Summary

Ein stabil etabliertes Zwei-Punkt-Injektionsmodell für Lysophosphatidylcholin-induziertes fokales Demyelin-Modell bei Mäusen

Published: May 11, 2022
doi:

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Zwei-Punkt-Injektion von Lysophosphatidylcholin über einen stereotaktischen Rahmen, um ein stabiles und reproduzierbares Demyelinmodell in Mäusen zu erzeugen.

Abstract

Die rezeptorvermittelte Lysophospholipid-Signalgebung trägt zur Pathophysiologie verschiedener neurologischer Erkrankungen, insbesondere der Multiplen Sklerose (MS), bei. Lysophosphatidylcholin (LPC) ist ein endogenes Lysophospholipid, das mit Entzündungen assoziiert ist, und es könnte eine schnelle Schädigung mit Toxizität für Myelinlipide induzieren, was zu einer fokalen Demyelinisierung führt. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die stereotaktische Zwei-Punkt-LPC-Injektion vorgestellt, die eine schwere Demyelinisierung direkt verursachen und die experimentelle Demyelinisierungsverletzung bei Mäusen durch chirurgische Eingriffe schnell und stabil replizieren könnte. Somit ist dieses Modell für Demyelinisierungserkrankungen, insbesondere MS, von hoher Relevanz und kann dazu beitragen, die damit verbundene klinisch relevante Forschung voranzutreiben. Auch Immunfluoreszenz- und Luxol-Schnellblaufärbungsmethoden wurden verwendet, um den zeitlichen Verlauf der Demyelinisierung im Corpus callosum von Mäusen, denen LPC injiziert wurde, darzustellen. Darüber hinaus wurde die Verhaltensmethode verwendet, um die kognitive Funktion von Mäusen nach der Modellierung zu bewerten. Insgesamt ist die Zwei-Punkt-Injektion von Lysophosphatidylcholin über einen stereotaktischen Rahmen eine stabile und reproduzierbare Methode, um ein Demyelinisierungsmodell in Mäusen für weitere Studien zu generieren.

Introduction

Die rezeptorvermittelte Lysophospholipid-Signalgebung umfasst verschiedene physiologische Prozesse fast aller Organsysteme1. Im zentralen Nervensystem (ZNS) spielt diese Signalübertragung eine entscheidende Rolle bei den Erregern autoimmuner neurologischer Erkrankungen wie der Multiplen Sklerose (MS). Multiple Sklerose ist eine chronische immunvermittelte Erkrankung, die durch pathologische Demyelinisierung und Entzündungsreaktion gekennzeichnet ist und neurologische Dysfunktion und kognitive Beeinträchtigung verursacht 2,3. Nach kontinuierlichem Rezidiv und Remittieren während der frühen Erkrankung gelangen die meisten Patienten schließlich in das sekundär-progressive Stadium, das irreversible Schäden am Gehirn und eine daraus resultierende Behinderung verursachen kann4. Es wird angenommen, dass das pathologische Kennzeichen des sekundär-progressiven Verlaufs demyelinisierende Plaques sind, die durch entzündliche Läsionen verursacht werden5. Bestehende Behandlungen für MS können das Risiko eines Rückfalls signifikant reduzieren. Es gibt jedoch immer noch keine wirksame Therapie für langfristige demyelinisierende Schäden, die durch progressive MS6 verursacht werden. Daher ist ein stabil etabliertes und leicht reproduzierbares Modell erforderlich, um präklinische Therapeutika zu untersuchen, die sich auf die Degeneration der weißen Substanz konzentrieren.

Demyelinisierung und Remyelinisierung sind zwei wichtige pathologische Prozesse bei der Entwicklung von Multipler Sklerose. Demyelinisierung ist der Verlust von Myelinscheide um Axone, die durch Mikroglia mit proinflammatorischen Phänotypen7 induziert werden, und es führt zu einer langsamen Leitung von Nervenimpulsen und führt zum Verlust von Neuronen und neurologischen Störungen. Remyelinisierung ist eine endogene Reparaturreaktion, die durch Oligodendrozyten vermittelt wird, wo Störungen zu Neurodegeneration und kognitiven Beeinträchtigungen führen können8. Die Entzündungsreaktion ist entscheidend für den gesamten Prozess und beeinflusst sowohl den Grad der Myelinschädigung als auch die Reparatur.

Daher ist ein stabiles Tiermodell der persistierenden entzündlichen Demyelinisierung für die weitere Erforschung therapeutischer Strategien für MS von Bedeutung. Aufgrund der Komplexität von MS wurden verschiedene Arten von Tiermodellen etabliert, um demyelinisierende Läsionen in vivo nachzuahmen, einschließlich experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis (EAE), toxisch-demyelinisierender Modelle, Cuprizon (CPZ) und Lysophosphatidylcholin (LPC)9 . LPC ist ein endogenes Lysophospholipid, das mit Entzündungen assoziiert ist, und es könnte schnelle Schäden mit Toxizität für Myelinlipide induzieren, was zu einer fokalen Demyelinisierung führt. Basierend auf früheren Berichten und Forschungsergebnissen10,11 wird ein detailliertes Protokoll der Zweipunktinjektion mit einigen Modifikationen bereitgestellt. Im Allgemeinen erzeugt das klassische Einpunkt-LPC-Injektionsmodell nur eine lokale Demyelinisierung an der Injektionsstelle und wird oft von einer spontanen Remyelinisierungbegleitet 12,13. Das Zwei-Punkt-Injektions-LPC-Modell kann jedoch zeigen, dass der LPC eine Demyelinisierung im Mouse Corpus callosum direkt induzieren und eine dauerhaftere Demyelinisierung mit geringer Myelinregeneration verursachen kann.

Protocol

Alle Tierverfahren wurden vom Institute of Animal Care Committee des Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, China, genehmigt. Für die vorliegende Studie wurden erwachsene männliche und weibliche C57BL/6-Mäuse (Wildtyp, WT; 20-25 g; 8-10 Wochen alt) verwendet. Die Mäuse wurden aus kommerziellen Quellen gewonnen (siehe Materialtabelle). Die Mäuse wurden in einer speziellen pathogenfreien (SPF) Tieranlage untergebracht, in der Wasser und Nahrung ad libitum gelie…

Representative Results

Die Zwei-Punkt-Injektion des LPC führte zu einer dauerhafteren DemyelinisierungLPC führt hauptsächlich zu schnellen Schäden mit Toxizität für Myelin und Spaltung der Axonintegrität15. Der Tag der Injektion wurde als Tag 0 angesehen. Die Mäuse wurden über einen Zeitraum von 10-28 Tagen (10 dpi und 28 dpi) gehalten. Luxol Fast Blue (LFB) Färbung10 wurde verwendet, um den Bereich der Demyelinisierung bei Mäusen zu diesen Zeitpunkten zu bewerten….

Discussion

MS, eine chronisch demyelinisierende Erkrankung des ZNS, ist eine der häufigsten Ursachen für neurologische Funktionsstörungen bei jungen Erwachsenen20 Jahren. Klinisch erleben etwa 60%-80% der MS-Patienten den Zyklus von Rückfällen und Remissionen, bevor sie eine sekundär-progrediente MS 21,22 entwickeln, und es führt schließlich zu kumulativen Bewegungsstörungen und kognitiven Defiziten im Laufe der Zeit23.</su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grants: 82071380, 81873743) unterstützt.

Materials

L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk Sigma-Aldrich L4129-25MG
32 gauge Needle HAMILTON 7762-05
10 μl syringe HAMILTON 80014
high speed skull drill strong,korea strong204
drill Hager & Meisinger, Germany  REF 500 104 001 001 005
Matrx Animal Aneathesia Ventilator MIDMARK VMR
Portable Stereotaxic Instrument for Mouse Reward 68507
Micro syringe Reward KDS LEGATO 130
Isoflurane  VETEASY
Paraformaldehyde Servicebio G1101
Phosphate buffer BOSTER PYG0021
LuxoL fast bLue Servicebio G1030-100ML
Suture FUSUNPHARMA 20152021225
Brain mold Reward 68707
Electron microscope fixative Servicebio G1102-100ML
Neutral red (C.I. 50040), for microscopy Certistain Sigma-Aldrich 1.01376
Anti-Myelin Basic Protein Antibody  Millipore #AB5864
Anti-GST-P pAb MBL #311
Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15) Thermo Fisher Scientific 14-5698-95
Beta Actin Monoclonal Antibody Proteintech 66009-1-Ig 
Myelin Basic Protein Polyclonal Antibody Proteintech 10458-1-AP
OLIG2 Polyclonal Antibody Proteintech 13999-1-AP
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) YEASEN 34206ES60
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)  YEASEN 34412ES60
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)  YEASEN 34212ES60
HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) abclonal AS014
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L)  abclonal AS003
Adult C57BL/6 male and female mice Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd

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Pang, X., Chen, M., Chu, Y., Tang, Y., Qin, C., Tian, D. A Stably Established Two-Point Injection of Lysophosphatidylcholine-Induced Focal Demyelination Model in Mice. J. Vis. Exp. (183), e64059, doi:10.3791/64059 (2022).

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