Storstilet gravitaxis-analyse af Caenorhabditis Dauer-larver
Summary
Den nuværende protokol skitserer metoder til udførelse af et stort gravitaxisassay med Caenorhabditis dauer larver. Denne protokol giver mulighed for bedre påvisning af gravitakseadfærd sammenlignet med et pladebaseret assay.
Abstract
Tyngdekraftsfornemmelse er en vigtig og relativt undervurderet proces. At mærke tyngdekraften gør det muligt for dyr at navigere i deres omgivelser og letter bevægelse. Derudover er tyngdekraftsfornemmelse, der forekommer i pattedyrs indre øre, tæt forbundet med hørelse – således har forståelse af denne proces konsekvenser for auditiv og vestibulær forskning. Gravitaxis assays findes for nogle modelorganismer, herunder Drosophila. Enkelte orme er tidligere blevet analyseret for deres orienteringspræference, når de sætter sig i opløsning. Imidlertid er et pålideligt og robust assay for Caenorhabditis gravitaxis ikke blevet beskrevet. Den nuværende protokol skitserer en procedure til udførelse af gravitaxisassays, der kan bruges til at teste hundredvis af Caenorhabditis dauers ad gangen. Dette store langdistanceassay giver mulighed for detaljeret dataindsamling, der afslører fænotyper, der kan gå glip af på et standardpladebaseret assay. Dauer-bevægelse langs den lodrette akse sammenlignes med vandrette kontroller for at sikre, at retningsbestemt bias skyldes tyngdekraften. Gravitaktisk præference kan derefter sammenlignes mellem stammer eller eksperimentelle forhold. Denne metode kan bestemme molekylære, cellulære og miljømæssige krav til gravitaxis i orme.
Introduction
At mærke Jordens tyngdekraft er afgørende for mange organismers orientering, bevægelse, koordination og balance. Imidlertid er de molekylære mekanismer og neurokredsløb af tyngdekraftsfornemmelse dårligt forstået sammenlignet med andre sanser. Hos dyr interagerer tyngdekraftsfornemmelsen med og kan udkonkurreres af andre stimuli for at påvirke adfærd. Visuelle signaler, proprioceptiv feedback og vestibulær information kan integreres for at skabe en følelse af kropsbevidsthed i forhold til et dyrs omgivelser 1,2. Omvendt kan gravitaktisk præference ændres i nærværelse af andre stimuli 3,4,5. Derfor er gravitaktisk adfærd ideel til at studere tyngdekraftsfornemmelse og forstå nervesystemets komplekse sensoriske integration og beslutningstagning.
C. elegans er en særlig nyttig modelorganisme til undersøgelse af gravitakse på grund af dens polyphene livscyklus. Når de udsættes for stressfaktorer under udvikling, herunder varme, overbelægning eller mangel på mad, udvikler C. elegans larver sig til dauers, som er meget stressresistente6. Som dauers udfører orme karakteristisk adfærd, såsom nictation, hvor orme “står” på halen og vinker med hovedet, hvilket kan lette spredningen til bedre levesteder7. Gravitaxis assays af C. elegans og C. japonica tyder på, at dauer larver negativt gravitax, og at denne adfærd er lettere observeret hos dauers end hos voksne 8,9. Test af gravitaxis i andre Caenorhabditis-stammer kan afsløre naturlig variation i gravitatisk adfærd.
Mekanismer til tyngdekraftsfornemmelse er blevet karakteriseret i Euglena, Drosophila, Ciona og forskellige andre arter ved hjælp af gravitaxisassays 3,10,11. I mellemtiden gav gravitakseundersøgelser i Caenorhabditis oprindeligt blandede resultater. En undersøgelse af C. elegans orienteringspræference viste, at orme orienterer sig med hovedet nedad i opløsning, hvilket tyder på positiv gravitaktisk præference12. I mellemtiden, selvom C. japonica dauers tidligt blev identificeret som værende negativt gravitaktisk8, er denne adfærd først for nylig blevet beskrevet i C. elegans9. Der opstår flere udfordringer ved at udvikle et repræsentativt gravitaxis-assay i orme. Caenorhabditis stammer opretholdes på agar plader; Af denne grund bruger adfærdsmæssige assays typisk Agar-plader som en del af deres eksperimentelle design13,14,15. Det tidligste rapporterede gravitaxis-assay i Caenorhabditis blev udført ved at stå en plade på siden i en vinkel på 90° i forhold til den vandrette kontrolplade8. Imidlertid er gravitakseadfærd ikke altid robust under disse forhold. Mens voksne orme kan analyseres for orienteringspræference i løsning12, kan denne retningsbestemte præference også være kontekstafhængig, hvilket fører til forskellig adfærd, hvis ormene kravler snarere end svømning. Derudover er C. elegans følsom over for andre stimuli, herunder lys og elektromagnetiske felter16,17, som forstyrrer deres reaktioner på tyngdekraften9. Derfor er et opdateret gravitakseassay, der beskytter mod andre miljøvariabler, vigtigt for at dissekere mekanismerne i denne sensoriske proces.
I denne protokol beskrives et assay til observation af Caenorhabditis gravitaxis. Opsætningen af denne undersøgelse er delvist baseret på en metode udviklet til at studere neuromuskulær integritet18,19. Dauerlarver dyrkes og isoleres ved hjælp af standardprocedurer20. De injiceres derefter i kamre fremstillet af to 5 ml serologiske pipetter fyldt med agar. Disse kamre kan orienteres lodret eller vandret og placeres i et mørkt Faraday-bur i 12-24 timer for at beskytte mod lys og elektromagnetiske felter. Placeringen af hver orm i kamrene registreres og sammenlignes med de lodrette taxaer for en referencestamme som C. elegans N2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sammenligning med tidligere metoder
I modsætning til kemotaxis kan gravitaxis i Caenorhabditis ikke pålideligt observeres ved hjælp af et traditionelt agarpladeeksperimentelt design. En standard petriskål er 150 mm i diameter, hvilket resulterer i, at der kun er 75 mm til rådighed i begge retninger for dauers at demonstrere gravitaxispræference. Selvom C. elegans orienteringspræference kan analyseres i opløsning12, er denne metode lav gennemstrømning,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af forskningsbevillinger fra National Institutes of Health til JHR (#R01 5R01HD081266 og #R01GM141493). Nogle stammer blev leveret af CGC, som finansieres af NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Vi vil gerne anerkende Pradeep Joshi (UCSB) for hans redaktionelle input. Statistisk konsultation leveret af UCSB DATALAB.
Materials
| 1% Sodium Dodecyl Sulfate solution | From stock 10% (w/v) SDS in DI water | ||
| 15 mL Centrifuge tubes | Falcon | 14-959-53A | |
| 3 mm Hex key | Other similar sized metal tools may be used | ||
| 4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) – 1 L | Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL) | ||
| 5 mL Serological pipettes | Fisherbrand | S68228C | Polystyrene, not borosilicate glass |
| 60% Cold sucrose solution | 60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C | ||
| AF16 C. briggsae or other experimental strain | Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center) | ||
| Bunsen burner | |||
| Cling-wrap | Fisherbrand | 22-305654 | |
| Clinical centrifuge | |||
| Disposable razor blades | Fisherbrand | 12-640 | |
| Faraday cage | Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger | ||
| Ink markers | Sharpie or other brand for marking on plastic | ||
| Labeling tape | Carolina | 215620 | |
| M9 buffer | 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl | ||
| N2 C. elegans strain | Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center) | ||
| NGM plates with OP50 | 1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50 | ||
| Paraffin film | Bemis | 13-374-10 | |
| Plastic cutting board | |||
| Pliers | |||
| Rotating vertical mixer | BTLab SYSTEMS | BT913 | With 22 x 15 mL tube bar |
| Serological pipettor | Corning | 357469 | |
| Stereo Microscope | Laxco | S2103LS100 | |
| Tally counter | ULINE | H-7350 | |
| Thick NGM/agar plate media – 1 L | See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar | ||
| Tweezers |
References
- Peterka, R. J. Sensory integration for human balance control. Handbook of Clinical Neurology. 159, 27-42 (2018).
- Lacquaniti, F., et al. Multisensory Integration and Internal Models for Sensing Gravity Effects in Primates. BioMed Research International. 2014, 61584 (2014).
- Bostwick, M., et al. Antagonistic inhibitory circuits integrate visual and gravitactic behaviors. Current Biology. 30 (4), 600-609 (2020).
- Ntefidou, M., Richter, P., Streb, C., Lebert, M., Hader, D. -. P. High light exposure leads to a sign change in gravitaxis of the flagellate Euglena gracilis. Journal of Gravitational Physiology. 9 (1), 277-278 (2002).
- Fedele, G., Green, E. W., Rosato, E., Kyriacou, C. P. An electromagnetic field disrupts negative geotaxis in Drosophila via a CRY-dependent pathway. Nature Communications. 5, 4391 (2014).
- Frézal, L., Félix, M. -. A. C. elegans outside the Petri dish. eLife. 4, 05849 (2015).
- Lee, H., et al. a dispersal behavior of the nematode Caenorhabditis elegans, is regulated by IL2 neurons. Nature Neuroscience. 15 (1), 107-112 (2012).
- Okumura, E., Tanaka, R., Yoshiga, T. Negative gravitactic behavior of Caenorhabditis japonica dauer larvae. The Journal of Experimental Biology. 216, 1470-1474 (2013).
- Ackley, C., et al. Parallel mechanosensory systems are required for negative gravitaxis in C. elegans. bioRxiv. , (2022).
- Häder, D. -. P., Hemmersbach, R., Schwartzbach, S. D., Shigeoka, S. Gravitaxis in Euglena. Euglena: Biochemistry, Cell and Molecular Biology. , 237-266 (2017).
- Sun, Y., et al. TRPA channels distinguish gravity sensing from hearing in Johnston’s organ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13606-13611 (2009).
- Chen, W. -. L., Ko, H., Chuang, H. -. S., Raizen, D. M., Bau, H. H. Caenorhabditis elegans exhibits positive gravitaxis. BMC Biology. 19 (1), 186 (2021).
- Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: Identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
- Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. elegans chemotaxis assay. Journal of Visualized Experiments. (74), e50069 (2013).
- Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature Neuroscience. 11 (8), 916-922 (2008).
- Vidal-Gadea, A., et al. Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans. eLife. 4, 07493 (2015).
- Bainbridge, C., Schuler, A., Vidal-Gadea, A. G. Method for the assessment of neuromuscular integrity and burrowing choice in vermiform animals. Journal of Neuroscience Methods. 264, 40-46 (2016).
- Beron, C., et al. The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: a new assay for the study of neuromuscular disorders. Genes, Brain and Behavior. 14 (4), 357-368 (2015).
- Ow, M. C., Hall, S. E. A Method for obtaining large populations of synchronized Caenorhabditis elegans dauer larvae. Methods in Molecular Biology. , 209-219 (2015).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments. (47), e2293 (2011).
- Karp, X. Working with dauer larvae. WormBook. , 1-19 (2018).
- Dinno, A. Nonparametric pairwise multiple comparisons in independent groups using Dunn’s test. The Stata Journal. 15 (1), 292-300 (2015).
- Gray, J. M., et al. Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue. Nature. 430 (6997), 317-322 (2004).
- Goodman, M. B., Sengupta, P. How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli. Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).
- Iliff, A. J., Xu, X. Z. S. C. elegans: a sensible model for sensory biology. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 347-350 (2020).
- Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).
- Iliff, A. J., et al. The nematode C. elegans senses airborne sound. Neuron. 109 (22), 3633-3646 (2021).
- Metaxakis, A., Petratou, D., Tavernarakis, N. Multimodal sensory processing in Caenorhabditis elegans. Open Biology. 8 (6), 180049 (2018).
- Wicks, S., Rankin, C. Integration of mechanosensory stimuli in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 15, 2434-2444 (1995).
- Chen, X., Chalfie, M. Modulation of C. elegans touch sensitivity is integrated at multiple levels. The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6522-6536 (2014).
- Stockand, J. D., Eaton, B. A. Stimulus discrimination by the polymodal sensory neuron. Commun. Integrative Biology. 6 (2), 23469 (2013).
- Mackowetzky, K., Yoon, K. H., Mackowetzky, E. J., Waskiewicz, A. J. Development and evolution of the vestibular apparatuses of the inner ear. Journal of Anatomy. 239 (4), 801-828 (2021).
- Eppsteiner, R. W., Smith, R. J. H. Genetic disorders of the vestibular system. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 19 (5), 397-402 (2011).
- Roman-Naranjo, P., Gallego-Martinez, A., Lopez Escamez, J. A. Genetics of vestibular syndromes. Current Opinion in Neurology. 31 (1), 105-110 (2018).
- Mei, C., et al. Genetics and the individualized therapy of vestibular disorders. Frontiers in Neurology. 12, 633207 (2021).
- Weghorst, F. P., Cramer, K. S. The evolution of hearing and balance. eLife. 8, 44567 (2019).
