Uma injeção de dois pontos estabelecida stably de lysophosphatidylcoline-Induced Focal Demyelination Modelo em camundongos
Summary
O presente protocolo descreve uma injeção de dois pontos de linfosfatilcolina através de um quadro estereotaxico para gerar um modelo de desmielinização estável e reprodutível em camundongos.
Abstract
A sinalização linfosfolipídida mediada por receptores contribui para a fisiopatologia de diversas doenças neurológicas, especialmente a esclerose múltipla (EM). Lisofosphatidylcholina (LPC) é uma lisofosfosfolipídio endógena associada à inflamação, e pode induzir danos rápidos com toxicidade aos lipídios de mielina, levando à desmielinização focal. Aqui, um protocolo detalhado é apresentado para injeção estereotática de LPC de dois pontos que poderia causar diretamente desmielinização grave e replicar a lesão de desmielinização experimental rapidamente e stably em camundongos por procedimento cirúrgico. Assim, esse modelo é altamente relevante para as doenças de desmielinização, especialmente a ESM, podendo contribuir para o avanço clínico da pesquisa. Além disso, os métodos de coloração azul rápido e imunofluorescência e Luxol foram usados para retratar o curso do tempo da desmielinização no caloso corpus de camundongos injetados com LPC. Além disso, o método comportamental foi utilizado para avaliar a função cognitiva dos camundongos após a modelagem. No geral, a injeção de dois pontos de linfosfatidylcholina através de um quadro estereotaxico é um método estável e reprodutível para gerar um modelo de dessalinização em camundongos para estudos posteriores.
Introduction
A sinalização linfosfolipídica mediada por receptores envolve diversos processos fisiológicos de quase todos os sistemasde órgãos 1. No sistema nervoso central (SNC), essa sinalização desempenha um papel crítico nas patógenias de doenças neurológicas autoimunes, como a esclerose múltipla (EM). A esclerose múltipla é uma doença imunomediada crônica caracterizada por desmielinização patológica e resposta inflamatória, causando disfunção neurológica e comprometimento cognitivo 2,3. Após uma recaída contínua e a remissão durante a doença precoce, a maioria dos pacientes eventualmente evolui para o estágio secundário-progressivo, o que poderia causar danos irreversíveis ao cérebro e incapacidaderesultante 4. Acredita-se que a marca patológica do curso secundário-progressivo é a desmielinização de placas causadas por lesões inflamatórias5. Os tratamentos existentes para ESM podem reduzir significativamente o risco de recaída. No entanto, ainda não há terapia eficaz para danos desmielinizados de longo prazo causados pela ESMprogressiva 6. Assim, é necessário um modelo estávelmente estabelecido e facilmente reprodutível para estudar terapêuticas pré-clínicas que se concentrem na degeneração da matéria branca.
Demielinização e remiellinação são dois grandes processos patológicos no desenvolvimento da esclerose múltipla. A demyelinação é a perda da baia de mielina em torno de axônios induzidos por microglia com fenótipos pró-inflamatórios7, e leva à condução lenta de impulsos nervosos e resulta na perda de neurônios e distúrbios neurológicos. A remielinação é uma resposta endógena de reparo mediada por oligodenrócitos, onde distúrbios podem levar à neurodegeneração e comprometimento cognitivo8. A resposta inflamatória é crucial para todo o processo, afetando tanto o grau de dano e reparação da mielina.
Portanto, um modelo animal estável de desmielinização inflamatória persistente é significativo para a exploração de estratégias terapêuticas para MS. Devido à complexidade da ESM, vários tipos de modelos animais foram estabelecidos para imitar lesões desmielinizadoras in vivo, incluindo encefalomielite autoimune experimental (EAE), modelos tóxicos-desmielinizadores, cuprizone (CPZ) e linfosfatilina (LPC)9 . LPC é um lysofosfolipídio endógeno associado à inflamação, e pode induzir danos rápidos com toxicidade aos lipídios de mielina, levando à dessalinização focal. Com base em relatórios anteriores e pesquisas10,11, é fornecido um protocolo detalhado de injeção de dois pontos com algumas modificações. Geralmente, o modelo clássico de injeção LPC de um ponto só produz desmielinização local no local da injeção e é frequentemente acompanhado de remielinização espontânea12,13. No entanto, o modelo LPC de injeção de dois pontos pode demonstrar que o LPC pode induzir diretamente a desmielinização no calosum do corpus do mouse e causar desmielinização mais durável com pouca regeneração de mielina.
Protocol
Representative Results
Discussion
A ESM, doença desmielinização crônica do SNC, é uma das causas mais comuns de disfunção neurológica em adultos jovens20. Clinicamente, aproximadamente 60%-80% dos pacientes com ES experimentam o ciclo de recaídas e remissões antes de desenvolver umaESM 21,22 secundária-progressiva, e isso eventualmente leva a prejuízos de movimento cumulativos e déficits cognitivos ao longo do tempo23. Atualmente, nenhu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (Grants: 82071380, 81873743).
Materials
| L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk | Sigma-Aldrich | L4129-25MG | |
| 32 gauge Needle | HAMILTON | 7762-05 | |
| 10 μl syringe | HAMILTON | 80014 | |
| high speed skull drill | strong,korea | strong204 | |
| drill | Hager & Meisinger, Germany | REF 500 104 001 001 005 | |
| Matrx Animal Aneathesia Ventilator | MIDMARK | VMR | |
| Portable Stereotaxic Instrument for Mouse | Reward | 68507 | |
| Micro syringe | Reward | KDS LEGATO 130 | |
| Isoflurane | VETEASY | ||
| Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | |
| Phosphate buffer | BOSTER | PYG0021 | |
| LuxoL fast bLue | Servicebio | G1030-100ML | |
| Suture | FUSUNPHARMA | 20152021225 | |
| Brain mold | Reward | 68707 | |
| Electron microscope fixative | Servicebio | G1102-100ML | |
| Neutral red (C.I. 50040), for microscopy Certistain | Sigma-Aldrich | 1.01376 | |
| Anti-Myelin Basic Protein Antibody | Millipore | #AB5864 | |
| Anti-GST-P pAb | MBL | #311 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15) | Thermo Fisher Scientific | 14-5698-95 | |
| Beta Actin Monoclonal Antibody | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| Myelin Basic Protein Polyclonal Antibody | Proteintech | 10458-1-AP | |
| OLIG2 Polyclonal Antibody | Proteintech | 13999-1-AP | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34206ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | YEASEN | 34412ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34212ES60 | |
| HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | abclonal | AS014 | |
| HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | abclonal | AS003 | |
| Adult C57BL/6 male and female mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd |
References
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