चूहों में लाइसोफॉस्फेटिडिलकोलाइन-प्रेरित फोकल डिमाइलिनेशन मॉडल का एक स्थिर रूप से स्थापित दो-बिंदु इंजेक्शन
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल चूहों में एक स्थिर और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डिमाइलिनेशन मॉडल उत्पन्न करने के लिए एक स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम के माध्यम से लाइसोफॉस्फेटिडिलकोलाइन के दो-बिंदु इंजेक्शन का वर्णन करता है।
Abstract
रिसेप्टर-मध्यस्थता लाइसोफॉस्फोलिपिड सिग्नलिंग विभिन्न न्यूरोलॉजिकल बीमारियों, विशेष रूप से मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) के पैथोफिजियोलॉजी में योगदान देता है। लाइसोफॉस्फेटिडिलकोलाइन (एलपीसी) सूजन से जुड़ा एक अंतर्जात लाइसोफॉस्फोलिपिड है, और यह माइलिन लिपिड को विषाक्तता के साथ तेजी से नुकसान पहुंचा सकता है, जिससे फोकल डिमाइलिनेशन हो सकता है। यहां, स्टीरियोटैक्टिक दो-बिंदु एलपीसी इंजेक्शन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है जो सीधे गंभीर डिमाइलिनेशन का कारण बन सकता है और सर्जिकल प्रक्रिया द्वारा चूहों में प्रयोगात्मक डिमाइलिनेशन चोट को जल्दी और स्थिर रूप से दोहरा सकता है। इस प्रकार, यह मॉडल डिमाइलिनेशन रोगों, विशेष रूप से एमएस के लिए अत्यधिक प्रासंगिक है, और यह संबंधित अग्रिम नैदानिक रूप से प्रासंगिक अनुसंधान में योगदान दे सकता है। इसके अलावा, एलपीसी के साथ इंजेक्शन चूहों के कॉर्पस कॉलोसम में डिमाइलिनेशन के समय पाठ्यक्रम को चित्रित करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस और लक्सोल फास्ट ब्लू धुंधला तरीकों का उपयोग किया गया था। इसके अलावा, मॉडलिंग के बाद चूहों के संज्ञानात्मक कार्य का मूल्यांकन करने के लिए व्यवहार विधि का उपयोग किया गया था। कुल मिलाकर, स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम के माध्यम से लाइसोफॉस्फेटिडिलकोलाइन का दो-बिंदु इंजेक्शन आगे के अध्ययन के लिए चूहों में एक डिमाइलिनेशन मॉडल उत्पन्न करने के लिए एक स्थिर और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीका है।
Introduction
रिसेप्टर-मध्यस्थता वाले लाइसोफॉस्फोलिपिड सिग्नलिंग में लगभग सभी अंग प्रणालियों की विविध शारीरिक प्रक्रियाएं शामिलहैं 1. केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में, यह सिग्नलिंग मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) जैसे ऑटोइम्यून न्यूरोलॉजिकल रोगों के रोगजनकों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। मल्टीपल स्केलेरोसिस एक पुरानी प्रतिरक्षा-मध्यस्थता विकार है जो पैथोलॉजिकल डिमाइलिनेशन और भड़काऊ प्रतिक्रिया की विशेषता है, जिससे न्यूरोलॉजिकल डिसफंक्शन और संज्ञानात्मक हानि 2,3 होती है। प्रारंभिक बीमारी के दौरान निरंतर रिलैप्सिंग और प्रेषण के बाद, अधिकांश रोगी अंततः माध्यमिक-प्रगतिशील चरण में प्रगति करते हैं, जो मस्तिष्क को अपरिवर्तनीय क्षति पहुंचा सकता है और परिणामस्वरूप विकलांगता4. यह माना जाता है कि माध्यमिक-प्रगतिशील पाठ्यक्रम की पैथोलॉजिकल हॉलमार्क भड़काऊ घावों के कारण सजीले टुकड़े को कम करना है5. एमएस के लिए मौजूदा उपचार रिलैप्स के जोखिम को काफी कम कर सकते हैं। हालांकि, प्रगतिशील एमएस6 के कारण दीर्घकालिक डिमाइलिनेटिंग क्षति के लिए अभी भी कोई प्रभावी चिकित्सा नहीं है। इस प्रकार, सफेद पदार्थ अध: पतन पर ध्यान केंद्रित करने वाले प्रीक्लिनिकल चिकित्सीय का अध्ययन करने के लिए एक स्थिर रूप से स्थापित और आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मॉडल की आवश्यकता होती है।
मल्टीपल स्केलेरोसिस विकसित करने में डिमाइलिनेशन और रिमाइलिनेशन दो प्रमुख रोग प्रक्रियाएं हैं। डिमाइलिनेशन प्रो-भड़काऊ फेनोटाइप7 के साथ माइक्रोग्लिया द्वारा प्रेरित अक्षतंतु के चारों ओर माइलिन म्यान का नुकसान है, और यह तंत्रिका आवेगों के धीमे चालन की ओर जाता है और इसके परिणामस्वरूप न्यूरॉन्स और न्यूरोलॉजिकल विकारों का नुकसान होता है। रिमाइलिनेशन ओलिगोडेंड्रोसाइट्स द्वारा मध्यस्थता की गई एक अंतर्जात मरम्मत प्रतिक्रिया है, जहां विकार न्यूरोडीजेनेरेशन और संज्ञानात्मक हानि का कारण बन सकते हैं8. भड़काऊ प्रतिक्रिया पूरी प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है, माइलिन क्षति और मरम्मत दोनों की डिग्री को प्रभावित करती है।
इसलिए, एमएस के लिए चिकित्सीय रणनीतियों के आगे अन्वेषण के लिए लगातार भड़काऊ डिमाइलिनेशन का एक स्थिर पशु मॉडल सार्थक है एमएस की जटिलता के कारण, प्रायोगिक ऑटोइम्यून एन्सेफलोमाइलाइटिस (ईएई), विषाक्त-डिमाइलिनेटिंग मॉडल, क्यूप्रीज़ोन (सीपीजेड), और लाइसोफॉस्फेटिडिलकोलाइन (एलपीसी) सहित विवो में डिमाइलिनेटिंग घावों की नकल करने के लिए विभिन्न प्रकार के पशु मॉडल स्थापित किए गए हैं। . एलपीसी सूजन से जुड़ा एक अंतर्जात लाइसोफॉस्फोलिपिड है, और यह माइलिन लिपिड को विषाक्तता के साथ तेजी से नुकसान पहुंचा सकता है, जिससे फोकल डिमाइलिनेशन हो सकता है। पिछली रिपोर्टों और अनुसंधान10,11 के आधार पर, कुछ संशोधनों के साथ दो-बिंदु इंजेक्शन का एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। आम तौर पर, क्लासिक एक-बिंदु एलपीसी इंजेक्शन मॉडल केवल इंजेक्शन साइट पर स्थानीय डिमाइलिनेशन का उत्पादन करता है और अक्सर सहज पुनर्मिलन12,13 के साथ होता है। हालांकि, दो-बिंदु इंजेक्शन एलपीसी मॉडल यह प्रदर्शित कर सकता है कि एलपीसी सीधे माउस कॉर्पस कॉलोसम में डिमाइलिनेशन को प्रेरित कर सकता है और थोड़ा माइलिन पुनर्जनन के साथ अधिक टिकाऊ डिमाइलिनेशन का कारण बन सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एमएस, सीएनएस की एक पुरानी डिमाइलिनेटिंग बीमारी, युवा वयस्कों में न्यूरोलॉजिकल शिथिलता के सबसे आम कारणों में से एक है20. नैदानिक रूप से, लगभग 60% -80% एमएस रोगी माध्यमिक-प्रगतिशील एमएस21,22</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान: 82071380, 81873743) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk | Sigma-Aldrich | L4129-25MG | |
| 32 gauge Needle | HAMILTON | 7762-05 | |
| 10 μl syringe | HAMILTON | 80014 | |
| high speed skull drill | strong,korea | strong204 | |
| drill | Hager & Meisinger, Germany | REF 500 104 001 001 005 | |
| Matrx Animal Aneathesia Ventilator | MIDMARK | VMR | |
| Portable Stereotaxic Instrument for Mouse | Reward | 68507 | |
| Micro syringe | Reward | KDS LEGATO 130 | |
| Isoflurane | VETEASY | ||
| Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | |
| Phosphate buffer | BOSTER | PYG0021 | |
| LuxoL fast bLue | Servicebio | G1030-100ML | |
| Suture | FUSUNPHARMA | 20152021225 | |
| Brain mold | Reward | 68707 | |
| Electron microscope fixative | Servicebio | G1102-100ML | |
| Neutral red (C.I. 50040), for microscopy Certistain | Sigma-Aldrich | 1.01376 | |
| Anti-Myelin Basic Protein Antibody | Millipore | #AB5864 | |
| Anti-GST-P pAb | MBL | #311 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15) | Thermo Fisher Scientific | 14-5698-95 | |
| Beta Actin Monoclonal Antibody | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| Myelin Basic Protein Polyclonal Antibody | Proteintech | 10458-1-AP | |
| OLIG2 Polyclonal Antibody | Proteintech | 13999-1-AP | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34206ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | YEASEN | 34412ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34212ES60 | |
| HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | abclonal | AS014 | |
| HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | abclonal | AS003 | |
| Adult C57BL/6 male and female mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd |
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