Farelerde Lizofosfatidilkolin Kaynaklı Fokal Demiyelinasyon Modelinin Stably Olarak Kurulmuş İki Noktalı Enjeksiyonu
Summary
Mevcut protokol, farelerde stabil ve tekrarlanabilir bir demiyelinasyon modeli oluşturmak için stereotaksik bir çerçeve yoluyla iki noktalı bir lizofosfatidilkolin enjeksiyonunu tanımlamaktadır.
Abstract
Reseptör aracılı lizofosfolipid sinyalizasyonu, başta multipl skleroz (MS) olmak üzere çeşitli nörolojik hastalıkların patofizyolojisine katkıda bulunur. Lizofosfatidilkolin (LPC), inflamasyonla ilişkili endojen bir lizofosfolipiddir ve miyelin lipitlerine toksisite ile hızlı hasara neden olarak fokal demiyelinizasyona yol açabilir. Burada, stereotaktik iki noktalı LPC enjeksiyonu için doğrudan ciddi demiyelinasyona neden olabilecek ve deneysel demiyelinasyon hasarını cerrahi prosedürle farelerde hızlı ve istikrarlı bir şekilde çoğaltabilecek ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Bu nedenle, bu model demiyelinasyon hastalıkları, özellikle MS ile oldukça ilgilidir ve klinik olarak ilgili araştırmaların ilerlemesine katkıda bulunabilir. Ayrıca, LPC enjekte edilen farelerin korpus kallozumunda demiyelinizasyonun zaman seyrini göstermek için immünofloresan ve Luxol hızlı mavi boyama yöntemleri kullanılmıştır. Ek olarak, modelleme sonrası farelerin bilişsel işlevlerini değerlendirmek için davranışsal yöntem kullanılmıştır. Genel olarak, stereotaksik bir çerçeve yoluyla lizofosfatidilkolinin iki noktalı enjeksiyonu, daha fazla çalışma için farelerde bir demiyelinasyon modeli oluşturmak için kararlı ve tekrarlanabilir bir yöntemdir.
Introduction
Reseptör aracılı lizofosfolipid sinyalizasyonu, hemen hemen tüm organ sistemlerinin çeşitli fizyolojik süreçlerini içerir1. Merkezi sinir sisteminde (MSS), bu sinyal multipl skleroz (MS) gibi otoimmün nörolojik hastalıkların patojenitelerinde kritik bir rol oynar. Multipl skleroz, patolojik demiyelinasyon ve inflamatuar yanıt ile karakterize, nörolojik disfonksiyon ve kognitif bozukluğa neden olan kronik immün aracılı bir hastalıktır 2,3. Erken hastalık sırasında sürekli nüks ve remitting sonrasında, çoğu hasta sonunda beyinde geri dönüşü olmayan hasara ve sonuçta sakatlığa neden olabilecek ikincil-ilerleyici aşamaya ilerler4. İkincil-ilerleyici seyrin patolojik özelliğinin, enflamatuar lezyonların neden olduğu demiyelinizan plaklar olduğuna inanılmaktadır5. MS için mevcut tedaviler nüks riskini önemli ölçüde azaltabilir. Bununla birlikte, ilerleyici MS6’nın neden olduğu uzun süreli demiyelinizan hasar için hala etkili bir tedavi yoktur. Bu nedenle, beyaz cevher dejenerasyonuna odaklanan preklinik terapötikleri incelemek için istikrarlı bir şekilde kurulmuş ve kolayca çoğaltılabilir bir model gereklidir.
Demiyelinasyon ve remiyelinasyon, multipl skleroz gelişiminde iki önemli patolojik süreçtir. Demiyelinasyon, proinflamatuar fenotipler7 ile mikroglia tarafından indüklenen aksonların etrafındaki miyelin kılıfının kaybıdır ve sinir uyarılarının yavaş iletilmesine yol açarak nöron kaybına ve nörolojik bozukluklara neden olur. Remiyelinasyon, oligodendrositlerin aracılık ettiği, bozuklukların nörodejenerasyona ve bilişsel bozulmaya yol açabileceği endojen bir onarım yanıtıdır8. Enflamatuar yanıt, hem miyelin hasarının derecesini hem de onarımını etkileyen tüm süreç için çok önemlidir.
Bu nedenle, MS’in karmaşıklığı nedeniyle, deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), toksik-demiyelinizan modeller, cuprizon (CPZ) ve lizofosfatidilkolin (LPC)9 dahil olmak üzere in vivo demiyelinizan lezyonları taklit etmek için çeşitli hayvan modelleri oluşturulmuştur. . LPC, inflamasyonla ilişkili endojen bir lizofosfolipiddir ve miyelin lipitlerine toksisite ile hızlı hasara neden olabilir ve fokal demiyelinizasyona yol açabilir. Önceki raporlara ve araştırmalara dayanarak10,11, bazı modifikasyonlarla birlikte iki noktalı enjeksiyonun ayrıntılı bir protokolü sağlanmıştır. Genel olarak, klasik tek noktalı LPC enjeksiyon modeli sadece enjeksiyon bölgesinde lokal demiyelinasyon üretir ve sıklıkla spontan remiyelinasyon12,13 eşlik eder. Bununla birlikte, iki noktalı enjeksiyon LPC modeli, LPC’nin fare korpus kallozumunda doğrudan demiyelinasyonu indükleyebileceğini ve az miktarda miyelin rejenerasyonu ile daha dayanıklı demiyelinizasyona neden olabileceğini gösterebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
MSS’nin kronik demiyelinizan bir hastalığı olan MS, genç erişkinlerde nörolojik disfonksiyonun en yaygın nedenlerinden biridir20. Klinik olarak, MS hastalarının yaklaşık% 60-80’i, sekonder-ilerleyici bir MS 21,22 gelişmeden önce nüks ve remisyon döngüsünü yaşar ve sonunda kümülatif hareket bozukluklarına ve zamanla bilişsel eksikliklere yol açar23. Şu anda, tek bir deneysel model, hastalığ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı tarafından desteklenmiştir (Hibeler: 82071380, 81873743).
Materials
| L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk | Sigma-Aldrich | L4129-25MG | |
| 32 gauge Needle | HAMILTON | 7762-05 | |
| 10 μl syringe | HAMILTON | 80014 | |
| high speed skull drill | strong,korea | strong204 | |
| drill | Hager & Meisinger, Germany | REF 500 104 001 001 005 | |
| Matrx Animal Aneathesia Ventilator | MIDMARK | VMR | |
| Portable Stereotaxic Instrument for Mouse | Reward | 68507 | |
| Micro syringe | Reward | KDS LEGATO 130 | |
| Isoflurane | VETEASY | ||
| Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | |
| Phosphate buffer | BOSTER | PYG0021 | |
| LuxoL fast bLue | Servicebio | G1030-100ML | |
| Suture | FUSUNPHARMA | 20152021225 | |
| Brain mold | Reward | 68707 | |
| Electron microscope fixative | Servicebio | G1102-100ML | |
| Neutral red (C.I. 50040), for microscopy Certistain | Sigma-Aldrich | 1.01376 | |
| Anti-Myelin Basic Protein Antibody | Millipore | #AB5864 | |
| Anti-GST-P pAb | MBL | #311 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15) | Thermo Fisher Scientific | 14-5698-95 | |
| Beta Actin Monoclonal Antibody | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| Myelin Basic Protein Polyclonal Antibody | Proteintech | 10458-1-AP | |
| OLIG2 Polyclonal Antibody | Proteintech | 13999-1-AP | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34206ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | YEASEN | 34412ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34212ES60 | |
| HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | abclonal | AS014 | |
| HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | abclonal | AS003 | |
| Adult C57BL/6 male and female mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd |
References
- Gaire, B. P., Choi, J. W. Critical roles of lysophospholipid receptors in activation of neuroglia and their neuroinflammatory responses. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7864 (2021).
- Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
- Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis – a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
- Mahad, D. H., Trapp, B. D., Lassmann, H. Pathological mechanisms in progressive multiple sclerosis. The Lancet Neurology. 14 (2), 183-193 (2015).
- Filippi, M., et al. Multiple sclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 4 (1), 43 (2018).
- Villoslada, P., Steinman, L. New targets and therapeutics for neuroprotection, remyelination and repair in multiple sclerosis. Expert Opinion on Investigational Drugs. 29 (5), 443-459 (2020).
- Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (3), 028936 (2018).
- Franklin, R. J., Ffrench-Constant, C. Remyelination in the CNS: From biology to therapy. Nature Reviews Neuroscience. 9 (11), 839-855 (2008).
- Gentile, A., et al. Immunomodulatory effects of exercise in experimental multiple sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2197 (2019).
- Chen, M., et al. Deficiency of microglial Hv1 channel is associated with activation of autophagic pathway and ROS production in LPC-induced demyelination mouse model. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 333 (2020).
- Luo, Q., et al. A stable and easily reproducible model of focal white matter demyelination. Journal of Neuroscience Methods. 307, 230-239 (2018).
- Blakemore, W. F., Franklin, R. J. Remyelination in experimental models of toxin-induced demyelination. Current Topics in Microbiology and Immunology. 318, 193-212 (2008).
- Degaonkar, M. N., Raghunathan, P., Jayasundar, R., Jagannathan, N. R. Determination of relaxation characteristics during preacute stage of lysophosphatidyl choline-induced demyelinating lesion in rat brain: An animal model of multiple sclerosis. Magnetic Resonance Imaging. 23 (1), 69-73 (2005).
- Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
- Plemel, J. R., et al. Mechanisms of lysophosphatidylcholine-induced demyelination: A primary lipid disrupting myelinopathy. Glia. 66 (2), 327-347 (2018).
- Nave, K. A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).
- Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. Developmental Biology. 302 (2), 683-693 (2007).
- Kassis, H., et al. Histone deacetylase expression in white matter oligodendrocytes after stroke. Neurochemistry International. 77, 17-23 (2014).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: Procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nature Protocols. 1 (2), 848-858 (2006).
- Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination. Brain. 129, 1972-1983 (2006).
- Karussis, D. The diagnosis of multiple sclerosis and the various related demyelinating syndromes: A critical review. Journal of Autoimmunity. 48-49, 134-142 (2014).
- Kamma, E., Lasisi, W., Libner, C., Ng, H. S., Plemel, J. R. Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: Relationship to neurodegeneration and therapeutics. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 45 (2022).
- Kutzelnigg, A., et al. Cortical demyelination and diffuse white matter injury in multiple sclerosis. Brain. 128, 2705-2712 (2005).
- Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: Experimental models and reality). Acta Neuropathologica. 133 (2), 223-244 (2017).
- Lamport, A. C., Chedrawe, M., Nichols, M., Robertson, G. S. Experimental autoimmune encephalomyelitis accelerates remyelination after lysophosphatidylcholine-induced demyelination in the corpus callosum. Journal of Neuroimmunology. 334, 576995 (2019).
- Torkildsen, O., Brunborg, L. A., Myhr, K. M., Bo, L. The cuprizone model for demyelination. Acta Neurologica Scandinavica. Supplementum. 188, 72-76 (2008).
- Zhan, J., et al. The cuprizone model: Dos and do nots. Cells. 9 (4), 843 (2020).
- Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia (Barcelona, Spain). 35 (1), 32-39 (2020).
- Merkler, D., et al. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-induced experimental autoimmune encephalomyelitis in the common marmoset reflects the immunopathology of pattern II multiple sclerosis lesions. Multiple Sclerosis Journal. 12 (4), 369-374 (2006).
- Ucal, M., et al. Widespread cortical demyelination of both hemispheres can be induced by injection of pro-inflammatory cytokines via an implanted catheter in the cortex of MOG-immunized rats. Experimental Neurology. 294, 32-44 (2017).
