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Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt Methoden zur Durchführung eines groß angelegten Gravitaxis-Assays mit Caenorhabditis dauerlarven. Dieses Protokoll ermöglicht eine bessere Detektion des Gravitaxisverhaltens im Vergleich zu einem plattenbasierten Assay.

Abstract

Die Schwerkraftempfindung ist ein wichtiger und relativ wenig untersuchter Prozess. Die Erfassung der Schwerkraft ermöglicht es den Tieren, in ihrer Umgebung zu navigieren und erleichtert die Bewegung. Darüber hinaus ist die Schwerkraftempfindung, die im Innenohr von Säugetieren auftritt, eng mit dem Hören verbunden – daher hat das Verständnis dieses Prozesses Auswirkungen auf die auditive und vestibuläre Forschung. Gravitaxis Assays existieren für einige Modellorganismen, einschließlich Drosophila. Einzelne Würmer wurden zuvor auf ihre Orientierungspräferenz untersucht, wenn sie sich in Lösung niederlassen. Ein zuverlässiger und robuster Assay für Caenorhabditis gravitaxis wurde jedoch nicht beschrieben. Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Durchführung von Gravitaxis-Assays, mit dem Hunderte von Caenorhabditis-Stadien gleichzeitig getestet werden können. Dieser groß angelegte Langstrecken-Assay ermöglicht eine detaillierte Datenerfassung und zeigt Phänotypen auf, die bei einem Standard-Plattentest möglicherweise übersehen werden. Die Dauerbewegung entlang der vertikalen Achse wird mit horizontalen Steuerungen verglichen, um sicherzustellen, dass die Richtungsvorspannung auf die Schwerkraft zurückzuführen ist. Die gravitaktische Präferenz kann dann zwischen Stämmen oder experimentellen Bedingungen verglichen werden. Diese Methode kann molekulare, zelluläre und Umweltanforderungen für die Gravitaxie in Würmern bestimmen.

Introduction

Die Anziehungskraft der Erde zu spüren, ist entscheidend für die Orientierung, Bewegung, Koordination und das Gleichgewicht vieler Organismen. Die molekularen Mechanismen und Neuroschaltkreise der Schwerkraftempfindung sind jedoch im Vergleich zu anderen Sinnen kaum verstanden. Bei Tieren interagiert die Schwerkraftempfindung mit anderen Reizen und kann von ihnen übertroffen werden, um das Verhalten zu beeinflussen. Visuelle Hinweise, propriozeptives Feedback und vestibuläre Informationen können integriert werden, um ein Gefühl des Körperbewusstseins in Bezug auf die Umgebung eines Tieres zu erzeugen ^1,2. Umgekehrt kann die gravitaktische Präferenz in Gegenwart anderer Reize verändert werden ^3,4,5. Daher ist gravitaktisches Verhalten ideal, um die Schwerkraftempfindung zu untersuchen und die komplexe sensorische Integration und Entscheidungsfindung des Nervensystems zu verstehen.

C. elegans ist aufgrund seines polyphenischen Lebenszyklus ein besonders nützlicher Modellorganismus für die Untersuchung der Gravitaxie. Wenn sie während der Entwicklung Stressoren wie Hitze, Überfüllung oder Nahrungsmangel ausgesetzt sind, entwickeln sich C. elegans-Larven zu Dauern, die sehr stressresistent sind⁶. Als Dauern zeigen Würmer charakteristische Verhaltensweisen wie die Nickung, bei denen Würmer auf ihren Schwänzen “stehen” und mit dem Kopf wedeln, was die Ausbreitung in bessere Lebensräume erleichtern kann⁷. Gravitaxis-Assays von C. elegans und C. japonica deuten darauf hin, dass Dauerlarven negativ gravitax sind, und dass dieses Verhalten bei Dauertieren leichter beobachtet wird als bei Erwachsenen ^8,9. Das Testen der Gravitaxie in anderen Caenorhabditis-Stämmen kann natürliche Variationen im gravitaktischen Verhalten aufdecken.

Mechanismen für die Schwerkraftempfindung wurden in Euglena, Drosophila, Ciona und verschiedenen anderen Spezies unter Verwendung der Gravitaxis-Assays 3,10,11 charakterisiert. In der Zwischenzeit lieferten Gravitaxisstudien bei Caenorhabditis zunächst gemischte Ergebnisse. Eine Studie der Orientierungspräferenz von C. elegans ergab, dass sich Würmer mit gesenktem Kopf in Lösung orientieren, was auf eine positive gravitaktische Präferenz hindeutet¹². Obwohl C. japonica dauers früh als negativ gravitaktisch identifiziert^{wurden 8}, wurde dieses Verhalten erst kürzlich in C. elegans⁹ beschrieben. Bei der Entwicklung eines repräsentativen Gravitaxis-Assays bei Würmern ergeben sich mehrere Herausforderungen. Caenorhabditis-Stämme werden auf Agarplatten gehalten; Aus diesem Grund verwenden Verhaltensassays typischerweise Agarplatten als Teil ihres experimentellen Designs^13,14,15. Der früheste berichtete Gravitaxis-Assay bei Caenorhabditis wurde durchgeführt, indem eine Platte in einem 90°-Winkel zur horizontalen Kontrollplatte⁸ auf die Seite gestellt wurde. Das Gravitaxisverhalten ist unter diesen Bedingungen jedoch nicht immer robust. Während erwachsene Würmer in Lösung¹² auf Orientierungspräferenz untersucht werden können, kann diese Richtungspräferenz auch kontextabhängig sein, was zu unterschiedlichen Verhaltensweisen führt, wenn die Würmer eher krabbeln als schwimmen. Darüber hinaus reagiert C. elegans empfindlich auf andere Reize, einschließlich Licht und elektromagnetische Felder^16,17, die ihre Reaktionen auf die Schwerkraft^{stören 9}. Daher ist ein aktualisierter Gravitaxis-Assay, der gegen andere Umweltvariablen abschirmt, wichtig, um die Mechanismen dieses sensorischen Prozesses zu analysieren.

Im vorliegenden Protokoll wird ein Assay zur Beobachtung von Caenorhabditis gravitaxis beschrieben. Der Aufbau für diese Studie basiert zum Teil auf einer Methode, die zur Untersuchung der neuromuskulären Integrität entwickelt wurde^18,19. Dauerlarven werden mit Standardverfahren^{kultiviert und isoliert 20}. Sie werden dann in Kammern aus zwei mit Agar gefüllten 5-ml-serologischen Pipetten injiziert. Diese Kammern können vertikal oder horizontal ausgerichtet und für 12-24 h in einem dunklen Faradayschen Käfig platziert werden, um sich vor Licht und elektromagnetischen Feldern abzuschirmen. Die Position jedes Wurms in den Kammern wird aufgezeichnet und mit den vertikalen Taxis eines Referenzstamms wie C. elegans N2 verglichen.

Protocol

Die in der vorliegenden Studie verwendeten Stämme sind C. elegans (N2) und C. briggsae (AF16) (siehe Materialtabelle). Für jeden Assay wurde eine gemischtgeschlechtliche Population von Dauers verwendet. 1. Vorbereitung der Kammer Arbeiten Sie in einem Abzug. Richten Sie den Arbeitsbereich mit einem Bunsenbrenner, 1-2 Rasierklingen, einer Zange, einer Pinzette und einer Kunststoffschneidefläche ein (siehe Materialtabelle). Sammeln Sie für jede Kammer zwei 5-ml-serologische Pipetten. Entfernen Sie den Baumwollpfropfen von einer Pipette mit einer Pinzette. Halten Sie eine Rasierklinge mit einer Zange über den Bunsenbrenner, bis sie heiß ist. Verwenden Sie die beheizte Klinge, um das konische Ende der zweiten Pipette abzuschneiden, so dass die gesamte Pipette einen einheitlichen Durchmesser hat (Abbildung 1A). Schnell arbeiten, die beiden modifizierten Pipettenenden in die Nähe der Flamme bringen und leicht schmelzen. Verbinden Sie diese Enden, indem Sie sie fest zusammendrücken, um sicherzustellen, dass die Wände beider Pipetten durchgehend sind. Wenn nach dem Fügen Lücken sichtbar sind, brechen Sie diese auseinander und wiederholen Sie diesen Schritt (Abbildung 1A,B). 2. Füllen der Kammern mit Agar Bereiten Sie NGM mit 4% Agar nach Standard-Wurmverfahren21 vor. Während der Agar noch geschmolzen ist, füllen Sie jede Kammer, indem Sie sie an einen serologischen Pipettierer legen und langsam die Lösung aufziehen. Verschließen Sie die Spitze mit Paraffinfolie, bevor Sie die Kammer vom Pipettor entfernen. Legen Sie die Kammer flach (parallel zur Tischplatte) zum Abkühlen.HINWEIS: Das Abdecken des Kolbens mit Frischhaltefolie (siehe Materialtabelle) nach dem Autoklavieren verhindert, dass sich Blasen in der Lösungbilden 18.Um Abweichungen in der Konsistenz des Agars aufgrund ungleichmäßiger Abkühlung zu minimieren, halten Sie den Pipettierer (siehe Materialtabelle) parallel zur Tischplatte, während Sie den Agar aufziehen. Legen Sie die Kammern flach auf die Tischplatte und lassen Sie den Agar aushärten, bevor Sie sich bewegen.HINWEIS: Der Agaranteil und der Medieninhalt können auf das Experiment zugeschnitten werden. 4% Agar ist steifer als die etwa 2% Konzentration, die für das Tellergießen verwendet wird, und verhindert, dass sich Würmer durch das Medium in unseren Händen wühlen. Andere Experimentatoren haben jedoch ein Grabverhalten von erwachsenen Würmern in bis zu 9% Agar18,19 beobachtet. Nach dem Abkühlen einen 3-mm-Sechskantschlüssel (oder ein anderes Metallwerkzeug gleicher Größe, siehe Materialtabelle) über einem Bunsenbrenner erhitzen. Drücken Sie es fest in die Wand jeder Kammer etwa 5 mm zu einer Seite der Mittellinie, wodurch eine kleine Öffnung im Kunststoff entsteht (Abbildung 1C). Verwenden Sie eine beheizte Klinge, um die Baumwolle und die konischen Enden der Kammer zu entfernen und diese Enden mit Paraffinfolie zu versiegeln.HINWEIS: Nach der Zubereitung muss jede Kammer innerhalb von 1 Tag verwendet oder mehrere Tage bei 4 °C aufbewahrt werden. Belichtete Öffnungen mit Paraffinfolie abdecken, um ein Austrocknen des Agars zu verhindern. 3. Isolierung von Dauerlarven 10-15 Tage vor dem Experiment jeden Stamm auf 2-3 große NGM-Platten mit OP50-Bakterien aufteilen und mit Paraffinfolie umwickeln. Nach 10-15 Tagen muss jeder Teller mit Tausenden von Dauerlarven auf Agar, Wänden und Deckeln vollständig ausgehungert sein.HINWEIS: Stellen Sie Teller im Voraus mit einem dicken OP50-Rezept für maximale Überfüllung her (siehe Materialtabelle). Die Dauerbildung kann auch durch andere Methoden induziert werden, einschließlich der Zugabe von Pheromonen oder durch Wachstum bei höheren Temperaturen22. Sammeln Sie Würmer, indem Sie die Deckel und Platten mit M9-Puffer spülen und die Lösung in 15-ml-Zentrifugenröhrchen pipettieren. Drehen Sie bei 1.600 x g für 30-60 s bei Raumtemperatur und saugen Sie den größten Teil des M9-Puffers mit einer Pipette oder einem Vakuumsauger ab. Isolieren Sie Dauers durch Behandlung mit 1% SDS, gefolgt von einem Flotationsgradienten von 30% Saccharose gemäß dem zuvor veröffentlichten Bericht20.Fügen Sie 7 ml 1% ige SDS-Lösung zu jedem Schneckenpellet hinzu. Lassen Sie die Würmer für 30 Minuten in SDS; Drehen Sie die Rohre während dieser Zeit kontinuierlich, um eine Belüftung zu ermöglichen. Spülen Sie 3-5x mit M9 ab, um das Reinigungsmittel zu entfernen. Als nächstes fügen Sie 5 ml M9 hinzu, gefolgt von 5 ml kalter, gefilterter 60% iger Saccharoselösung. Gründlich mischen und dann bei 1.600 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren, um einen Trenngradienten zu erzeugen. Füllen Sie neue 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 2 mL M9-Puffer. Zerkleinern Sie die Enden von Glaspasteur-Pipetten, um die Bohrung zu erweitern, und verwenden Sie diese Pipetten, um die oberste Schicht der Lösung (die isolierte Daumen enthält) vom Saccharosegradienten in die neuen Röhrchen zu übertragen. Spülen Sie die Dauern 3-5x mit M9 ab.HINWEIS: Es wird zu diesem Zeitpunkt Tausende von isolierten Dauern in Lösung geben. Sie können sofort verwendet oder durch Drehen in 5-7 ml M9 über Nacht belüftet werden. 4. Hinzufügen von Dauern zur Kammer Die Zentrifuge wird bei 1.600 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert und den größten Teil der M9-Lösung mit einer Pipette oder einem Vakuumsauger abgesaugt. Um die Wurmdichte zu schätzen, zählen Sie manuell die Anzahl der Würmer in drei separaten 1-μL-Tröpfchen unter einem Seziermikroskop. Verwenden Sie den Durchschnitt dieser Zählungen, um die Anzahl der Würmer pro μL zu schätzen.HINWEIS: Einige Pipettiergeräte mit kleinem Volumen können möglicherweise nicht den Boden eines 15-ml-Zentrifugenröhrchens erreichen. In diesem Fall kann ein konzentriertes Tröpfchen von Würmern zuerst auf ein Stück Paraffinfolie übertragen werden. Schneiden Sie das Ende einer 10-, 20- oder 200-μL-Pipettenspitze ab, um die Bohrung zu erweitern. Stellen Sie die Mikropipette auf ein etwas größeres Volumen als das vorgesehene Aspirationsvolumen ein. Saugen Sie ca. 1-2 μL der konzentrierten Schneckenlösung (idealerweise zwischen 100-300 Würmer) ab und lassen Sie eine kleine Menge Luft in die Spitze eindringen.HINWEIS: Eine große Anzahl von Würmern (1.000+) in einer Kammer kann die Reichweite der zurückgelegten Entfernungen aufgrund von Überfüllung erhöhen9. Drücken Sie die Pipettenspitze vorsichtig in den Agar, während Sie die Mikropipette drücken. Dadurch entsteht eine Injektionsstelle im Agar, ohne die Spitze zu verstopfen. Lassen Sie die Würmer in den Agar frei. Verwenden Sie Paraffinfolie, um die Öffnung zu versiegeln. 5. Durchführung und Bewertung des Assays HINWEIS: Gravitaxis kann unter verschiedenen Bedingungen getestet werden, die das Verhalten beeinflussen können9. Um so viele Variablen wie möglich zu eliminieren, platzieren Sie die Kammern in einem dunklen Faradayschen Käfig (siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur. Beschriften Sie jede Kammer und hängen Sie sie senkrecht in den Faradayschen Käfig (führen Sie dies mit Beschriftungsband durch). Testen Sie horizontale Steuerungen gleichzeitig, indem Sie einige Kammern flach unter den gleichen Umgebungsbedingungen verlegen. Testen Sie die experimentellen Stämme gegen vertikal orientierte N2-Würmer als Positivkontrolle. Verwenden Sie horizontal ausgerichtete Kammern mit N2-Dauern als zusätzliche Negativkontrolle.HINWEIS: Horizontale und vertikale Assays müssen in derselben Umgebung innerhalb des Labors durchgeführt werden, um die Umgebungsvariabilität zwischen den beiden Bedingungen zu minimieren. Ein großer Inkubator kann verwendet werden, um beide Faradayschen Käfige unterzubringen. Dauers beginnen sich nach einigen Stunden vom Startort aus zu zerstreuen und brauchen mehrere Stunden, um beide Enden der Kammer zu erreichen. Lassen Sie die Kammern während dieser Zeit ungestört und erzielen Sie innerhalb von 12-24 Stunden nach der Injektion.HINWEIS: Verwenden Sie kein Paralytikum (wie Natriumazid), um Würmer zu immobilisieren, die die Enden der Kammern erreicht haben. Da die Gesamtverteilung der Würmer anstelle eines Präferenzindex (wie in einem Zwei-Auswahl-Assay) gemessen wird, ist Natriumazid unnötig und kann die Ergebnisse verändern. Entfernen und ritzen Sie die Gravitaxiskammern nacheinander. Suchen Sie unter einem Seziermikroskop nach lebenden Dauern und markieren Sie ihre Positionen mit Tinte (Abbildung 1C,D). Schneiden Sie keine Würmer innerhalb von 2,5 cm zu beiden Seiten der Injektionsstelle, da diese Würmer wahrscheinlich keine Richtungspräferenz zeigen.Vermeiden Sie auch das Sammeln von Würmern, die tot erscheinen oder in der Flüssigkeit gefangen sind. Entsorgen Sie alle Kammern, die >50% tote oder schwimmende Würmer enthalten.HINWEIS: Sobald die Kammer aus dem Testbereich entfernt wurde, muss sie umgehend auf Genauigkeit überprüft werden. Dauers dürfen nur zwischen der Oberfläche des Agars und der Wand der Pipette sichtbar sein. Wenn ein Grabverhalten beobachtet wird, sollten Sie in zukünftigen Assays eine Erhöhung der Agarkonzentration in Betracht ziehen. Um die Ergebnisse zu quantifizieren, teilen Sie jede Hälfte der Kammer mit einem Marker in sieben 3,5 cm Abschnitte auf, beginnend 2,5 cm von der Injektionsstelle entfernt (bei einigen Pipetten 3,5 cm = 1 ml Volumen). Verwenden Sie einen manuellen Zähler (siehe Materialtabelle), um die Anzahl der in jedem Abschnitt beobachteten Würmer zu zählen.HINWEIS: Auf jeder Seite des Ursprungs sollten sieben Abschnitte vorhanden sein, die von -7 (unten) bis +7 (oben) nummeriert werden können. Diese Zahlen müssen den gleichen relativen Orten entsprechen, je nachdem, wie die Kammern gebaut wurden; Agar wird in Schritt 2 vom Ende -7 zum Ende +7 gezeichnet.

Representative Results

Vergleich der Gravitaxie zwischen ArtenNach dem oben beschriebenen Verfahren kann C. briggsae dauer gravitaxis mit C. elegans gravitaxis und horizontalen Kontrollen verglichen werden. Die vertikale Verteilung (kastanienbraun) von C. briggsae dauers ist zu den Oberseiten der Kammern hin verzerrt, wobei ein großer Prozentsatz von Würmern +7 erreicht (Abbildung 2A). Im Gegensatz zu horizontalen Kontrollen (Aqua), bei denen die Dauern in einer an…

Discussion

Vergleich mit bisherigen Methoden
Im Gegensatz zur Chemotaxis kann die Gravitaxie bei Caenorhabditis nicht zuverlässig mit einem traditionellen Agarplatten-Versuchsdesign beobachtet werden. Eine Standard-Petrischale hat einen Durchmesser von 150 mm, so dass nur 75 mm in beide Richtungen für Dauers zur Verfügung stehen, um die Gravitaxispräferenz zu demonstrieren. Obwohl die Orientierungspräferenz von C. elegans in Lösung¹² untersucht werden kann, hat die…

Materials

1% Sodium Dodecyl Sulfate solution			From stock 10% (w/v) SDS in DI water
15 mL Centrifuge tubes	Falcon	14-959-53A
3 mm Hex key			Other similar sized metal tools may be used
4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) – 1 L			Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)
5 mL Serological pipettes	Fisherbrand	S68228C	Polystyrene, not borosilicate glass
60% Cold sucrose solution			60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C
AF16 C. briggsae or other experimental strain			Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
Bunsen burner
Cling-wrap	Fisherbrand	22-305654
Clinical centrifuge
Disposable razor blades	Fisherbrand	12-640
Faraday cage			Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger
Ink markers			Sharpie or other brand for marking on plastic
Labeling tape	Carolina	215620
M9 buffer			22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl
N2 C. elegans strain			Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
NGM plates with OP50			1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50
Paraffin film	Bemis	13-374-10
Plastic cutting board
Pliers
Rotating vertical mixer	BTLab SYSTEMS	BT913	With 22 x 15 mL tube bar
Serological pipettor	Corning	357469
Stereo Microscope	Laxco	S2103LS100
Tally counter	ULINE	H-7350
Thick NGM/agar plate media – 1 L			See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar
Tweezers