Summary
Het huidige protocol beschrijft een weefselzuiveringsmethode en immunofluorescente kleuring met volledige mount voor driedimensionale (3D) nierbeeldvorming. Deze techniek kan macroscopische perspectieven bieden in de nierpathologie, wat leidt tot nieuwe biologische ontdekkingen.
Abstract
Hoewel conventionele pathologie veel informatie over de niermicrostructuur opleverde, was het moeilijk om de precieze structuur van bloedvaten, proximale tubuli, verzamelkanalen, glomeruli en sympathische zenuwen in de nier te kennen vanwege het gebrek aan driedimensionale (3D) informatie. Optische clearing is een goede strategie om deze grote hindernis te overwinnen. Meerdere cellen in een heel orgaan kunnen worden geanalyseerd met eencellige resolutie door weefselzuivering en 3D-beeldvormingstechniek te combineren. Celetiketteringsmethoden voor beeldvorming van hele organen blijven echter onderontwikkeld. In het bijzonder is het kleuren van organen in de hele montage een uitdaging vanwege de moeilijkheid bij de penetratie van antilichamen. Het huidige protocol ontwikkelde een nierkleuring van de hele muis voor 3D-beeldvorming met de CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/ Body Imaging Cocktails and Computational analysis) weefselzuiveringsmethode. Het protocol heeft het mogelijk gemaakt om renale sympathische denervatie na ischemie-reperfusieletsel en glomerulomegalie in het vroege stadium van diabetische nierziekte vanuit een uitgebreid oogpunt te visualiseren. Deze techniek kan dus leiden tot nieuwe ontdekkingen in nieronderzoek door een macroscopisch perspectief te bieden.
Introduction
De nier bestaat uit verschillende celpopulaties. Hoewel conventionele pathologie ons veel informatie geeft over de micro-omgeving van de nieren, is driedimensionale (3D) beeldvorming nodig om de intercellulaire overspraak tijdens de progressie van de nierziekte nauwkeurig te begrijpen. In het verleden moest een groot aantal seriële secties en beeldreconstructies worden uitgevoerd voor de 3D-beeldvorming van het hele orgaan1. Deze methode vergde echter te veel inspanning en had problemen op het gebied van reproduceerbaarheid.
Optische clearing is een goede strategie om deze horde te nemen 2,3. Weefselopaciteit is voornamelijk te wijten aan lichtverstrooiing en absorptie omdat elk orgaan bestaat uit verschillende stoffen, waaronder water, eiwitten en lipiden. De basisstrategie van weefselzuivering is dus het vervangen van water en lipiden in weefsels door refractieve index (RI) overeenkomende reagentia die dezelfde optische eigenschappen hebben als eiwitten4. Om een transparant monster te observeren, is een lichtblad fluorescerende microscopie nuttig5. Lichtplaten verlichten het transparante monster vanaf de zijkant en excitatiesignalen worden verkregen door de objectieflens in een verticale positie6. Deze microscopie verkrijgt in één beweging dwarsdoorsnede-informatie, die verschilt van de confocale of multifoton fluorescerende microscopie. Zo kan het snel z-stack-afbeeldingen verkrijgen met een laag niveau van fotobleaching.
Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) is een van de weefselzuiveringsmethoden die beeldvorming van hele organen mogelijk maakt door fluorescentiemicroscopie 2,7,8. CUBIC en whole-mount immunofluorescente kleuring zijn in deze studie geoptimaliseerd om 3D-structuren van muizennieren te visualiseren 9,10,11. Met behulp van deze whole-mount kleuringsmethode wordt de verandering in renale sympathische zenuwen gevisualiseerd na ischemie-reperfusieletsel 9,10 en glomerulomegallie in het vroege stadium van diabetische nierziekte11, evenals bloedvaten, proximale tubuli en verzamelkanalen in een hele nier9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Universiteit van Tokio. Alle dierprocedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de National Institutes of Health. Mannelijke C57BL/6NJcl muizen, 8 weken oud, werden gebruikt voor deze studie. De muizen werden verkregen uit commerciële bronnen (zie Tabel van Materialen).
1. Bereiding van dieren en nierfixatie
- Voer perfusiefixatie uit volgens de onderstaande stappen.
- Verdoof de muis door inhalatie van isofluraan (3%, 2,0 l/min) en intraperitoneale toediening van medetomidinehydrochloride (0,3 mg/kg), butorfanoltartraat (5 mg/kg) en midazolam (4 mg/kg) (zie materiaaltabel).
- Perfuseer het dier met 20 ml PBS (pH 7,4) en 30 ml 4% PFA in fosfaatbuffer (PB) door de linker ventrikel van het hart12.
- Voer de onderdompelingsfixatie uit net na de perfusiefixatie en nierbemonstering9.
- Dompel de nier onder in 4% PFA bij 4 °C gedurende nog eens 16 uur en was deze vervolgens 2 uur (driemaal) met PBS (9 ) (figuur 1).
LET OP: Formaldehyde en paraformaldehyde zijn giftige irriterende stoffen. Behandel reagentia in een zuurkast met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.
- Dompel de nier onder in 4% PFA bij 4 °C gedurende nog eens 16 uur en was deze vervolgens 2 uur (driemaal) met PBS (9 ) (figuur 1).
2. Ontkleuring en delipidatie
- Bereid CUBIC-L voor ontkleuring en delipidatie bestaande uit 10 wt% Triton X-100 en 10 wt% N-buthyldiethanolamine (zie Materiaaltabel), volgens eerder gepubliceerde rapporten 4,8,9.
- Voer ontkleuring en delipidatie uit door CUBIC-L volgens de onderstaande stappen.
- Dompel de vaste nier onder in 7 ml van 50% (v / v) CUBIC-L (1: 1 mengsel van water en CUBIC-L) in een ronde bodembuis van 14 ml (zie materiaaltabel) met zacht schudden bij kamertemperatuur gedurende 6 uur (figuur 2A). Dompel het vervolgens onder in 7 ml CUBIC-L in een ronde bodembuis van 14 ml met zacht schudden bij 37 ° C gedurende 5 dagen.
- Ververs CUBIC-L elke dag tijdens dit proces. Was na het ontkleurings- en delipidatieproces de nier met PBS op kamertemperatuur gedurende 2 uur (driemaal)9 (figuur 1). Gebruik een doseerlepel voor het hanteren van monsters (figuur 2B).
3. Immunofluorescente kleuring in de hele montage
- Bereid de kleuringsbuffers voor.
- Bereid de kleuringsbuffer voor primaire antilichamen voor door 0,5% (v/v) Triton X-100, 0,5% caseïne in PBS en 0,05% natriumazide9 te mengen.
- Bereid de kleuringsbuffer voor secundaire antilichamen voor door 0,5% (v/v) Triton X-100, 0,1% caseïne in PBS en 0,05% natriumazide9 te mengen.
- Voer kleuring uit met primaire antilichamen.
- De gedelipideerde nier met primaire antilichamen (1:100 of 1:200, zie Materiaaltabel) in de kleuringsbuffer bij 37 °C bij zacht schudden gedurende 7 dagen.
OPMERKING: De hoeveelheid van de kleuringsbuffer die nodig is voor één nier is 500-600 μL (figuur 2C). - Was de nier met 0,5% (v/v) Triton X-100 in PBS (PBST) bij kamertemperatuur gedurende 1 dag9 (figuur 1).
- De gedelipideerde nier met primaire antilichamen (1:100 of 1:200, zie Materiaaltabel) in de kleuringsbuffer bij 37 °C bij zacht schudden gedurende 7 dagen.
- Voer kleuring uit met secundaire antilichamen.
- Immunostain de nier met secundaire antilichamen (1:100 of 1:200, zie Tabel van materialen) in de kleuringsbuffer bij 37 °C met zacht schudden gedurende 7 dagen. Was de nier met PBST bij kamertemperatuur gedurende 1 dag9 (figuur 1).
- Dompel na fixatie9 de nier onder in 1% formaldehyde in PB (1:36 mengsel van 37% formaldehyde en PB) gedurende 3 uur en was deze met PBS bij kamertemperatuur gedurende 6 uur (figuur 1).
4. Refractie index (RI) matching
- Bereid CUBIC-R+ voor.
- Bereid CUBIC-R door 45 wt% 2,3-dimethyl-1-fenyl-5-pyrazolon/antipyrine en 30 wt% nicotinamide te mengen (zie materiaaltabel).
- Bereid CUBIC-R+ voor op refractieve index (RI) matching door 0,5 v% N-buthyldiethanolamine toe te voegen aan CUBIC-R volgens de eerder gepubliceerde rapporten 4,8,9.
- Voer de RI-matching uit.
- Dompel de nier onder in 7 ml van 50% (v / v) CUBIC-R + (1: 1 mengsel van water en CUBIC-R +) in een ronde onderbuis van 14 ml met zacht schudden bij kamertemperatuur gedurende 1 dag. Dompel het vervolgens onder in 7 ml CUBIC-R + in een ronde onderbuis van 14 ml met zacht schudden bij kamertemperatuur gedurende 2 dagen9 (figuur 1).
OPMERKING: Hoewel de nier aan het begin van de RI-matching in 50% CUBIC-R+ drijft, zinkt deze en wordt hij aan het einde van het proces transparant in CUBIC-R+ (figuur 2D).
- Dompel de nier onder in 7 ml van 50% (v / v) CUBIC-R + (1: 1 mengsel van water en CUBIC-R +) in een ronde onderbuis van 14 ml met zacht schudden bij kamertemperatuur gedurende 1 dag. Dompel het vervolgens onder in 7 ml CUBIC-R + in een ronde onderbuis van 14 ml met zacht schudden bij kamertemperatuur gedurende 2 dagen9 (figuur 1).
5. Beeldacquisitie en reconstructie
- Dompel de RI-gematchte nier onder in een mengsel van siliciumolie (RI = 1.555) en minerale olie (RI = 1.467) (55:45) tijdens beeldacquisitie (RI = 1.51)5 (Figuur 3).
- Verkrijg 3D-beelden van de hele nier met een op maat gemaakte fluorescerende microscoop met9 lichtplaten (zie Materiaaltabel). Verzamel alle onbewerkte afbeeldingsgegevens in een 16-bits TIFF-indeling. Visualiseer en leg de 3D-gerenderde beelden vast met de imaging analyse software (Imaris, zie Tabel van Materialen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van deze kleuringsmethode werden sympathische zenuwen [anti-tyrosinehydroxylase (TH) antilichaam] en slagaders [anti-α-gladde spieractine (αSMA) antilichaam] in een hele nier (figuur 4A, B en video 1) gevisualiseerd9. Abnormale renale sympathische zenuwen werden ook gevisualiseerd na ischemie/reperfusieletsel (IRI)9,10 (figuur 4C). Bovendien werd het visualiseren van sympathische zenuwen in de hele milt13 bereikt met behulp van dit protocol (figuur 4D). Een voorbeeld van het kwantificeren van de 3D-immunofluorescentiegegevens is weergegeven in figuur 5.
Daarnaast was het visualiseren van verzamelkanalen [anti-aquaporine 2 (AQP2) antilichaam], het S1-segment van proximale tubuli [anti-natriumglucose cotransporter 2 (SGLT2) antilichaam], en de glomeruli (anti-podocine-antilichaam) in een hele nier9 succesvol (figuur 6A). Met behulp van deze 3D-beeldvorming van glomeruli werd glomerulomegallie (anti-podocine-antilichaam) gevisualiseerd in de vroege stadia van diabetische nierziekte, die werd onderdrukt door toedieningvan geneesmiddelen 11 (figuur 6B).
Figuur 1: Weefselopruiming en immunofluorescente kleuring van de hele montering. Weefselopruiming door CUBIC is een proces in twee stappen: delipidatie (CUBIC-L) en refractieve index (RI) matching (CUBIC-R+). Hele montage kleuring wordt uitgevoerd na het delipidatieproces. Schaalbalk = 10 mm. Het beeld is gereproduceerd uit Hasegawa et al.9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Afbeeldingen van het hanteringsproces. (A) Het monster wordt ondergedompeld in 7 ml van 50% of 100% CUBIC-L in een ronde onderbuis van 14 ml. De buis wordt horizontaal gehouden met zacht schudden tijdens het delipidatieproces. (B) Voor het hanteren van monsters wordt een doseerlepel gebruikt. (C) De hoeveelheid van de kleuringsbuffer die nodig is voor één nier is 500-600 μL. De buis wordt verticaal gehouden tijdens het kleuringsproces. (D) Hoewel het monster aan het begin van de RI-matching in 50% CUBIC-R+ drijft, zinkt het en wordt het aan het einde van het proces transparant in CUBIC-R+. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Light sheet fluorescentiemicroscopie voor 3D-beeldvorming van de hele nier. Light sheet fluorescent microscopie (LSFM) maakt driedimensionale (3D) beeldvorming van transparante monsters mogelijk. Deze afbeelding is overgenomen uit Hasegawa et al.9. Dompelolie wordt gebruikt tijdens data-acquisitie. Lichtplaten van beide zijden verlichten het monster. De excitatiesignalen worden verkregen door de objectieflens in een verticale positie. Het werkgebied beweegt in de axiale richting en z-stack-afbeeldingen worden verkregen. Schaalbalk = 10 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Whole-kidney driedimensionale beeldvorming van sympathische zenuwen en slagaders. (A) Sympathische zenuwen [anti-tyrosine hydroxylase (TH) antilichaam, groen] en slagaders [anti-α-gladde spier actine (αSMA) antilichaam, magenta] worden gevisualiseerd in een hele nier. (B) De vergrote afbeelding van het x-y-vlak van (A) wordt getoond [anti-TH-antilichaam, groen; anti-αSMA-antilichaam, magenta]. (C) Aanhoudende denervatie na renale ischemie-reperfusieletsel (IRI) wordt gevisualiseerd. (D) Sympathische zenuwen in een milt worden ook gevisualiseerd in een hele milt door het huidige protocol. Deze afbeelding is overgenomen uit Hasegawa et al.9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Kwantificering van driedimensionale immunofluorescente kleuring. Het proces van het kwantificeren van de verhouding tussen signaalpositief volume en totaal niervolume wordt weergegeven. Binaire conversie wordt uitgevoerd volgens elke drempel. De volumes worden verkregen door de integraal van het interessegebied te berekenen (voxelgrootte: x = 6,45 μm, y = 6,45 μm, z = 7 μm). Het beeld is gereproduceerd uit Hasegawa et al.9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Driedimensionale beeldvorming van de hele nier van verzamelkanalen, proximale tubuli en glomeruli. (A) Het verzamelen van kanalen [anti-aquaporine 2 (AQP2) antilichaam], S1-segment van proximale tubuli [anti-natriumglucose cotransporter 2 (SGLT2) antilichaam] en glomeruli (anti-podocine-antilichaam) worden respectievelijk gevisualiseerd in een hele nier. Het beeld is gereproduceerd uit Hasegawa et al.9. (B) Glomerulomegalie wordt waargenomen in het vroege stadium van diabetische nierziekte (anti-podocine-antilichaam), dat wordt onderdrukt door toediening van geneesmiddelen. De afbeelding is gereproduceerd uit Hasegawa et al.11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Video 1: Roterende film van de nier. De roterende film van de nier in figuur 4A wordt getoond. Sympathische zenuwen [anti-tyrosine hydroxylase (TH) antilichaam, groen] en slagaders [anti-α-gladde spier actine (αSMA) antilichaam, magenta] worden gevisualiseerd. Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het huidige protocol maakte 3D-beeldvorming van de hele nier mogelijk van verschillende structuren zoals sympathische zenuwen, verzamelkanalen, slagaders, proximale tubuli en glomeruli 9,10,11. Deze kleuringsmethode bood macroscopische observatie en leidde tot nieuwe biologische ontdekkingen, door de verandering in renale sympathische zenuwen na ischemie-reperfusieletsel 9,10 en glomerulomegalie in de beginfase van diabetische nierziektete visualiseren 11.
Opaciteit is afgeleid van optische inhomogeniteit in een weefsel5. Het gemeenschappelijke principe van verschillende weefselzuiveringsmethoden is het verwijderen van lichtstrooiers / absorbers en het vervullen van de ruimte met RI-matching reagentia. Vergeleken met organische methoden op basis van oplosmiddelen, zoals 3D-beeldvorming van oplosmiddelgeklaarde organen (3DISCO/iDISCO)3,14, is CUBIC gebaseerd op hydrofiele reagentia en is dus superieur in fluorescerende conservering5. Deze eigenschap van CUBIC stelt onderzoekers in staat om fluorescerende signalen van reportermuisstammen2 te observeren, evenals signalen van immunofluorescente kleuring met hele mount, wat meer opties biedt voor een uitgebreid begrip van de 3D-orgaanstructuren.
Het huidige CUBIC-gebaseerde weefselzuiveringsprotocol kan een hoge transparantie bereiken voor 3D-beeldvorming in vergelijking met eerder onderzoek naar het opruimen vanmuizennieren 15. Er moet echter worden opgemerkt dat dit clearingprotocol geschikt is voor muizennieren. Een sterker delipidatieproces is nodig om menselijke nieren te zuiveren. Zhao et al. presenteerden bijvoorbeeld onlangs een benadering voor het in kaart brengen van intacte menselijke organen door de efficiënte weefselzuiveringsmethode genaamd SHANEL (small-micelle-mediated human organ efficient clearing and labeling)16 te ontwikkelen. Omdat sterkere delipidatie monsters beschadigt, moeten onderzoekers een geschikte weefselzuiveringsmethode kiezen op basis van hun doel.
Orgaankleuring met hele montage is een uitdaging vanwege de moeilijkheid bij de penetratie van antilichamen; het huidige protocol is tot stand gekomen na vallen en opstaan. Omdat de stabiliteit van kleuring prioriteit heeft, kan de incubatietijd langer zijn dan het vereiste minimum. Als gevolg hiervan heeft dit protocol een hoogwaardige kleuring van de nieren door de antilichamen aangetoond. Er is echter een mogelijkheid dat het niet goed werkt, afhankelijk van de doelantigenen die we niet hebben geprobeerd. Een recente studie heeft aangetoond dat tweestapskleuring met behulp van primaire en secundaire antilichamen zoals het huidige protocol in sommige gevallen niet optimaal is voor de hele kleuring van muizenhersenen17. Dit komt omdat wanneer de doelhoeveelheid groot is, het primaire antilichaam het monster vult, waardoor het voor het secundaire antilichaam moeilijk wordt om diep in het weefsel door te dringen17. Het fluorescerend gelabelde primaire antilichaam, of het complex van het primaire antilichaam en secundair Fab-fragment17, is dus het proberen waard als de penetratie van antilichamen niet efficiënt is.
Wat het beeldvormingsproces betreft, moeten onderzoekers een geschikt type microscopie en beeldresolutie kiezen op basis van hun doel. Als onderzoekers 3D-beeldvorming van de hele nieren willen uitvoeren zoals gepresenteerd in deze studie, is het beter om fluorescentiemicroscopie met lichtblad te gebruiken, omdat deze snel brede z-stackbeelden kan verkrijgen met een laag niveau van fotobleaching. Aangezien de bestandsgrootte van 3D-beeldgegevens enorm is, moet de beeldresolutie worden verlaagd in de mate dat beeldvorming van hele organen kan standhouden. Onderzoekers kunnen daarentegen ook confocale of multifoton microscopieën gebruiken bij het verkrijgen van 3D-beeldvormingsgegevens met hoge resolutie in een smalle ruimte.
Kortom, de huidige studie heeft nierkleuring voor 3D-beeldvorming ontwikkeld met de weefselzuiveringsmethode CUBIC. Het protocol maakt visualisatie van 3D-structuren in een hele nier mogelijk, waardoor een macroscopisch perspectief wordt geboden voor nieronderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Een deel van dit werk werd uitgevoerd door samenwerking met Prof. Hiroki R. Ueda (Universiteit van Tokio), Prof. Etsuo A. Susaki (Juntendo University), Prof. Tetsuhiro Tanaka (Tohoku University), Prof. Masafumi Fukagawa, Dr. Takehiko Wada en Dr. Hirotaka Komaba (Tokai University).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube | Falcon | 352059 | Tissue clearing, staining, wash |
| 2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine | Tokyo Chemical Industry | D1876 | CUBIC-R+ |
| 37%-Formaldehyde Solution | Nacalai Tesque | 16223-55 | Post fixation |
| 4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Nacalai Tesque | 09154-85 | Kidney fixation |
| Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG antibody | Invitrogen | A-21436 | Secondary antibody (1:100) |
| Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | A-31573 | Secondary antibody (1:200) |
| Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibody | Abcam | ab199975 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-podocin antibody | Sigma-Aldrich | P0372 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-sodium glucose cotransporter 2 (SGLT2) antibody | Abcam | ab85626 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-tyrosine hydroxylase (TH) antibody | Abcam | ab113 | Primary antibody (1:100) |
| Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) antibody | Abcam | ab5694 | Primary antibody (1:200) |
| Blocker Casein in PBS | Thermo Fisher Scientific | 37528 | Staining buffer |
| Butorphanol Tartrate | Meiji | 005526 | Anesthetic |
| C57BL/6NJcl | Nippon Bio-Supp.Center | N/A | Mouse strain |
| Imaris | Bitplane | N/A | Imaging analysis software |
| Macro-zoom microscope | OLYMPUS | MVX10 | The observation unit of the custom-built microscope |
| Medetomidine Hydrochloride | Kyoritsu-Seiyaku | 008656 | Anesthetic |
| Midazolam | SANDOZ | 27803229 | Anesthetic |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Immersion oil |
| N-buthyldiethanolamine | Tokyo Chemical Industry | B0725 | CUBIC-L, CUBIC-R+ |
| Nicotinamide | Tokyo Chemical Industry | N0078 | CUBIC-R+ |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether/Triton X-100 | Nacalai Tesque | 12967-45 | CUBIC-L, PBST |
| Silicon oil HIVAC-F4 | Shin-Etsu Chemical | 50449832 | Immersion oil |
| Sodium azide | Wako | 195-11092 | Staining buffer |
References
- Velez-Fort, M., et al. The stimulus selectivity and connectivity of layer six principal cells reveals cortical microcircuits underlying visual processing. Neuron. 83 (6), 1431-1443 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Tainaka, K., et al. Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents. Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
- Hasegawa, S., et al. Comprehensive three-dimensional analysis (CUBIC-kidney) visualizes abnormal renal sympathetic nerves after ischemia/reperfusion injury. Kidney International. 96 (1), 129-138 (2019).
- Hasegawa, S., Inoue, T., Inagi, R. Neuroimmune interactions and kidney disease. Kidney Research and Clinical Practice. 38 (3), 282-294 (2019).
- Hasegawa, S., et al. The oral hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor enarodustat counteracts alterations in renal energy metabolism in the early stages of diabetic kidney disease. Kidney International. 97 (5), 934-950 (2020).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hasegawa, S., et al. Activation of sympathetic signaling in macrophages blocks systemic inflammation and protects against renal ischemia-reperfusion injury. Journal of the American Society of Nephrology. 32 (7), 1599-1615 (2021).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812 (2020).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1-22 (2020).
