Summary
본 프로토콜은 마우스에서 안정하고 재현가능한 탈수초화 모델을 생성하기 위해 입체택시 프레임을 통해 리소포스파티딜콜린의 두 점 주사를 기술한다.
Abstract
수용체-매개 lysophospholipid 신호전달은 다양한 신경 질환, 특히 다발성 경화증 (MS)의 병태생리학에 기여한다. 리소포스파티딜콜린(LPC)은 염증과 관련된 내인성 리소포스포지질이며, 미엘린 지질에 대한 독성으로 빠른 손상을 유도하여 초점 탈수초화를 유도할 수 있다. 여기에서, 심각한 탈수초화를 직접적으로 야기하고 외과적 절차에 의해 마우스에서 실험적 탈수초화 손상을 신속하고 안정적으로 복제할 수 있는 입체 전술 이점 LPC 주사에 대한 상세한 프로토콜이 제시된다. 따라서, 이 모델은 탈수초화 질환, 특히 MS와 매우 관련이 있으며, 임상적으로 관련된 연구를 진행시키는 데 기여할 수 있다. 또한, LPC를 주입한 마우스의 코퍼스 캘로섬에서 탈수초화의 시간 과정을 묘사하기 위해 면역형광 및 룩솔 패스트 블루 염색 방법을 사용하였다. 또한, 행동 방법은 모델링 후 마우스의 인지 기능을 평가하기 위해 사용되었다. 전반적으로, 입체택시 프레임을 통한 리소포스파티딜콜린의 두 점 주사는 추가 연구를 위해 마우스에서 탈수초화 모델을 생성하는 안정하고 재현가능한 방법이다.
Introduction
수용체-매개 lysophospholipid 신호전달은 거의 모든 장기 시스템의 다양한 생리학적 과정을 수반한다1. 중추 신경계 (CNS)에서,이 신호 전달은 다발성 경화증 (MS)과 같은자가 면역 신경 질환의 병원성에 중요한 역할을합니다. 다발성 경화증은 병리학적 탈수초화 및 염증 반응을 특징으로 하는 만성 면역 매개 장애로, 신경학적 기능 장애 및 인지 장애를 일으킨다2,3. 초기 질병 동안 지속적인 재발 및 재발 후, 대부분의 환자는 결국 이차적 인 진행성 단계로 진행하여 뇌에 돌이킬 수없는 손상을 입히고 이로 인한 장애를 일으킬 수 있습니다4. 이차-진행성 과정의 병리학적 특징은 염증성 병변에 의한 탈수초성 플라크5라고 여겨진다. MS에 대한 기존의 치료법은 재발의 위험을 상당히 줄일 수 있습니다. 그러나, 진행성 MS6에 의해 야기된 장기간의 탈수초성 손상에 대한 효과적인 치료법은 여전히 없다. 따라서, 백질 변성에 초점을 맞춘 전임상 치료제를 연구하기 위해서는 안정하게 확립되고 쉽게 재현 가능한 모델이 요구된다.
탈수초화와 수초화는 다발성 경화증 발병의 두 가지 주요 병리학 적 과정입니다. 탈수초화는 전염증성 표현형7을 가진 미세아교세포에 의해 유도되는 축삭돌기 주위의 미엘린 외피의 손실이며, 이는 신경 충동의 느린 전도를 유도하고 뉴런 및 신경 장애의 손실을 초래한다. Remyelination은 희소 돌기 세포에 의해 매개되는 내인성 복구 반응으로, 장애는 신경 퇴행 및인지 장애로 이어질 수 있습니다8. 염증 반응은 전체 과정에 결정적이며, 미엘린 손상과 복구의 정도에 모두 영향을 미칩니다.
따라서, 지속성 염증성 탈수초화의 안정한 동물 모델은 MS에 대한 치료 전략의 추가 탐구에 의미가 있다. MS의 복잡성으로 인해, 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE), 독성-탈수초성 모델, 큐프리존(CPZ), 및 리소포스파티딜콜린(LPC)9을 포함하는 생체 내에서 탈수초성 병변을 모방하기 위한 다양한 유형의 동물 모델이 확립되었다9 . LPC는 염증과 관련된 내인성 lysophospholipid이며, 미엘린 지질에 대한 독성으로 빠른 손상을 유도하여 초점 탈수초화를 유발할 수 있습니다. 이전 보고서 및 연구10,11에 기초하여, 일부 수정과 함께 두 점 주입의 상세한 프로토콜이 제공된다. 일반적으로, 고전적인 원포인트 LPC 주사 모델은 주사 부위에서 국소 탈수초화만을 생성하며 종종 자발적 수초화12,13을 동반한다. 그러나, 이점 주사 LPC 모델은 LPC가 마우스 코퍼스 캘로섬에서 탈수초화를 직접 유도할 수 있고 미엘린 재생이 거의 없는 더 내구성 있는 탈수초화를 야기할 수 있음을 입증할 수 있다.
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Protocol
모든 동물 절차는 중국 Huazhong 과학 기술 대학 Tongji Medical College의 동물 관리위원회 연구소의 승인을 받았습니다. 성인 C57BL/6 수컷 및 암컷 마우스(야생형, WT; 20-25 g; 8-10주령)를 본 연구에 사용하였다. 마우스를 상업적 공급원으로부터 수득하였다( 물질의 표 참조). 마우스는 특정 병원체가 없는 (SPF) 동물 시설에 수용되었고, 물과 식량이 공급된 광고 리비툼을 가졌다. 22°C 온도 및 55%-60%의 상대 습도의 표준 조건에서 빛과 어둠 사이클의 교대로 12시간 주기로 유지하였다.
1. LPC 용액 준비
- LPC 분말 25mg( 물자표 참조)을 250μL의 클로로포름과 메탄올 혼합용액(1:1)에 녹여 10% LPC 용액을 만들고 이를 500μL 원심분리 튜브로 옮긴다.
참고 : LPC가 완전히 용해되지 않은 경우 원심 분리 튜브를 초음파 세척기에 넣고 40kHz의 초음파 처리수를 ~ 1 시간 동안 배치하여 균일 한 솔루션을 얻으십시오. - 용액을 3 μL/튜브로 나누고 -80°C에서 보관하십시오.
참고 : 솔루션은 ~ 2 년 동안 저장할 수 있습니다. - 수술 전에, 0.9% NaCl 용액 중 27 μL로 용액을 희석하고(단계 1.2.) 용액을 37°C의 항온 수조에 보관한다.
참고 : 주사를 시작하기 직전에 용액을 준비하십시오.
2. 외과 적 준비
- 32 G, 2 바늘을 사용하여 5 μL 주사기에 연결 한다(재료 표 참조). 마이크로리터 주사기가 막히지 않았는지 확인하십시오. 주사제의 제조를 위해 LPC 용액 5 μL를 인출한다.
- 마우스를 약 0.3 L/min의 속도로 100% 산소와 혼합된 3% 이소플루란이 있는 이소플루란 기화기에 연결된 유도 챔버에서 마취시킨다.
- 호흡이 원활하는 동안 발가락 꼬집음 반사의 부족으로 마취의 깊이를 확인하십시오.
- 전기 면도기를 사용하여 마우스 머리를 귀 사이에 면도하십시오. 시술 중 각막 건조를 방지하기 위해 윤활 점안액을 바르십시오.
- 그런 다음 마우스를 등쪽을 위로 향하게하여 입체 택시 프레임 ( 재료 표 참조)에 놓고 코 콘과 치아 클램프로 머리를 고정하십시오. 코를 통해 1.2 % -1.6 % 이소 플루란으로 마취를 유지하십시오.
참고: 이소플루란 농도는 마우스의 호흡 상태에 따라 조절될 수 있다.
3. 수술 절차
참고 : 동물은 모든 절차 중에 가열 패드에 배치됩니다.
- 마우스를 양측 귀 막대가있는 입체 택시 장치에 고정시킵니다. 이어 바가 수평이고 머리가 수평이고 안정적인지 확인하십시오.
- 요오도포어로 여러 번 닦은 다음 원형 운동으로 알코올을 닦아 머리의 피부를 소독하십시오. 그런 다음 메스를 사용하여 두피의 중간 선을 따라 약 1.5cm의 작은 절개를 잘라 두개골을 노출시킵니다.
- 브레그마, 람다 및 후부 폰타넬이 노출 될 때까지 1 % 과산화수소에 담근 면봉으로 두개골을 닦으십시오. 주사기를 입체 택시 장치에 놓습니다.
참고: 과산화수소를 조심스럽게 사용하고 주변 조직에 닿지 않도록 하십시오. - 동물의 머리 (앞면과 뒷면, 왼쪽 및 오른쪽 모두)의 수평 위치를 확인하십시오.
- 입체 택시 프레임의 Z 축 손잡이를 조정하여 바늘 팁과 두개골이 구부러지지 않고 만지도록 한 다음 Z 축 좌표를 측정하십시오. 브레그마와 후부 폰타넬의 Z 좌표를 확인하십시오.
- 브레그마와 후부 폰타넬의 Z 좌표 간의 차이가 0.02mm를 넘지 않도록 이어 바를 조정하십시오. 그런 다음 동일한 방법을 따라 미드 라인의 왼쪽 및 오른쪽에있는 해당 위치의 Z 좌표를 측정합니다. 이어 바를 조정하여 왼쪽과 오른쪽이 같은 레벨에 있도록 합니다.
- 코퍼스 캘로섬을 찾습니다. XYZ 원점을 브레그마로 설정합니다.
참고: 첫 번째 주입 부위는 브레그마에 측면 1.0mm, 깊이 2.4mm, 전방 1.1mm입니다. 두 번째 주사 부위는 브레그마에 대해 측면 1.0mm, 깊이 2.1mm, 전방 0.6mm이다. 예를 들어, 브레그마의 좌표는 (0,0,0)입니다. (-1, 1.1, X) 및 (-1, 0.6, Y)로 표시된 해당 위치의 Z 좌표를 측정합니다. 캘로섬의 제1 주사 부위 좌표는 (-1, 1.1, -[X + 2.4])이고, 제2 주사 부위는 (-1, 0.6, -[Y + 2.1])이다. - 주사 부위가 결정되면 두개골에 멸균 마커가있는 표시를하고 좌표를 기록하십시오.
- 두개골 드릴로 표시된 부위를 부드럽게 천공 하십시오 (재료 표 참조). 출혈을 피하기 위해주의하십시오.
- 바늘을 주어진 좌표로 천천히 움직이고 주사를 시작하십시오. 코퍼스 캘로섬 탈수초화를 유도하기 위해, LPC 용액 2 μL를 각 주사 부위(단계 3.5.)에 0.4 μL/분의 속도로 주입한다(단계 1.).
- 주사 후, 추가 10 분 동안 각 부위에 바늘을 보관하십시오.
참고 : 두 번의 주사 간격이 20 분을 넘지 않도록하십시오. - 4-0 봉합사로 피부를 봉합하고 동물이 10 분 이내에 깨어날 때까지 기다리십시오. 제도적 동물 관리 규정에 따라 수술 후 진통제를 투여하십시오.
참고: 안락사에 권장되는 시간은 실험 목적에 따라 결정될 수 있습니다.
4. 초점 탈수초화를 위한 샘플 추출
참고: 이 단계에 대한 자세한 내용은 이전에 게시된 보고서14를 참조하십시오.
- 중성 적색 염료( 표 표 참조)를 인산완충식염수(PBS)에 1% 용액에 용해시킨다.
- 마우스를 희생시키기 몇 시간 전(자세한 내용은 이전 참조10 참조), 각 마우스에 복강내 주사에 의해 PBS에 1% 중성 적색 염료 500 μL를 주입한다.
- 4°C에서 예냉된 0.1% PBS 30 mL로 심장 관류12 를 수행한다.
- 뇌 곰팡이가있는 뇌를 1mm로 슬라이스 하십시오 (재료 표 참조).
- 현미경으로 중성 적색으로 염색 된 병변을 시각화하고 병변을 해리시킵니다.
참고: 후속 분석의 정확도를 높이기 위해 가능한 한 많은 주변 정상 조직을 제거하십시오. 병변 조직은 RT-PCR, 전자 현미경 검사 및 웨스턴 블롯 분석으로 검사 할 수 있습니다.
5. 조직학적 염색 및 면역형광
- 조직학적 염색 및 면역형광 12를 위해, 심장 관류 후(단계 4.3.), 뇌(10)를 제거하고, 하룻밤(4°C에서) 4% PFA에 고정하고,30% 수크로스에서 완전히 탈수시켰다.
- 항온(-20°C)에서 냉동 슬라이서(10)를 사용하여20mm 관상 동맥 뇌 절편으로 절단한다.
- 룩솔 패스트 블루(LFB) 염색, 면역형광 및 웨스턴 블롯10을 위해 슬라이스를 사용한다.
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Representative Results
LPC의 두 점 주입은 더 내구성있는 탈수초화를 가져 왔습니다.
LPC는 주로 미엘린에 대한 독성과 축삭 완전성15의 절단으로 인한 급격한 손상을 초래한다. 주사 날은 0일째로 간주하였다. 마우스를 10-28일 동안 유지하였다(10 dpi 및 28 dpi). 룩솔 패스트 블루(LFB) 염색10을 사용하여 이들 시점에서 마우스에서 탈수초화 면적을 평가하였다. 두 점 주입 모델에서, 가짜 그룹에 비해 10dpi에서 상당한 탈수초화가 있었으며, LPC의 국소 주사가 코퍼스 캘로섬을 성공적으로 탈수초시킬 수 있음을 보여줍니다. 비교적 높은 수준의 탈수초화가 여전히 28dpi에서 존재하며, 이는 2점 LPC 주입으로 인한 지속적이고 안정적인 탈수초화를 나타낸다(그림 1D-E).
미엘린 시스의 손실을 추가로 평가하기 위해, 10일이 탈수초화가 비교적 명백할 때 핵심 시점으로 선택되었다. 면역형광 염색을 통해 분해된 미엘린 염기성 단백질(dMBP)은 10dpi에서 LPC 주입군에서 dMBP의 현저한 증가가 관찰되었으며(도 1F), 이는 캘로섬에서 미엘린 손실을 나타낸다. 또한, 얻어진 병변 조직의 단백질(단계 4.)을 웨스턴 블롯으로 MBP의 발현을 분석하는데 사용하였다. 프로토콜에 따라 모델링한 후, MBP는 상당한 손실을 보였다(도 1G). 이러한 결과는 LFB 및 면역형광 염색과 일치하였다.
LPC 주사 10일 후 캘로섬 내의 미엘린 형태를 전자현미경으로 관찰하였다(단계 4에 따라 병변 조직을 추출하였다). 명백한 탈수초화는 모델링의 성공을 확인합니다(그림 2).
두 점 LPC 주사가 미엘린 재생에 영향을 미쳤습니다.
올리고덴드로사이트(OLGs)의 분화 및 성숙은 MS에서 미엘린 시스를 복구하는 데 중요한 역할을 합니다. 미엘린 재생은 주로 올리고덴드로사이트 전구체 세포(OPCs)를 수초화 올리고수지상세포로 분화시킴으로써 발생합니다. 따라서, 미엘린 복구 과정은 OPCs를 OLGs로의 분화가 차단되면 영향을 받을 것이다. Gst-π는 OPC 분화 성숙16의 마커이다. LPC 주입 10일 후, 면역형광을 통해 가짜군에 비해 Gst-π이 감소하는 것을 알 수 있다(도 3A). 동시에, 희소돌기아교세포의 증식능은 Ki67(올리고덴드로사이트 증식)과 Olig2(총 희소돌기아교세포 계통세포)17,18의 비율에 의해 반영될 수 있다. Ki67/Olig2+ 공동국소화 비율이 높을수록 10dpi 후 희소돌기아교세포의 증식이 더 심하다는 것을 나타낸다(도 3B). 이들 이미지는 병변 영역이 LPC 주사 후 OPCs의 성숙 및 증식을 통해 복구를 시도한다는 것을 시사한다.
두 점 LPC 주입은 마우스의 공간 기억을 손상시켰다.
마우스에서 LPC 주입의 공간 기억 능력을 분석하기 위해, 모리스 워터 미로(WMM)19 를 사용하였고, 가짜 마우스와 LPC 주입된 마우스 사이의 수영 속도에 차이가 없음을 보여주었다. 그러나 Morris 수중 미로에서 플랫폼을 제거하면 숨겨진 플랫폼을 찾는 대기 시간이 줄어들었고 (공간 학습 장애), 대상 사분면에 소요되는 시간이 증가했습니다 (메모리 보존 장애). 결과는 탈수초화 마우스의 공간 기억이 이점 LPC 주사 모델에서 유의하게 손상된다는 것을 시사한다. 상이한 실험에 사용된 동물의 수는 표 1 에 열거되어 있다. 각 마우스는 2 일째 또는 20 일째에 시작하여 훈련을 받았다.
도 1: LPC 유도된 탈수초화의 2점 주사. (A) 주사 부위의 표현(1.0 mm 측방, 2.4 mm 깊이, 및 1.1 mm 전방). (B) 주사 부위의 표현 (측면 1.0mm, 깊이 2.1mm 및 전방 0.6mm). (C) 탐지 시점의 예시. (d) LFB 염색을 통한 백질 병변의 검출. LFB 염색은 주사 후 10일째(dpi) 및 28 dpi에서, 코퍼스 캘로섬의 지속적인 탈수초화를 나타내었다(스케일 바 = 200 μm). (E) 상이한 시점에서의 탈수초화 영역의 정량화. 데이터는 SD, 단방향 ANOVA± 평균 및 Bonferroni의 다중 비교 테스트로 표시됩니다. ****p < 0.0001, n = 6 그룹당. (f) 코퍼스 캘로섬에서의 dMBP 면역염색의 대표적인 이미지(스케일 바 = 100 μm). dMBP가 거의 없었던 sham과 비교할 때, LPC 주사 후에 명백한 dMBP를 볼 수있었습니다. (g) MBP 발현의 웨스턴 블롯 분석. MBP는 LPC의 주사 후 상당한 손실을 보였다. β-액틴을 기준선 발현을 측정하기 위한 로딩 대조군으로서 사용하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: LPC 주입 마우스에서 탈수초화된 마우스와 비교하여 가짜의 코퍼스 캘로섬에서 수초화된 초구조를 확인하는 전자 현미경 이미지(스케일 바 = 1 μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 2점 주사는 OPCs의 성숙 및 증식에 영향을 미쳤다. (A) 가짜 및 LPC 주입된 마우스의 코퍼스 캘로섬에서 GST-π의 대표적인 이미지(스케일 바 = 20 μm). 빨간색은 GST-π을 의미합니다. (b) Olig2 및 Ki67 공동 현지화의 대표적인 이미지(스케일 바 = 20 μm). 빨간색은 Ki67을 의미하고 녹색은 Olig2를 나타냅니다. 이미지는 488nm 및 594nm 레이저 라인을 갖는 공초점 현미경 시스템을 사용하여 캡처되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: LPC 주입으로 인한 공간 기억 장애. (A) 플랫폼의 존재하에 있는 각 그룹에서 마우스의 수영 경로의 대표적인 이미지(학습 단계). (b) 플랫폼을 제거한 후 각 그룹에서 마우스의 수영 경로의 대표적인 이미지(기억 단계). 사용된 동물의 수는 표 1에 열거되어 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 그룹 | 가짜 | LPC 그룹 |
| LFB 염색 | 6 | 12 (10 dpi, 6; 28 dpi, 6) |
| 전자 현미경 검사 | 4 | 4 |
| 면 | 6 | 6 |
| 웨스턴 블롯 | 4 | 4 |
| 모리스 워터 미로 | 12 | 12 |
표 1: 상이한 시험에 사용된 동물의 수.
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Discussion
MS, CNS의 만성 탈수초성 질환은 젊은 성인20에서 신경 기능 장애의 가장 흔한 원인 중 하나입니다. 임상적으로, MS 환자의 약 60%-80%는 이차-진행성 MS21,22를 개발하기 전에 재발 및 재발의 사이클을 경험하고, 결국 시간 23에 따른 누적 운동 장애 및 인지 결핍을 초래한다. 현재, 어떠한 단일 실험 모델도 질환(24)의 임상적, 병리학적, 또는 면역학적 특징의 전체 다양성을 포괄하지 않는다. 서로 다른 단계에서 MS의 병리학 적 과정과 병인을 시뮬레이션하기 위해 EAE 모델, 먹이 동물 CPZ 및 LPC 유도 탈수초화 모델을 포함하여 장점과 한계를 가진 세 가지 일반적인 탈수초성 동물 모델이 있습니다.
마우스에서, EAE는 미엘린 항원의 주사 후 면역 반응에 의해 유도되고, 미세아교세포 활성화 및 혈관주위 T 및 B 림프구의 침윤을 초래하고, 수반되는 미엘린 손상은 종종 질환20,25의 재발과 관련된다. MS 재발-방출 기간의 특성을 더 잘 시뮬레이션한다. 그러나 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, EAE는 주로 척수의 백질에 영향을 미치는 질병인 반면, MS는 주로 대뇌 피질의 탈수초화를 일으키고, 병변의 위치와 시기는 무작위적이어서 병변을 정확하게 얻기 어렵다19.
CPZ 및 LPC는 독성 탈수초성 모델을 유도하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 물질입니다. 그들은 모두 투여 후 CNS 탈수초화를 일으킬 수 있습니다. CPZ 모델에서, 어린 마우스에게 구리 킬레이터 큐프리존을 먹이면 올리고덴드로사이트 사멸 및 후속적인 가역적 탈수초화가 초래되었다. cuprizone의 철수 후, 4 일 이내에 자발적인 수초화 과정이 촉발되었다26,27. CPZ는 주로 광범위한 탈수초화를 초래하는 반면, LPC 주입은 초점 탈수초화로 기울어집니다. 독소 및 염증 반응으로 인해, LPC의 고전적인 원포인트 주사는 신속하고 재현성이 높은 형태의 탈수초화(28)를 촉발시킨다.
그러나, 상기 모델 중 어느 것도 지속적인 탈수초화를 특징으로 하는 진행성 MS의 병리학적 과정을 적절하게 모방할 수 없다. 따라서, 본 프로토콜은 장기 탈수초화를 유도하기 위해 LPC를 캘로섬 내로 직접 투-포인트 주사하기 위한 모델을 제안한다. 프로토콜의 중요한 단계에는 동물의 머리를 수평으로 조정하고 주사 좌표를 찾는 것이 포함됩니다. 3.5 단계에서 먼저 브레그마 및 후부 폰타넬 레벨을 조정 한 다음 왼쪽 및 오른쪽 레벨을 조정해야합니다. 동시에 왼쪽 및 오른쪽 수준을 조정 한 후에는 후속 작업 전에 영점을 재배치해야한다는 점에 유의해야합니다. 이 단계는 포지셔닝의 정확성과 직접 관련이 있기 때문에 중요합니다. 3.6 단계에서 Z 축의 좌표를 결정할 때 바늘과 두개골의 끝이 정확히 접촉하고 있는지 확인하고 연구원은 바늘이 구부러져 있는지 여부를 관찰 할 수 있어야합니다. 단계 3.10.에서, 바늘은 바늘 통로에서 약물이 유출되는 것을 방지하기 위해 10분 동안 제자리에 머무른다.
본 프로토콜에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 다른 독성-유도된 탈수초화 모델과 마찬가지로, 면역학적 과정의 모델링이 결여되어 있다. 둘째, 두 점 주사 모델이 비교적 오랜 시간 동안 탈수초화를 유지할 수 있지만, 질병이 후기 단계로 진행됨에 따라 필연적으로 약간의 미엘린 재생이 수반됩니다. 미엘린 올리고덴드로사이트 당단백질(MOG)-유도된 실험적 자가면역 뇌척수염29,30보다 이차 진행성 다발성 경화증을 시뮬레이션하기에 더 적합한 모델이 아닐 수 있다. 고전적인 원포인트 LPC 주사 모델은 자발적인 재수초화를 동반한 국소화된 염증성 탈수초화만을 생산합니다. 이전의 연구는 LPC 주사 후 T 세포, B 세포 및 대식세포의 침윤이 미엘린 복구의 핵심 요소임을 보여주었습니다15. 그러나, 고전적인 주입 모델과 비교하여, 두 점 주입 LPC 모델은 코퍼스 캘로섬의 신속한 초점 탈수초화를 유도하고 거의 재수초화하지 않고 더 오랜 기간 동안 탈수초화 정도를 유지합니다.
MS의 복잡성으로 인해 다른 질병 단계는 다른 모델을 더 잘 설명해야합니다. 입체 택시 프레임을 통한 LPC의 두 지점 주입은 안정적이고 효율적이며 재현 가능한 실험 마우스 모델입니다. 이 모델은 시간이 지남에 따라 미엘린 수리가 줄어들면서 장기간의 탈수초화로 이어질 수 있습니다. 즉, 두 점 주사 모델은 탈수초 질환을 연구 할뿐만 아니라 미엘린 복구 중재를 연구하는 데에도 사용될 수 있습니다. 게다가, 이 모델은 면역형광 및 조직학적 방법을 통해 개입 후 탈수초화를 쉽고 신속하게 평가할 수 있으며, MS의 인지 기능장애는 행동 테스트에서 탈수초화 마우스의 손상된 공간 기억에 의해 반영될 수 있다. 결론적으로, 안정한 탈수초화의 이러한 모델은 MS의 이차 진행과 재발-재발성 MS에 대한 병리학적 및 전임상 연구 둘 다를 촉진할 수 있었다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (Grants : 82071380, 81873743)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk | Sigma-Aldrich | L4129-25MG | |
| 32 gauge Needle | HAMILTON | 7762-05 | |
| 10 μl syringe | HAMILTON | 80014 | |
| high speed skull drill | strong,korea | strong204 | |
| drill | Hager & Meisinger, Germany | REF 500 104 001 001 005 | |
| Matrx Animal Aneathesia Ventilator | MIDMARK | VMR | |
| Portable Stereotaxic Instrument for Mouse | Reward | 68507 | |
| Micro syringe | Reward | KDS LEGATO 130 | |
| Isoflurane | VETEASY | ||
| Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | |
| Phosphate buffer | BOSTER | PYG0021 | |
| LuxoL fast bLue | Servicebio | G1030-100ML | |
| Suture | FUSUNPHARMA | 20152021225 | |
| Brain mold | Reward | 68707 | |
| Electron microscope fixative | Servicebio | G1102-100ML | |
| Neutral red (C.I. 50040), for microscopy Certistain | Sigma-Aldrich | 1.01376 | |
| Anti-Myelin Basic Protein Antibody | Millipore | #AB5864 | |
| Anti-GST-P pAb | MBL | #311 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15) | Thermo Fisher Scientific | 14-5698-95 | |
| Beta Actin Monoclonal Antibody | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| Myelin Basic Protein Polyclonal Antibody | Proteintech | 10458-1-AP | |
| OLIG2 Polyclonal Antibody | Proteintech | 13999-1-AP | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34206ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | YEASEN | 34412ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34212ES60 | |
| HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | abclonal | AS014 | |
| HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | abclonal | AS003 | |
| Adult C57BL/6 male and female mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd |
References
- Gaire, B. P., Choi, J. W. Critical roles of lysophospholipid receptors in activation of neuroglia and their neuroinflammatory responses. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7864 (2021).
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