Großangelegter Gravitaxis-Assay von Caenorhabditis dauer-Larven
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt Methoden zur Durchführung eines groß angelegten Gravitaxis-Assays mit Caenorhabditis dauerlarven. Dieses Protokoll ermöglicht eine bessere Detektion des Gravitaxisverhaltens im Vergleich zu einem plattenbasierten Assay.
Abstract
Die Schwerkraftempfindung ist ein wichtiger und relativ wenig untersuchter Prozess. Die Erfassung der Schwerkraft ermöglicht es den Tieren, in ihrer Umgebung zu navigieren und erleichtert die Bewegung. Darüber hinaus ist die Schwerkraftempfindung, die im Innenohr von Säugetieren auftritt, eng mit dem Hören verbunden – daher hat das Verständnis dieses Prozesses Auswirkungen auf die auditive und vestibuläre Forschung. Gravitaxis Assays existieren für einige Modellorganismen, einschließlich Drosophila. Einzelne Würmer wurden zuvor auf ihre Orientierungspräferenz untersucht, wenn sie sich in Lösung niederlassen. Ein zuverlässiger und robuster Assay für Caenorhabditis gravitaxis wurde jedoch nicht beschrieben. Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Durchführung von Gravitaxis-Assays, mit dem Hunderte von Caenorhabditis-Stadien gleichzeitig getestet werden können. Dieser groß angelegte Langstrecken-Assay ermöglicht eine detaillierte Datenerfassung und zeigt Phänotypen auf, die bei einem Standard-Plattentest möglicherweise übersehen werden. Die Dauerbewegung entlang der vertikalen Achse wird mit horizontalen Steuerungen verglichen, um sicherzustellen, dass die Richtungsvorspannung auf die Schwerkraft zurückzuführen ist. Die gravitaktische Präferenz kann dann zwischen Stämmen oder experimentellen Bedingungen verglichen werden. Diese Methode kann molekulare, zelluläre und Umweltanforderungen für die Gravitaxie in Würmern bestimmen.
Introduction
Die Anziehungskraft der Erde zu spüren, ist entscheidend für die Orientierung, Bewegung, Koordination und das Gleichgewicht vieler Organismen. Die molekularen Mechanismen und Neuroschaltkreise der Schwerkraftempfindung sind jedoch im Vergleich zu anderen Sinnen kaum verstanden. Bei Tieren interagiert die Schwerkraftempfindung mit anderen Reizen und kann von ihnen übertroffen werden, um das Verhalten zu beeinflussen. Visuelle Hinweise, propriozeptives Feedback und vestibuläre Informationen können integriert werden, um ein Gefühl des Körperbewusstseins in Bezug auf die Umgebung eines Tieres zu erzeugen 1,2. Umgekehrt kann die gravitaktische Präferenz in Gegenwart anderer Reize verändert werden 3,4,5. Daher ist gravitaktisches Verhalten ideal, um die Schwerkraftempfindung zu untersuchen und die komplexe sensorische Integration und Entscheidungsfindung des Nervensystems zu verstehen.
C. elegans ist aufgrund seines polyphenischen Lebenszyklus ein besonders nützlicher Modellorganismus für die Untersuchung der Gravitaxie. Wenn sie während der Entwicklung Stressoren wie Hitze, Überfüllung oder Nahrungsmangel ausgesetzt sind, entwickeln sich C. elegans-Larven zu Dauern, die sehr stressresistent sind6. Als Dauern zeigen Würmer charakteristische Verhaltensweisen wie die Nickung, bei denen Würmer auf ihren Schwänzen “stehen” und mit dem Kopf wedeln, was die Ausbreitung in bessere Lebensräume erleichtern kann7. Gravitaxis-Assays von C. elegans und C. japonica deuten darauf hin, dass Dauerlarven negativ gravitax sind, und dass dieses Verhalten bei Dauertieren leichter beobachtet wird als bei Erwachsenen 8,9. Das Testen der Gravitaxie in anderen Caenorhabditis-Stämmen kann natürliche Variationen im gravitaktischen Verhalten aufdecken.
Mechanismen für die Schwerkraftempfindung wurden in Euglena, Drosophila, Ciona und verschiedenen anderen Spezies unter Verwendung der Gravitaxis-Assays 3,10,11 charakterisiert. In der Zwischenzeit lieferten Gravitaxisstudien bei Caenorhabditis zunächst gemischte Ergebnisse. Eine Studie der Orientierungspräferenz von C. elegans ergab, dass sich Würmer mit gesenktem Kopf in Lösung orientieren, was auf eine positive gravitaktische Präferenz hindeutet12. Obwohl C. japonica dauers früh als negativ gravitaktisch identifiziertwurden 8, wurde dieses Verhalten erst kürzlich in C. elegans9 beschrieben. Bei der Entwicklung eines repräsentativen Gravitaxis-Assays bei Würmern ergeben sich mehrere Herausforderungen. Caenorhabditis-Stämme werden auf Agarplatten gehalten; Aus diesem Grund verwenden Verhaltensassays typischerweise Agarplatten als Teil ihres experimentellen Designs13,14,15. Der früheste berichtete Gravitaxis-Assay bei Caenorhabditis wurde durchgeführt, indem eine Platte in einem 90°-Winkel zur horizontalen Kontrollplatte8 auf die Seite gestellt wurde. Das Gravitaxisverhalten ist unter diesen Bedingungen jedoch nicht immer robust. Während erwachsene Würmer in Lösung12 auf Orientierungspräferenz untersucht werden können, kann diese Richtungspräferenz auch kontextabhängig sein, was zu unterschiedlichen Verhaltensweisen führt, wenn die Würmer eher krabbeln als schwimmen. Darüber hinaus reagiert C. elegans empfindlich auf andere Reize, einschließlich Licht und elektromagnetische Felder16,17, die ihre Reaktionen auf die Schwerkraftstören 9. Daher ist ein aktualisierter Gravitaxis-Assay, der gegen andere Umweltvariablen abschirmt, wichtig, um die Mechanismen dieses sensorischen Prozesses zu analysieren.
Im vorliegenden Protokoll wird ein Assay zur Beobachtung von Caenorhabditis gravitaxis beschrieben. Der Aufbau für diese Studie basiert zum Teil auf einer Methode, die zur Untersuchung der neuromuskulären Integrität entwickelt wurde18,19. Dauerlarven werden mit Standardverfahrenkultiviert und isoliert 20. Sie werden dann in Kammern aus zwei mit Agar gefüllten 5-ml-serologischen Pipetten injiziert. Diese Kammern können vertikal oder horizontal ausgerichtet und für 12-24 h in einem dunklen Faradayschen Käfig platziert werden, um sich vor Licht und elektromagnetischen Feldern abzuschirmen. Die Position jedes Wurms in den Kammern wird aufgezeichnet und mit den vertikalen Taxis eines Referenzstamms wie C. elegans N2 verglichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vergleich mit bisherigen Methoden
Im Gegensatz zur Chemotaxis kann die Gravitaxie bei Caenorhabditis nicht zuverlässig mit einem traditionellen Agarplatten-Versuchsdesign beobachtet werden. Eine Standard-Petrischale hat einen Durchmesser von 150 mm, so dass nur 75 mm in beide Richtungen für Dauers zur Verfügung stehen, um die Gravitaxispräferenz zu demonstrieren. Obwohl die Orientierungspräferenz von C. elegans in Lösung12 untersucht werden kann, hat die…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch Forschungsstipendien der National Institutes of Health an JHR unterstützt (#R01 5R01HD081266 und #R01GM141493). Einige Stämme wurden vom CGC bereitgestellt, das vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wird. Wir danken Pradeep Joshi (UCSB) für seinen redaktionellen Beitrag. Statistische Konsultation durch das UCSB DATALAB.
Materials
| 1% Sodium Dodecyl Sulfate solution | From stock 10% (w/v) SDS in DI water | ||
| 15 mL Centrifuge tubes | Falcon | 14-959-53A | |
| 3 mm Hex key | Other similar sized metal tools may be used | ||
| 4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) – 1 L | Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL) | ||
| 5 mL Serological pipettes | Fisherbrand | S68228C | Polystyrene, not borosilicate glass |
| 60% Cold sucrose solution | 60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C | ||
| AF16 C. briggsae or other experimental strain | Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center) | ||
| Bunsen burner | |||
| Cling-wrap | Fisherbrand | 22-305654 | |
| Clinical centrifuge | |||
| Disposable razor blades | Fisherbrand | 12-640 | |
| Faraday cage | Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger | ||
| Ink markers | Sharpie or other brand for marking on plastic | ||
| Labeling tape | Carolina | 215620 | |
| M9 buffer | 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl | ||
| N2 C. elegans strain | Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center) | ||
| NGM plates with OP50 | 1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50 | ||
| Paraffin film | Bemis | 13-374-10 | |
| Plastic cutting board | |||
| Pliers | |||
| Rotating vertical mixer | BTLab SYSTEMS | BT913 | With 22 x 15 mL tube bar |
| Serological pipettor | Corning | 357469 | |
| Stereo Microscope | Laxco | S2103LS100 | |
| Tally counter | ULINE | H-7350 | |
| Thick NGM/agar plate media – 1 L | See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar | ||
| Tweezers |
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