Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

فحص Gravitaxis على نطاق واسع من يرقات Caenorhabditis Dauer

Published: May 31, 2022 doi: 10.3791/64062
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Molecular Cellular and Developmental Biology, University of California

Summary

يحدد هذا البروتوكول طرق إجراء فحص محور الجاذبية على نطاق واسع باستخدام يرقات Caenorhabditis dauer. يسمح هذا البروتوكول بالكشف بشكل أفضل عن سلوك محور الجاذبية مقارنة بالفحص القائم على اللوحة.

Abstract

الإحساس بالجاذبية هو عملية مهمة وغير مدروسة نسبيا. استشعار الجاذبية يمكن الحيوانات من التنقل في محيطها ويسهل الحركة. بالإضافة إلى ذلك ، يرتبط الإحساس بالجاذبية ، الذي يحدث في الأذن الداخلية للثدييات ، ارتباطا وثيقا بالسمع - وبالتالي ، فإن فهم هذه العملية له آثار على الأبحاث السمعية والدهليزية. توجد اختبارات Gravitaxis لبعض الكائنات الحية النموذجية ، بما في ذلك ذبابة الفاكهة. تم فحص الديدان المفردة سابقا لتفضيل اتجاهها أثناء استقرارها في المحلول. ومع ذلك ، لم يتم وصف فحص موثوق وقوي لمحور الجاذبية Caenorhabditis . يحدد هذا البروتوكول إجراء لإجراء مقايسات محور الجاذبية التي يمكن استخدامها لاختبار المئات من كاورات Caenorhabditis في وقت واحد. يسمح هذا الفحص الواسع النطاق لمسافات طويلة بجمع بيانات مفصلة ، والكشف عن الأنماط الظاهرية التي قد يتم تفويتها في الفحص القياسي القائم على اللوحة. تتم مقارنة حركة داور على طول المحور الرأسي مع عناصر التحكم الأفقية لضمان أن التحيز الاتجاهي يرجع إلى الجاذبية. يمكن بعد ذلك مقارنة تفضيل الجاذبية بين السلالات أو الظروف التجريبية. يمكن لهذه الطريقة تحديد المتطلبات الجزيئية والخلوية والبيئية لمحور الجاذبية في الديدان.

Introduction

يعد استشعار جاذبية الأرض أمرا بالغ الأهمية لتوجيه العديد من الكائنات الحية وحركتها وتنسيقها وتوازنها. ومع ذلك ، فإن الآليات الجزيئية والدوائر العصبية للإحساس بالجاذبية غير مفهومة بشكل جيد مقارنة بالحواس الأخرى. في الحيوانات ، يتفاعل الإحساس بالجاذبية مع المحفزات الأخرى ويمكن التغلب عليها للتأثير على السلوك. يمكن دمج الإشارات البصرية وردود الفعل الحسية والمعلومات الدهليزية لتوليد شعور بالوعي بالجسم بالنسبة إلى محيط الحيوان 1,2. على العكس من ذلك ، يمكن تغيير تفضيل الجاذبية في وجود محفزات أخرى 3,4,5. لذلك ، يعد السلوك الثقالي مثاليا لدراسة الإحساس بالجاذبية وفهم التكامل الحسي المعقد للجهاز العصبي واتخاذ القرارات.

C. elegans هو كائن حي نموذجي مفيد بشكل خاص لدراسة محور الجاذبية بسبب دورة حياته متعددة الفينات. عند التعرض للضغوطات أثناء التطور ، بما في ذلك الحرارة أو الاكتظاظ أو نقص الطعام ، تتطور يرقات C. elegans إلى dauers ، وهي مقاومة للإجهاد للغاية6. تؤدي الديدان سلوكيات مميزة ، مثل النيكتيشن ، حيث "تقف" الديدان على ذيولها وتلوح برؤوسها ، والتي قد تسهل الانتشار إلى موائل أفضل7. تشير فحوصات Gravitaxis ل C. elegans و C. japonica إلى أن يرقات dauer تجاذب بشكل سلبي ، وأن هذا السلوك يتم ملاحظته بسهولة أكبر في dauers منه في البالغين 8,9. قد يكشف اختبار محور الجاذبية في سلالات التهاب Caenorhabditis الأخرى عن تباين طبيعي في السلوك الثقالي.

تم تمييز آليات الإحساس بالجاذبية في Euglena و Drosophila و Ciona وأنواع أخرى مختلفة باستخدام مقايسات الجاذبية3،10،11. وفي الوقت نفسه ، قدمت دراسات محور الجاذبية في Caenorhabditis في البداية نتائج مختلطة. وجدت دراسة للتفضيل التوجيهي C. elegans أن الديدان تتجه مع رؤوسها لأسفل في المحلول ، مما يشير إلى تفضيل إيجابي للجاذبية12. وفي الوقت نفسه ، على الرغم من أن C. japonica dauers تم تحديده في وقت مبكر على أنه سلبيالجاذبية 8 ، إلا أن هذا السلوك لم يتم وصفه إلا مؤخرا في C. elegans9. تنشأ العديد من التحديات في تطوير اختبار محور الجاذبية التمثيلي في الديدان. يتم الحفاظ على سلالات Caenorhabditis على لوحات أجار. لهذا السبب ، تستخدم الفحوصات السلوكية عادة لوحات أجار كجزء من تصميمها التجريبي13،14،15. تم إجراء أول فحص لمحور الجاذبية المبلغ عنه في Caenorhabditis عن طريق وضع لوحة على جانبها بزاوية 90 درجة إلى لوحة التحكم الأفقية8. ومع ذلك ، فإن سلوك محور الجاذبية ليس دائما قويا في ظل هذه الظروف. في حين يمكن فحص الديدان البالغة للتفضيل التوجيهي في الحل12 ، قد يكون هذا التفضيل الاتجاهي معتمدا أيضا على السياق ، مما يؤدي إلى سلوكيات مختلفة إذا كانت الديدان تزحف بدلا من السباحة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن C. elegans حساسة للمحفزات الأخرى ، بما في ذلك الضوء والمجالات الكهرومغناطيسية 16,17 ، والتي تتداخل مع استجاباتها للجاذبية9. لذلك ، فإن فحص محور الجاذبية المحدث الذي يحمي من المتغيرات البيئية الأخرى مهم لتشريح آليات هذه العملية الحسية.

في هذا البروتوكول ، يتم وصف فحص لمراقبة Caenorhabditis gravitaxis. يعتمد الإعداد لهذه الدراسة جزئيا على طريقة تم تطويرها لدراسة السلامة العصبية العضلية18,19. يتم استزراع يرقات داور وعزلها باستخدام الإجراءات القياسية20. ثم يتم حقنها في غرف مصنوعة من ماصتين مصليتين سعة 5 مل مملوءتين بالأجار. يمكن توجيه هذه الغرف عموديا أو أفقيا ووضعها داخل قفص فاراداي مظلم لمدة 12-24 ساعة للحماية من الضوء والمجالات الكهرومغناطيسية. يتم تسجيل موقع كل دودة في الغرف ومقارنتها بسيارات الأجرة الرأسية لسلالة مرجعية مثل C. elegans N2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

السلالات المستخدمة في هذه الدراسة هي C. elegans (N2) و C. briggsae (AF16) (انظر جدول المواد). تم استخدام مجموعة مختلطة من الجنسين من dauers لكل فحص.

1. إعداد الغرفة

  1. العمل في غطاء الدخان. قم بإعداد مساحة العمل باستخدام موقد بنسن و 1-2 شفرات حلاقة وكماشة وملاقط وسطح قطع بلاستيكي (انظر جدول المواد).
  2. لكل غرفة ، اجمع ماصتين مصليتين بسعة 5 مل. قم بإزالة قابس القطن من ماصة واحدة باستخدام ملاقط. امسك شفرة حلاقة فوق موقد بنسن حتى يسخن باستخدام كماشة. استخدم الشفرة المسخنة لتقطيع الطرف المدبب للماصة الثانية بحيث يكون للماصة بأكملها قطر موحد (الشكل 1A).
  3. العمل بسرعة ، وجلب اثنين من نهايات ماصة معدلة قريبة من اللهب ، وإذابتها قليلا. انضم إلى هذه النهايات عن طريق الضغط عليها بقوة معا ، مما يضمن استمرار جدران كلا الماصتين. إذا كانت هناك أي فجوات مرئية بعد الانضمام ، فقم بتقسيمها وكرر هذه الخطوة (الشكل 1A ، B).

2. ملء الغرف مع أجار

  1. تحضير NGM مع 4٪ أجار وفقا لإجراءات الدودة القياسية21. في حين أن الأجار لا يزال منصهرا ، املأ كل غرفة عن طريق توصيلها بماصة مصلية ووضع المحلول ببطء. ختم الطرف مع فيلم البارافين قبل إزالة الغرفة من ماصة. ضع الغرفة مسطحة (بالتوازي مع سطح الطاولة) لتبرد.
    ملاحظة: يساعد تغطية القارورة بلف التشبث (انظر جدول المواد) بعد التعقيم على منع تكوين الفقاعات في المحلول18.
    1. لتقليل أي اختلافات في اتساق الأجار بسبب التبريد غير المتساوي ، أمسك الماصة (انظر جدول المواد) بالتوازي مع سطح الطاولة أثناء إعداد الأجار. ضع الغرف بشكل مسطح على سطح الطاولة واسمح للأجار بالتصلب قبل التحرك.
      ملاحظة: يمكن تخصيص النسبة المئوية للأجار ومحتوى الوسائط وفقا للتجربة. 4٪ أجار أكثر صلابة من تركيز 2٪ تقريبا المستخدم في صب الألواح ويمنع الديدان من الاختباء عبر الوسط الموجود في أيدينا. ومع ذلك ، لاحظ مجربون آخرون سلوك الحفر من قبل الديدان البالغة في ما يصل إلى 9٪ من أجار18,19.
  2. بمجرد تبريده، قم بتسخين مفتاح سداسي عشري 3 مم (أو أداة معدنية أخرى من نفس الحجم، انظر جدول المواد) فوق موقد بنسن. اضغط عليه بقوة في جدار كل غرفة حوالي 5 مم إلى جانب واحد من خط الوسط ، مما يخلق فتحة صغيرة في البلاستيك (الشكل 1C). استخدم شفرة ساخنة لإزالة القطن والأطراف المدببة للغرفة وختم هذه النهايات بفيلم البارافين.
    ملاحظة: بمجرد إعدادها ، يجب استخدام كل غرفة في غضون 1 يوم أو الاحتفاظ بها عند 4 درجات مئوية لعدة أيام. قم بتغطية أي فتحات مكشوفة بفيلم بارافين لمنع الأجار من الجفاف.

3. عزل يرقات داور

  1. قبل 10-15 يوما من التجربة ، قم بتقطيع كل سلالة على 2-3 ألواح NGM كبيرة مع بكتيريا OP50 ولفها بفيلم البارافين. بعد 10-15 يوما ، يجب تجويع كل صفيحة بالكامل مع وجود الآلاف من يرقة داوير الموجودة على الأجار والجدران والأغطية.
    ملاحظة: اصنع الأطباق في وقت مبكر باستخدام وصفة OP50 سميكة لتحقيق أقصى قدر من الازدحام (انظر جدول المواد). يمكن أيضا تحفيز تكوين داور من خلال طرق أخرى ، بما في ذلك إضافة الفيرومونات أو عن طريق النمو في درجات حرارة أعلى22.
  2. جمع الديدان عن طريق شطف الأغطية والألواح باستخدام المخزن المؤقت M9 وسحب المحلول إلى أنابيب طرد مركزي 15 مل. تدور بسرعة 1600 × جم لمدة 30-60 ثانية في درجة حرارة الغرفة وتستنشق معظم المخزن المؤقت M9 باستخدام ماصة أو شفاط فراغ.
  3. عزل الداورات عن طريق المعالجة بنسبة 1٪ SDS متبوعة بتدرج تعويم السكروز بنسبة 30٪ بعد التقريرالمنشور سابقا 20.
    1. أضف محلول SDS سعة 7 مل 1٪ إلى كل حبيبة دودة. اترك الديدان في SDS لمدة 30 دقيقة ؛ قم بتدوير الأنابيب باستمرار خلال هذا الوقت للسماح بالتهوية. شطف 3-5x مع M9 لإزالة المنظفات.
    2. بعد ذلك ، أضف 5 مل M9 متبوعا ب 5 مل من محلول السكروز البارد المصفى بنسبة 60٪. اخلطي جيدا، ثم ارفعي جهاز الطرد المركزي بسرعة 1600 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لإنشاء تدرج فصل.
  4. املأ أنابيب الطرد المركزي الجديدة سعة 15 مل ب 2 مل من المخزن المؤقت M9. سحق نهايات ماصات باستور الزجاجية لتوسيع التجويف واستخدام هذه الماصات لنقل الطبقة العليا من المحلول (التي تحتوي على dauers معزولة) من تدرج السكروز إلى الأنابيب الجديدة. شطف dauers 3-5x مع M9.
    ملاحظة: سيكون هناك الآلاف من dauers المعزولة في الحل في هذه المرحلة. يمكن استخدامها على الفور أو الاحتفاظ بها تهوية عن طريق الدوران في 5-7 مل M9 بين عشية وضحاها.

4. إضافة dauers إلى الغرفة

  1. أجهزة الطرد المركزي عند 1600 × g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتستنشق معظم محلول M9 باستخدام ماصة أو شفاط فراغ. لتقدير كثافة الدودة ، قم بحساب عدد الديدان يدويا في ثلاث قطرات منفصلة سعة 1 ميكرولتر تحت مجهر تشريح. استخدم متوسط هذه الأعداد لتقريب عدد الديدان لكل ميكرولتر.
    ملاحظة: قد لا تتمكن بعض الماصات صغيرة الحجم من الوصول إلى قاع أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل؛ في هذه الحالة ، يمكن نقل قطرة مركزة من الديدان أولا إلى قطعة من فيلم البارافين.
  2. اقطع نهاية طرف ماصة 10 أو 20 أو 200 ميكرولتر لتوسيع التجويف. اضبط الماصة الدقيقة على حجم أكبر قليلا من حجم الطموح المقصود. استنشق ما يقرب من 1-2 ميكرولتر من محلول الدودة المركزة (من الناحية المثالية بين 100-300 ديدان) واسمح لكمية صغيرة من الهواء بدخول الطرف.
    ملاحظة: قد تزيد الأعداد الكبيرة من الديدان (1000+) في غرفة واحدة من نطاق المسافات المقطوعة بسبب الاكتظاظ9.
  3. ادفع طرف الماصة برفق إلى الآجار مع تثبيط الماصة الدقيقة. سيؤدي ذلك إلى إنشاء موقع حقن في الأجار دون انسداد الطرف. الافراج عن الديدان في أجار. استخدم فيلم البارافين لإغلاق الفتحة.

5. تشغيل وتسجيل الفحص

ملاحظة: يمكن اختبار Gravitaxis في ظل ظروف مختلفة قد تؤثر على السلوك9.

  1. للقضاء على أكبر عدد ممكن من المتغيرات ، ضع الغرف داخل قفص فاراداي مظلم (انظر جدول المواد) في درجة حرارة الغرفة.
  2. قم بتسمية كل غرفة وتعليقها عموديا داخل قفص فاراداي (قم بذلك باستخدام شريط وضع العلامات). اختبر الضوابط الأفقية في وقت واحد عن طريق وضع بعض الغرف مسطحة داخل نفس الظروف البيئية. اختبر السلالات التجريبية ضد ديدان N2 الموجهة رأسيا كعنصر تحكم إيجابي. استخدم الغرف الموجهة أفقيا التي تحتوي على Dauers N2 كعنصر تحكم سلبي إضافي.
    ملاحظة: يجب إجراء الفحوصات الأفقية والرأسية في نفس الإعداد داخل المختبر لتقليل التباين البيئي بين الشرطين. يمكن استخدام حاضنة كبيرة لإيواء كل من أقفاص فاراداي .
  3. تبدأ Dauers في التفرق من موقع البداية بعد بضع ساعات وتستغرق عدة ساعات للوصول إلى طرفي الغرفة. اترك الغرف دون إزعاج خلال هذا الوقت وسجل في غضون 12-24 ساعة بعد الحقن.
    ملاحظة: لا تستخدم مشلولا (مثل أزيد الصوديوم) لشل حركة الديدان التي وصلت إلى نهايات الغرف. نظرا لأن التوزيع الكلي للديدان يتم قياسه بدلا من مؤشر التفضيل (كما هو الحال في فحص الاختيار من اثنين) ، فإن أزيد الصوديوم غير ضروري وقد يغير النتائج.
  4. قم بإزالة وتسجيل غرف محور الجاذبية واحدة تلو الأخرى. ابحث عن الداورز الحية تحت مجهر تشريح وحدد مواقعها بالحبر (الشكل 1C ، D). لا تسجل الديدان في حدود 2.5 سم على جانبي موقع الحقن ، حيث من غير المحتمل أن تظهر هذه الديدان تفضيلا اتجاهيا.
    1. أيضا ، تجنب تسجيل الديدان التي تبدو ميتة أو محاصرة في السائل. تخلص من أي غرف تحتوي على >50٪ من الديدان الميتة أو السباحة.
      ملاحظة: بمجرد إزالة الغرفة من منطقة الاختبار ، يجب تسجيلها على الفور للتأكد من دقتها. يجب أن تكون الداورز مرئية فقط بين سطح الأجار وجدار الماصة. إذا لوحظ سلوك الحفر ، ففكر في زيادة تركيز الأجار في الفحوصات المستقبلية.
  5. لتحديد النتائج ، استخدم علامة لتقسيم كل نصف من الغرفة إلى سبعة أقسام 3.5 سم تبدأ من 2.5 سم بعيدا عن موقع الحقن (في بعض الماصات ، 3.5 سم = 1 مل حجم). استخدم عداد إحصاء يدوي (انظر جدول المواد) لإحصاء عدد الديدان التي لوحظت في كل قسم.
    ملاحظة: يجب أن يكون هناك سبعة أقسام على كل جانب من جوانب الأصل ، والتي يمكن ترقيمها من -7 (أسفل) إلى +7 (أعلى). ويجب أن تتوافق هذه الأرقام مع نفس المواقع النسبية استنادا إلى كيفية بناء الغرف؛ يتم رسم agar من نهاية -7 إلى نهاية +7 في الخطوة 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

مقارنة محور الجاذبية عبر الأنواع
باتباع الإجراء الموضح أعلاه ، يمكن مقارنة محور الجاذبية C. briggsae dauer مع محور الجاذبية C. elegans والضوابط الأفقية. يميل التوزيع الرأسي (المارون) ل C. briggsae dauers نحو قمم الغرف ، مع وصول نسبة كبيرة من الديدان إلى +7 (الشكل 2A). على النقيض من الضوابط الأفقية (أكوا) ، حيث يتم توزيع الداورز في منحنى على شكل جرس تقريبا حول مركز الغرف ، يشير هذا الاتجاه إلى سلوك الجاذبية السلبي. يمكن مقارنة هذه البيانات مع محور الجاذبية C. elegans الذي تم إجراؤه في نفس الأيام التجريبية (الشكل 2B).

حدد اختبار Kruskal-Wallis متبوعا باختبار Dunn مع تصحيح Bonferroni للمقارنات المتعددة أي اختلافات كبيرة بين المقايسات 9,23. في هذه التجربة ، تم تسجيل 1,108 C. briggsae dauers عبر ثلاث غرف عمودية من يومين تجريبيين مستقلين. هاجرت هذه الديدان بشكل كبير إلى أعلى من الضوابط الأفقية (p < 0.001 ؛ 1,639 dauers في ثلاث غرف أفقية على مدار يومين تجريبيين). علاوة على ذلك ، لم تختلف توزيعات C. briggsae الرأسية و C. elegans الرأسية (p > 0.05 ؛ 386 C. elegans dauers في غرفتين عموديتين على مدار يومين تجريبيين). تشير هذه النتائج إلى أن C. briggsae dauers تظهر سلوكا سلبيا لمحور الجاذبية مشابها لسلوك C. elegans dauers.

Figure 1
الشكل 1: إعداد غرفة فحص Gravitaxis. صور تصور خطوات إعداد غرفة فحص محور الجاذبية. (أ) تم إعداد ماصات فردية سعة 5 مل للاندماج في غرفة واحدة. إزالة قابس القطن المشار إليه برأس السهم الأسود ؛ إزالة الطرف المشار إليه برأس سهم أبيض. يبلغ قطر الأنابيب المستخدمة في هذه الدراسة 6 مم ويبلغ طول كل منها 34.5 سم (قبل القطع). (ب) غرفة مكتملة قبل إضافة NGM agar. تم دمج الماصات عن طريق الذوبان أولا فوق موقد بنسن. (ج) أمثلة على الغرف المليئة ب NGM agar. يشار إلى موقع الحقن بسهم ويتم توسيعه في الجزء الداخلي. تم وضع علامة على الديدان بالحبر ، ويتم رسم الخطوط لتمييز المسافات جنبا إلى جنب مع الغرفة وكذلك لتسهيل التسجيل. (د) عرض الغرف بكاملها (تؤخذ بعد التسجيل). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: Gravitaxis في C. briggsae مقابل C. elegans. نتائج محور الجاذبية في C. briggsae و C. elegans. (أ) الرسم البياني لمحور الجاذبية C. briggsae. تتم مقارنة الحركة في الغرف الرأسية (المارون) مع عناصر التحكم الأفقية (المائية). يتم رسم المسافة من نقطة الحقن (-7 كونها الأبعد أدناه ، +7 الأبعد أعلاه) كنسبة مئوية من إجمالي الديدان التي تم فحصها (المحور x). لا يتم رسم أي بيانات للأصل (+0) حيث لا يتم حساب الديدان في حدود 2.5 سم على جانبي موقع الحقن. N = 1,639 دودة عبر ثلاثة أنابيب في الحالة الأفقية. N عمودي = 1,108 ديدان عبر ثلاثة أنابيب. (ب) مخططات صندوقية تقارن توزيع الديدان الأفقية والرأسية C. briggsae مقابل الديدان الرأسية C. elegans. C. يتم إعطاء أحجام عينات briggsae أعلاه. C. elegans عمودي N = 386 دودة عبر أنبوبين. يشار إلى الوسائل بالماس الأبيض ؛ الظروف الرأسية في المارون وتسمى "V" ، والظروف الأفقية ("H") في أكوا. تم إجراء المقارنات باستخدام اختبار Kruskal-Wallis ، يليه اختبار Dunn مع تصحيح Bonferroni لإجراء مقارنات متعددة. لا توجد نجوم = p > 0.05 ، **** = p < 0.0001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

مقارنة مع الطرق السابقة
على عكس التاكسي الكيميائي ، لا يمكن ملاحظة محور الجاذبية في Caenorhabditis بشكل موثوق باستخدام تصميم تجريبي تقليدي للوحة أجار. يبلغ قطر طبق بتري القياسي 150 مم ، مما يؤدي إلى توفر 75 مم فقط في أي من الاتجاهين ل dauers لإظهار تفضيل محور الجاذبية. على الرغم من أنه يمكن فحص التفضيل التوجيهي ل C. elegans في الحل12 ، إلا أن هذه الطريقة منخفضة الإنتاجية حيث يجب تحليل الديدان واحدة تلو الأخرى. بالإضافة إلى ذلك ، قد تختلف تفضيلات وسلوكيات الجاذبية بين الديدان العائمة في الوسائط مقابل الزحف على السطح. لهذه الأسباب، قمنا بتطوير اختبار عالي الإنتاجية مع حساسية محسنة يمكن استخدامها لتحليل سلوك محور الجاذبية في الديدان الزاحفة أو المتسلقة. نظرا لأن C. elegans حساسة للضوء والمجالات الكهرومغناطيسية ، وكلاهما يتداخل مع تفضيل الجاذبية9 ، يجب إجراء هذه الفحوصات دون أي من المحفزات. إذا تم استخدام قفص فاراداي محلي الصنع ، فإن التحقق من قوة القفص وتعزيزه أمر ضروري وموصى به.

يبلغ طول غرف الفحص الموصوفة في هذا البروتوكول حوالي 54 سم ويتم وضعها داخل أقفاص فاراداي للحماية من المجالات الضوئية والكهرومغناطيسية. وقد وجد أن تغيير "الساحة" لمراقبة سلوك محور الجاذبية له العديد من المزايا. أولا ، يسمح بالقياس الكمي التفصيلي والتحليل الوصفي. يمكن جمع المسافات النسبية المقطوعة ، والتوزيعات الإجمالية للديدان ومقارنتها بدلا من حساب عدد الديدان السلبية مقابل الجاذبية الإيجابية. ثانيا، البيئة المغلقة لماصة مملوءة بالأجار تكرر بشكل أوثق الظروف التي قد تعزز محور الجاذبية في البرية. كما ذكر أعلاه ، فإن مرحلة dauer هي مرحلة تشتت تسمح بالهروب من الظروف غير المواتية6. نظرا لأن التهاب Caenorhabditis يعيش في السماد العضوي ، حيث قد لا تتوفر إشارات توجيهية مثل الضوء ، فقد تمكن الجاذبية الديدان من الانتقال إلى السطح 6,9. من غير المرجح أن تكرر الفحوصات ثنائية الأبعاد القائمة على الألواح هذه الحالات حتى لو تم اختبارها بدون محفزات أخرى. وأخيرا، يختبر هذا الجهاز الأكبر كميات أكبر من الديدان في فحص واحد.

القيود والاعتبارات الأخرى
في حين أن هذا البروتوكول يقيس بشكل فعال تفضيل الجاذبية في أعداد كبيرة من الدواوير ، إلا أنه غير عملي لتجارب الدودة الصغيرة أو المفردة بسبب الوقت والمواد اللازمة لبناء كل غرفة. من خلال الجمع بين الأعداد عبر التجارب بدلا من استخدام مؤشر محور الجاذبية، تزداد القوة الإحصائية لأن كل دودة تعامل كحدث مستقل. في حين أن هذه الحساسية المعززة مفيدة في التمييز بين الديدان الثقالية وغير الجذابة ، من المهم ملاحظة أن C. elegans dauers تظهر سلوكيات اجتماعية 7,24 يمكن أن تؤثر على محور الجاذبية الكلي. وجدنا أن كثافة الديدان الأعلى ترتبط بنطاق أكبر في المسافة المقطوعة عبر الفحص واسع النطاق ، على الرغم من أن هذا التأثير يكون ضئيلا عندما يكون العدد الإجمالي أقل من حوالي 1000 دودة9. يجب مراقبة تأثيرات التفاعل الناتجة عن عوامل مثل إجمالي الديدان في كل غرفة عند تحليل البيانات. كما هو الحال مع جميع الفحوصات السلوكية ، يجب أن يكون التسجيل أعمى عندما يكون ذلك ممكنا.

يمكن أن يؤدي العثور على متوسط كثافة الديدان في المحلول إلى تقليل التباين في عدد الديدان التي يتم حقنها من غرفة إلى أخرى. تستقر الديدان بسرعة في المحلول ، لذا فإن خلط الديدان قبل السحب ، إما عن طريق النقر فوق الأنابيب أو السحب لأعلى ولأسفل بطرف واسع التجويف أمر مهم. حتى عند تحقيق كثافة ثابتة ، قد يختلف عدد الديدان المضافة لأن الديدان من المحتمل أن تلتصق بالسطح الداخلي لأطراف الماصة البلاستيكية. يمكن أن تقلل أطراف ماصة الطلاء باستخدام BSA أو حلول أخرى من هذا التأثير. يجب حقن الديدان بأقل قدر ممكن من الحل ؛ إذا تمت إضافة الكثير من السائل إلى الغرفة ، فستصبح الديدان محاصرة في المحلول وقد تنجرف حتى. لهذا السبب ، يمكن تسجيل الديدان الحية الزاحفة فقط ، ويجب عدم استخدام أي غرفة تحتوي على أكثر من 50٪ من الديدان الميتة أو السباحة. يجب إزالة الغرف من قفص فاراداي واحدة تلو الأخرى وتسجيلها في غضون 10-15 دقيقة للحصول على أكبر قدر من الدقة.

التطبيقات المحتملة
يمكن استخدام هذا الفحص لاختبار المتطلبات البيئية والوراثية والخلوية لمحور الجاذبية في مجموعة متنوعة من سلالات Caenorhabditis. حتى الآن ، تم تحديد مجالات الضوء والكهرومغناطيسية كمحفزات تتداخل مع محور الجاذبية9. ومع ذلك ، فإن C. elegans حساسة للمحفزات الأخرى ، بما في ذلك درجة الحرارة والمواد الكيميائية المتطايرة وغير المتطايرة والملمس والرطوبة والصوت ، والتي تؤثر على سلوكها25،26،27،28. إن فهم كيفية دمج المدخلات الحسية المختلفة داخل الجهاز العصبي هو سؤال معلق في علم الأعصاب ، خاصة عندما يحدث التكامل على مستوى الخلايا العصبية الفردية9،29،30،31،32. التكامل الحسي مهم بشكل خاص في الحس العميق ، وهو في حد ذاته طريقة تكاملية تستمد من إشارات حسية متعددة1.

فهم الإحساس بالجاذبية في التهاب Caenorhabditis له آثار على صحة الإنسان. يعاني ملايين الأفراد من خلل وظيفي دهليزي في الولايات المتحدة وحدها33 ، والعديد من هذه الاضطرابات لها أسباب وراثية كامنة34,35. لهذا السبب ، فإن تحديد الجينات المرشحة والعلاجات المستهدفة هو مجال نشط للبحث36. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن الأنظمة الدهليزية والسمعية الفقارية ترتبط ارتباطا وثيقا من الناحية التنموية والتطورية 33،36،37 ، فإن توضيح الإحساس بالجاذبية يمكن أن يوفر أيضا نظرة ثاقبة على اضطرابات السمع والسمع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgments

تم دعم هذا البحث من خلال منح بحثية من المعاهد الوطنية للصحة إلى JHR (#R01 5R01HD081266 و #R01GM141493). تم توفير بعض السلالات من قبل CGC ، الذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة لبرامج البنية التحتية البحثية (P40 OD010440). نود أن نعرب عن تقديرنا لبراديب جوشي (UCSB) على مدخلاته التحريرية. استشارة إحصائية مقدمة من مختبر بيانات UCSB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Sodium Dodecyl Sulfate solution From stock 10% (w/v) SDS in DI water
15 mL Centrifuge tubes Falcon 14-959-53A
3 mm Hex key Other similar sized metal tools may be used
4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) - 1 L Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)
5 mL Serological pipettes Fisherbrand S68228C Polystyrene, not borosilicate glass
60% Cold sucrose solution 60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C
AF16 C. briggsae or other experimental strain Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
Bunsen burner
Cling-wrap Fisherbrand 22-305654
Clinical centrifuge
Disposable razor blades Fisherbrand 12-640
Faraday cage Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger
Ink markers Sharpie or other brand for marking on plastic
Labeling tape Carolina 215620
M9 buffer 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl
N2 C. elegans strain Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
NGM plates with OP50 1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50
Paraffin film Bemis 13-374-10
Plastic cutting board
Pliers
Rotating vertical mixer BTLab SYSTEMS BT913 With 22 x 15 mL tube bar
Serological pipettor Corning 357469
Stereo Microscope Laxco S2103LS100
Tally counter ULINE H-7350
Thick NGM/agar plate media - 1 L See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar
Tweezers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peterka, R. J. Sensory integration for human balance control. Handbook of Clinical Neurology. 159, 27-42 (2018).
  2. Lacquaniti, F., et al. Multisensory Integration and Internal Models for Sensing Gravity Effects in Primates. BioMed Research International. 2014, 61584 (2014).
  3. Bostwick, M., et al. Antagonistic inhibitory circuits integrate visual and gravitactic behaviors. Current Biology. 30 (4), 600-609 (2020).
  4. Ntefidou, M., Richter, P., Streb, C., Lebert, M., Hader, D. -P. High light exposure leads to a sign change in gravitaxis of the flagellate Euglena gracilis. Journal of Gravitational Physiology. 9 (1), 277-278 (2002).
  5. Fedele, G., Green, E. W., Rosato, E., Kyriacou, C. P. An electromagnetic field disrupts negative geotaxis in Drosophila via a CRY-dependent pathway. Nature Communications. 5, 4391 (2014).
  6. Frézal, L., Félix, M. -A. C. elegans outside the Petri dish. eLife. 4, 05849 (2015).
  7. Lee, H., et al. a dispersal behavior of the nematode Caenorhabditis elegans, is regulated by IL2 neurons. Nature Neuroscience. 15 (1), 107-112 (2012).
  8. Okumura, E., Tanaka, R., Yoshiga, T. Negative gravitactic behavior of Caenorhabditis japonica dauer larvae. The Journal of Experimental Biology. 216, 1470-1474 (2013).
  9. Ackley, C., et al. Parallel mechanosensory systems are required for negative gravitaxis in C. elegans. bioRxiv. , (2022).
  10. Häder, D. -P., Hemmersbach, R. Gravitaxis in Euglena. Euglena: Biochemistry, Cell and Molecular Biology. Schwartzbach, S. D., Shigeoka, S. , Springer International Publishing. 237-266 (2017).
  11. Sun, Y., et al. TRPA channels distinguish gravity sensing from hearing in Johnston's organ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13606-13611 (2009).
  12. Chen, W. -L., Ko, H., Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Bau, H. H. Caenorhabditis elegans exhibits positive gravitaxis. BMC Biology. 19 (1), 186 (2021).
  13. Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: Identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).
  14. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
  15. Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. elegans chemotaxis assay. Journal of Visualized Experiments. (74), e50069 (2013).
  16. Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature Neuroscience. 11 (8), 916-922 (2008).
  17. Vidal-Gadea, A., et al. Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans. eLife. 4, 07493 (2015).
  18. Bainbridge, C., Schuler, A., Vidal-Gadea, A. G. Method for the assessment of neuromuscular integrity and burrowing choice in vermiform animals. Journal of Neuroscience Methods. 264, 40-46 (2016).
  19. Beron, C., et al. The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: a new assay for the study of neuromuscular disorders. Genes, Brain and Behavior. 14 (4), 357-368 (2015).
  20. Ow, M. C., Hall, S. E. A Method for obtaining large populations of synchronized Caenorhabditis elegans dauer larvae. Methods in Molecular Biology. , 209-219 (2015).
  21. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments. (47), e2293 (2011).
  22. Karp, X. Working with dauer larvae. WormBook. , 1-19 (2018).
  23. Dinno, A. Nonparametric pairwise multiple comparisons in independent groups using Dunn's test. The Stata Journal. 15 (1), 292-300 (2015).
  24. Gray, J. M., et al. Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue. Nature. 430 (6997), 317-322 (2004).
  25. Goodman, M. B., Sengupta, P. How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli. Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).
  26. Iliff, A. J., Xu, X. Z. S. C. elegans: a sensible model for sensory biology. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 347-350 (2020).
  27. Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).
  28. Iliff, A. J., et al. The nematode C. elegans senses airborne sound. Neuron. 109 (22), 3633-3646 (2021).
  29. Metaxakis, A., Petratou, D., Tavernarakis, N. Multimodal sensory processing in Caenorhabditis elegans. Open Biology. 8 (6), 180049 (2018).
  30. Wicks, S., Rankin, C. Integration of mechanosensory stimuli in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 15, 3 Pt 2 2434-2444 (1995).
  31. Chen, X., Chalfie, M. Modulation of C. elegans touch sensitivity is integrated at multiple levels. The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6522-6536 (2014).
  32. Stockand, J. D., Eaton, B. A. Stimulus discrimination by the polymodal sensory neuron. Commun. Integrative Biology. 6 (2), 23469 (2013).
  33. Mackowetzky, K., Yoon, K. H., Mackowetzky, E. J., Waskiewicz, A. J. Development and evolution of the vestibular apparatuses of the inner ear. Journal of Anatomy. 239 (4), 801-828 (2021).
  34. Eppsteiner, R. W., Smith, R. J. H. Genetic disorders of the vestibular system. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 19 (5), 397-402 (2011).
  35. Roman-Naranjo, P., Gallego-Martinez, A., Lopez Escamez, J. A. Genetics of vestibular syndromes. Current Opinion in Neurology. 31 (1), 105-110 (2018).
  36. Mei, C., et al. Genetics and the individualized therapy of vestibular disorders. Frontiers in Neurology. 12, 633207 (2021).
  37. Weghorst, F. P., Cramer, K. S. The evolution of hearing and balance. eLife. 8, 44567 (2019).

Tags

السلوك ، العدد 183 ،
فحص Gravitaxis على نطاق واسع من يرقات <em>Caenorhabditis</em> Dauer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ackley, C., Washiashi, L.,… More

Ackley, C., Washiashi, L., Krishnamurthy, R., Rothman, J. H. Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae. J. Vis. Exp. (183), e64062, doi:10.3791/64062 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter