 (Figura 1).
- Dopo la fissazione9, immergere il rene in formaldeide all'1% in PB (miscela 1:36 di formaldeide al 37% e PB) per 3 ore e lavarlo con PBS a temperatura ambiente per 6 ore (Figura 1).
4. Corrispondenza dell'indice di rifrazione (RI)
- Preparare CUBIC-R+.
- Preparare CUBIC-R miscelando il 45% in peso di 2,3-dimetil-1-fenil-5-pirazolone/antipirina e il 30% in peso di nicotinamide (vedere Tabella dei materiali).
- Preparare CUBIC-R+ per la corrispondenza dell'indice di rifrazione (RI) aggiungendo 0,5 v% di N-butildietanolammina a CUBIC-R seguendo i rapporti precedentemente pubblicati 4,8,9.
- Eseguire la corrispondenza RI.
- Immergere il rene in 7 mL di CUBIC-R+ (miscela 1:1 di acqua e CUBIC-R+) in un tubo inferiore rotondo da 14 mL agitando delicatamente a temperatura ambiente per 1 giorno. Quindi, immergerlo in 7 ml di CUBIC-R+ in un tubo inferiore rotondo da 14 ml agitando delicatamente a temperatura ambiente per 2 giorni9 (Figura 1).
NOTA: Sebbene il rene fluttui nel 50% di CUBIC-R+ all'inizio della corrispondenza RI, affonda e diventa trasparente in CUBIC-R+ alla fine del processo (Figura 2D).
- Immergere il rene in 7 mL di CUBIC-R+ (miscela 1:1 di acqua e CUBIC-R+) in un tubo inferiore rotondo da 14 mL agitando delicatamente a temperatura ambiente per 1 giorno. Quindi, immergerlo in 7 ml di CUBIC-R+ in un tubo inferiore rotondo da 14 ml agitando delicatamente a temperatura ambiente per 2 giorni9 (Figura 1).
5. Acquisizione e ricostruzione delle immagini
- Immergere il rene corrispondente a RI in una miscela di olio di silicio (RI = 1.555) e olio minerale (RI = 1.467) (55:45) durante l'acquisizione dell'immagine (RI = 1.51)5 (Figura 3).
- Acquisire immagini 3D dell'intero rene con un microscopio fluorescente a9 fogli di luce personalizzato (vedi Tabella dei materiali). Raccogliete tutti i dati delle immagini raw in un formato TIFF a 16 bit. Visualizza e cattura le immagini renderizzate in 3D con il software di analisi delle immagini (Imaris, vedi Tabella dei materiali).
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Representative Results
Utilizzando questo metodo di colorazione, sono stati visualizzati i nervi simpatici [anticorpo anti-tirosina idrossilasi (TH)] e le arterie [anticorpo anti-α-actina del muscolo liscio (αSMA)] in un rene intero (Figura 4A, B e Video 1). Sono stati visualizzati anche nervi simpatici renali anomali dopo ischemia/danno da riperfusione (IRI)9,10 (Figura 4C). Inoltre, la visualizzazione dei nervi simpatici nell'intera milza13 è stata ottenuta utilizzando questo protocollo (Figura 4D). Un esempio di quantificazione dei dati immunofluorescenti 3D è mostrato nella Figura 5.
Inoltre, la visualizzazione dei dotti collettori [anticorpo anti-acquaporina 2 (AQP2)], il segmento S1 dei tubuli prossimali [anticorpo anti-cotrasportatore di glucosio sodico 2 (SGLT2)] e i glomeruli (anticorpo anti-podocina) in un rene intero9 hanno avuto successo (Figura 6A). Utilizzando questo imaging 3D dei glomeruli, la glomerulomegalia (anticorpo anti-podocina) è stata visualizzata nelle prime fasi della malattia renale diabetica, che è stata soppressa dalla somministrazione del farmaco11 (Figura 6B).
Figura 1: Pulizia dei tessuti e colorazione immunofluorescente a montaggio intero. La pulizia dei tessuti mediante CUBIC è un processo in due fasi: delipidazione (CUBIC-L) e corrispondenza dell'indice di rifrazione (RI) (CUBIC-R+). La colorazione a montaggio intero viene eseguita dopo il processo di delipidazione. Barra scala = 10 mm. L'immagine è riprodotta da Hasegawa et al.9. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Immagini del processo di manipolazione . (A) Il campione viene immerso in 7 mL di 50% o 100% CUBIC-L in un tubo inferiore rotondo da 14 ml. Il tubo viene mantenuto orizzontale con un leggero scuotimento durante il processo di delipidazione. (B) Per la manipolazione dei campioni viene utilizzato un cucchiaio di erogazione. (C) La quantità di tampone colorante necessaria per un rene è di 500-600 μL. Il tubo viene mantenuto verticale durante il processo di colorazione. (D) Sebbene il campione fluttui nel 50% di CUBIC-R+ all'inizio della corrispondenza RI, affonda e diventa trasparente in CUBIC-R+ alla fine del processo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Microscopia fluorescente a foglio luminoso per l'imaging 3D dell'intero rene. La microscopia fluorescente a foglio luminoso (LSFM) consente l'imaging tridimensionale (3D) di campioni trasparenti. Questa immagine è riprodotta da Hasegawa et al.9. L'olio ad immersione viene utilizzato durante l'acquisizione dei dati. Fogli luminosi da entrambi i lati illuminano il campione. I segnali di eccitazione vengono acquisiti attraverso la lente dell'obiettivo situata in posizione verticale. Lo stage si muove nella direzione assiale e si ottengono immagini z-stack. Barra della scala = 10 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4. Imaging tridimensionale a rene intero di nervi e arterie simpatiche. (A) I nervi simpatici [anticorpo anti-tirosina idrossilasi (TH), verde] e le arterie [anticorpo anti-α-actina della muscolatura liscia (αSMA), magenta] sono visualizzati in un rene intero. (B) Viene mostrata l'immagine del piano x-y ingrandito di (A) [anticorpo anti-TH, verde; anticorpo anti-αSMA, magenta]. (C) Viene visualizzata la denervazione persistente dopo danno da ischemia-riperfusione renale (IRI). (D) I nervi simpatici in una milza sono visualizzati anche in una milza intera dal protocollo corrente. Questa immagine è riprodotta da Hasegawa et al.9. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Quantificazione della colorazione immunofluorescente tridimensionale. Viene mostrato il processo di quantificazione del rapporto tra volume positivo del segnale e volume renale totale. La conversione binaria viene eseguita in base a ciascuna soglia. I volumi sono ottenuti calcolando l'integrale dell'area di interesse (dimensione voxel: x = 6,45 μm, y = 6,45 μm, z = 7 μm). L'immagine è riprodotta da Hasegawa et al.9. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Imaging tridimensionale del rene intero dei dotti collettori, dei tubuli prossimali e dei glomeruli. (A) I dotti collettori [anticorpo anti-acquaporina 2 (AQP2)], il segmento S1 dei tubuli prossimali [anticorpo anti-cotrasportatore di glucosio sodico 2 (SGLT2)] e i glomeruli (anticorpo anti-podocin) sono visualizzati rispettivamente in un rene intero. L'immagine è riprodotta da Hasegawa et al.9. (B) La glomerulomegalia è osservata nella fase iniziale della malattia renale diabetica (anticorpo anti-podocin), che viene soppressa dalla somministrazione del farmaco. L'immagine è riprodotta da Hasegawa et al.11. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Video 1: Filmato rotante del rene. Viene mostrato il filmato rotante del rene nella Figura 4A . Vengono visualizzati i nervi simpatici [anticorpo anti-tirosina idrossilasi (TH), verde] e le arterie [anticorpo anti-α-actina muscolare liscia (αSMA), magenta]. Clicca qui per scaricare questo video.
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Discussion
Il presente protocollo ha permesso l'imaging 3D dell'intero rene di varie strutture come nervi simpatici, dotti collettivi, arterie, tubuli prossimali e glomeruli 9,10,11. Questo metodo di colorazione ha offerto un'osservazione macroscopica e ha portato a nuove scoperte biologiche, visualizzando l'alterazione dei nervi simpatici renali dopo danno da ischemia-riperfusione 9,10 e glomerulomegalia nella fase iniziale della malattia renale diabetica11.
L'opacità deriva dalla disomogeneità ottica in un tessuto5. Il principio comune dei vari metodi di pulizia dei tessuti è la rimozione di diffusori / assorbitori di luce e l'adempimento dello spazio con reagenti corrispondenti al RI. Rispetto ai metodi a base di solventi organici come l'imaging 3D di organi eliminati con solvente (3DISCO/iDISCO)3,14, CUBIC si basa su reagenti idrofili e quindi è superiore nella conservazione fluorescente5. Questa caratteristica di CUBIC consente ai ricercatori di osservare i segnali fluorescenti dai ceppi di topo reporter2 e i segnali dalla colorazione immunofluorescente a montaggio intero, fornendo più opzioni per una comprensione completa delle strutture degli organi 3D.
L'attuale protocollo di pulizia dei tessuti basato su CUBIC può raggiungere un'elevata trasparenza per l'imaging 3D rispetto alla precedente ricerca sulla pulizia del rene di topo15. Tuttavia, va notato che questo protocollo di compensazione è adatto per i reni di topo. È necessario un processo di delipidazione più forte per eliminare i reni umani. Ad esempio, Zhao et al. hanno recentemente presentato un approccio per la mappatura degli organi umani intatti sviluppando l'efficiente metodo di pulizia dei tessuti denominato SHANEL (small-micelle-mediated human organ efficient clearing and labeling)16. Poiché una delipidazione più forte danneggia i campioni, i ricercatori devono scegliere un metodo di pulizia dei tessuti appropriato in base al loro scopo.
La colorazione dell'intero organo è difficile a causa della difficoltà nella penetrazione degli anticorpi; Il presente protocollo è stato stabilito dopo tentativi ed errori. Poiché la stabilità della colorazione è prioritaria, il tempo di incubazione potrebbe essere più lungo del minimo richiesto. Di conseguenza, questo protocollo ha dimostrato una colorazione di alta qualità dei reni da parte degli anticorpi. Tuttavia, esiste la possibilità che potrebbe non funzionare bene, a seconda degli antigeni bersaglio che non abbiamo provato. Uno studio recente ha dimostrato che la colorazione in due fasi utilizzando anticorpi primari e secondari come l'attuale protocollo non è ottimale in alcuni casi per la colorazione a montaggio intero del cervello di topo17. Questo perché quando la quantità target è grande, il suo anticorpo primario riempie il campione, rendendo difficile per l'anticorpo secondario penetrare in profondità nel tessuto17. Pertanto, vale la pena provare l'anticorpo primario marcato con fluorescenza, o il complesso dell'anticorpo primario e del frammento Fab secondario17, se la penetrazione degli anticorpi non è efficiente.
Per quanto riguarda il processo di imaging, i ricercatori devono scegliere un tipo appropriato di microscopia e risoluzione dell'immagine in base al loro scopo. Se i ricercatori vogliono condurre l'imaging 3D dell'intero rene come presentato in questo studio, è meglio utilizzare la microscopia fluorescente a foglio luminoso perché può acquisire rapidamente ampie immagini z-stack con un basso livello di fotosbiancamento. Poiché la dimensione del file dei dati di imaging 3D è enorme, la risoluzione dell'immagine dovrebbe essere ridotta nella misura in cui l'imaging dell'intero organo può resistere. Al contrario, i ricercatori possono anche utilizzare microscopie confocali o multifotoniche quando ottengono dati di imaging 3D ad alta risoluzione in spazi ristretti.
In conclusione, l'attuale studio ha sviluppato la colorazione renale a montaggio intero per l'imaging 3D con il metodo di pulizia dei tessuti CUBIC. Il protocollo consente la visualizzazione di strutture 3D in un intero rene, fornendo una prospettiva macroscopica per la ricerca sui reni.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Parte di questo lavoro è stato condotto attraverso la collaborazione con il Prof. Hiroki R. Ueda (Università di Tokyo), il Prof. Etsuo A. Susaki (Juntendo University), il Prof. Tetsuhiro Tanaka (Tohoku University), il Prof. Masafumi Fukagawa, il Dr. Takehiko Wada e il Dr. Hirotaka Komaba (Tokai University).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube | Falcon | 352059 | Tissue clearing, staining, wash |
| 2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine | Tokyo Chemical Industry | D1876 | CUBIC-R+ |
| 37%-Formaldehyde Solution | Nacalai Tesque | 16223-55 | Post fixation |
| 4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Nacalai Tesque | 09154-85 | Kidney fixation |
| Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody | Invitrogen | A-21436 | Secondary antibody (1:100) |
| Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | A-31573 | Secondary antibody (1:200) |
| Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody | Abcam | ab199975 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-podocin antibody | Sigma-Aldrich | P0372 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody | Abcam | ab85626 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody | Abcam | ab113 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody | Abcam | ab5694 | Primary antibody (1:200) |
| Blocker Casein in PBS | Thermo Fisher Scientific | 37528 | Staining buffer |
| Butorphanol Tartrate | Meiji | 005526 | Anesthetic |
| C57BL/6NJcl | Nippon Bio-Supp.Center | N/A | Mouse strain |
| Imaris | Bitplane | N/A | Imaging analysis software |
| Macro-zoom microscope | OLYMPUS | MVX10 | The observation unit of the custom-built microscope |
| Medetomidine Hydrochloride | Kyoritsu-Seiyaku | 008656 | Anesthetic |
| Midazolam | SANDOZ | 27803229 | Anesthetic |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Immersion oil |
| N-buthyldiethanolamine | Tokyo Chemical Industry | B0725 | CUBIC-L, CUBIC-R+ |
| Nicotinamide | Tokyo Chemical Industry | N0078 | CUBIC-R+ |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | CUBIC-L, PBST |
| Silicon oil HIVAC-F4 | Shin-Etsu Chemical | 50449832 | Immersion oil |
| Sodium azide | Wako | 195-11092 | Staining buffer |
References
- Velez-Fort, M., et al. The stimulus selectivity and connectivity of layer six principal cells reveals cortical microcircuits underlying visual processing. Neuron. 83 (6), 1431-1443 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Tainaka, K., et al. Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Hasegawa, S., et al. Comprehensive three-dimensional analysis (CUBIC-kidney) visualizes abnormal renal sympathetic nerves after ischemia/reperfusion injury. Kidney International. 96 (1), 129-138 (2019).
- Hasegawa, S., Inoue, T., Inagi, R. Neuroimmune interactions and kidney disease. Kidney Research and Clinical Practice. 38 (3), 282-294 (2019).
- Hasegawa, S., et al. The oral hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor enarodustat counteracts alterations in renal energy metabolism in the early stages of diabetic kidney disease. Kidney International. 97 (5), 934-950 (2020).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hasegawa, S., et al. Activation of sympathetic signaling in macrophages blocks systemic inflammation and protects against renal ischemia-reperfusion injury. Journal of the American Society of Nephrology. 32 (7), 1599-1615 (2021).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1-22 (2020).
